徐 珺，袁國林，呂婷婷，田小龍，黃 瑩

(襄陽市中心醫(yī)院，湖北襄陽441021)

目前，急性白血病(AL)的治療手段主要是化療和干細(xì)胞移植。隨著醫(yī)學(xué)科技迅速發(fā)展，雖然一定程度上提高了急性髓細(xì)胞白血病(AML)的緩解率，但由于微小殘留白血病(MRD)的存在，復(fù)發(fā)仍是影響患者無病生存的重要因素，因此，最大限度地殺滅殘留腫瘤細(xì)胞是防止復(fù)發(fā)的關(guān)鍵。樹突狀細(xì)胞(DC)免疫治療是其主要的方法，也是目前細(xì)胞免疫治療的熱點。為探討化療聯(lián)合DC回輸治療AML的臨床療效，我們進(jìn)行了相關(guān)研究?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2009年11月～2011年11月我院收治的AML患者21例，男11例、女10例，年齡21～70歲、中位年齡42歲，均符合張之南主編的《血液病學(xué)》中的 AML診斷標(biāo)準(zhǔn)［1］，M1 3例、M2 15例、M4 2例、M5 1例;均為化療后獲得細(xì)胞形態(tài)學(xué)完全緩解者。將患者隨機(jī)分為對照組10例，觀察組11例，兩組臨床資料有可比性。

1.2 方法

1.2.1 DC制備及鑒定 觀察組簽署知情同意書后，用血細(xì)胞分離機(jī)采集其外周血單個核細(xì)胞，經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液離心獲得單個核細(xì)胞，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2 h后洗去非貼壁細(xì)胞，將獲得單個核細(xì)胞中的貼壁細(xì)胞調(diào)整密度為5×106/mL進(jìn)行培養(yǎng)。加入粒單細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)1 000 U/mL、白介素 4(IL-4)500 U/mL、TNF-α 500 U/mL，培養(yǎng)單個核細(xì)胞分化為成熟DC。培養(yǎng)10 d后，收集懸浮的DC，在光鏡下觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測DC表型。取培養(yǎng)的DC行免疫治療。

1.2.2 治療方法 兩組均行常規(guī)化療，方案如下:①MA方案:米托蒽醌10 mg靜滴，第1～3天;阿糖胞苷(AraC)0.1 g靜滴，12 h一次，第1～7天。②DA方案:柔紅霉素40 mg靜滴，第1～3天;AraC 0.1 g靜滴，12 h一次，第1 ～7 天;或 AraC 1.0 g靜滴，12 h一次，第1～3天。③AA方案:阿克拉霉素40 mg靜滴，第1～3天;AraC 0.1 g靜滴，12 h一次，第1～7天。④HA方案:高山尖杉酯堿4 mg靜滴，第1～3天;AraC 0.1 g靜滴，12 h一次，第1～7天。⑤CAG方案:阿霉素10 mg靜滴，第1～4天;AraC 0.15 mg靜滴，第1～14天。在常規(guī)化療基礎(chǔ)上，觀察組在患者雙頸部、腋下、腹股溝淋巴結(jié)區(qū)6部位行DC 106個/次皮下注射，2 d一次，6次為一療程，間歇2個月后治療第2個療程。

1.2.3 評價方法 依照張之南主編的《血液病學(xué)》中的療效評價標(biāo)準(zhǔn)，療效指標(biāo)包括持續(xù)緩解率、復(fù)發(fā)率、中位生存時間。采用流式細(xì)胞儀檢測MRD細(xì)胞。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS17.0統(tǒng)計軟件，計量數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較用t檢驗;計數(shù)資料用百分比表示，組間比較用χ2檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DC形態(tài) 在倒置顯微鏡下，成熟DC貼壁生長，細(xì)胞體積增大，大小不等。培養(yǎng)初可見多數(shù)圓形貼壁細(xì)胞，加入GM-CSF、IL-4 48 h后，懸浮細(xì)胞增多;72 h后大量細(xì)胞集落，細(xì)胞數(shù)增多，體積增大，細(xì)胞表面伸出毛刺樣突起;第5天多數(shù)細(xì)胞重新貼壁;第6天懸浮細(xì)胞增多，細(xì)胞聚集，表面突起增多;加入TNF-α后第7～8天集落分散，細(xì)胞懸浮生長，分布較均勻，大小為成熟單核細(xì)胞的1.0～1.5倍，可見典型的樹枝樣突起。電鏡下見細(xì)胞表面大量褶皺和粗細(xì)不等的樹枝樣突起;透射電鏡下見細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，表面伸出多級突起，細(xì)胞核清晰，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體豐富，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(dá)，可見溶酶體。

2.2 DC表型鑒定 體外培養(yǎng)10 d后的DC表型為CD83+(67±4)%，HLA-DR+(75±6)%，CD11c(62±8)%，提示DC成熟。

2.3 兩組療效比較 觀察組11例共接受DC治療44次，其中1例8次、2例6次、8例3次。DC治療后，持續(xù)緩解7例(64%)、復(fù)發(fā)4例(36%)，中位生存時間18個月。對照組10例治療6個療程后，持續(xù)緩解2例(20%)、復(fù)發(fā)8例(80%)，中位生存時間9個月。兩組持續(xù)緩解率、復(fù)發(fā)率及中位生存時間比較P均＜0.05。

2.4 兩組MRD細(xì)胞比較 觀察組治療后MRD細(xì)胞＜10-4個，對照組 MRD細(xì)胞10-2～10-4個，兩組比較 P ＜0.05。

2.5 不良反應(yīng) 觀察組皮下注射DC順利，無反應(yīng)，除3例輕微發(fā)熱(體溫37.8℃，自行降至正常)、2例全身疼痛(對癥處理后2 d緩解)外，未見其他不良反應(yīng)。

3 討論

自20世紀(jì)60年代以來，隨著抗腫瘤新藥的應(yīng)用，明顯改善了AL患者的近、遠(yuǎn)期療效。但經(jīng)化療后到臨床及血液學(xué)完全緩解，體內(nèi)仍有106～108個MRD細(xì)胞，其成為白血病緩解期短、復(fù)發(fā)快的主要原因。研究發(fā)現(xiàn)［2］，在完全緩解的AL患者中，80%因MRD復(fù)發(fā)影響長期生存。因此，化療后MRD細(xì)胞是復(fù)發(fā)的主要根源，治療MRD成為降低復(fù)發(fā)亟待解決的難題。近年研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞免疫治療在消除MRD細(xì)胞、降低復(fù)發(fā)率、提高患者總生存率方面具有重要地位。

研究發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤患者免疫力低下，缺乏強(qiáng)有力的抗腫瘤免疫應(yīng)答，腫瘤抗原不能有效地提呈給淋巴細(xì)胞，是造成腫瘤細(xì)胞逃逸、增生活躍的原因［3］。DC是目前公認(rèn)的體內(nèi)功能最強(qiáng)大的專職性抗原提呈細(xì)胞，其能激活靜息型T細(xì)胞，主要參與細(xì)胞免疫及T細(xì)胞依賴性體液免疫反應(yīng)，在抗白血病細(xì)胞免疫應(yīng)答中起重要作用。來源于外周血單核細(xì)胞的DC稱為mDC，主要表達(dá)CD33、HLA-DR和CD11c;來源于漿細(xì)胞樣的DC稱為pDC，主要表達(dá)HLA-DR和 CD123。研究表明，mDC通過合成和分泌IL-12促使靜息Th細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，引發(fā)Th1反應(yīng)，啟動Th1細(xì)胞分泌IL-12，進(jìn)一步促進(jìn)Th1細(xì)胞分泌干擾素γ，以增強(qiáng)細(xì)胞毒T細(xì)胞的功能，在腫瘤免疫效應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用［4］。研究發(fā)現(xiàn)，完全緩解的AML患者存在DC功能低下。國內(nèi)外學(xué)者對AML患者骨髓中DC亞群的定量分析顯示，其mDC功能和數(shù)量降低［5～8］。AL的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體免疫功能失調(diào)密切相關(guān)，免疫系統(tǒng)無法識別和清除惡變和突變的細(xì)胞，致使腫瘤細(xì)胞逃逸機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和清除;另外，化療無法及時清除惡性腫瘤綜合治療后的MRD細(xì)胞，最終需動員機(jī)體的免疫功能方可達(dá)到其作用［9］。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)［10］，完全緩解 AML 患者行 G-CSF、GM-CSF 治療后，其DC活性升高，促淋巴細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)，且偏向mDC生長。本研究顯示，觀察組用G-CSF、GM-CS治療后，DC高表達(dá) CD83、HLA-DR和CD11c，主要為mDC細(xì)胞;與對照組比較，其持續(xù)緩解率高、中位生存時間長、復(fù)發(fā)率低。

研究表明，MRD能早期判斷患者體內(nèi)的殘留白血病細(xì)胞，預(yù)測其復(fù)發(fā)率，早于臨床預(yù)測復(fù)發(fā)3～6個月［2］。本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組行DC治療后的MRD細(xì)胞比率明顯低于化療后，且其MRD細(xì)胞＜10-4個的比率明顯高于對照組，說明DC治療可明顯清除MRD細(xì)胞。提示DC治療具有抗腫瘤細(xì)胞作用，可在一定程度上減少疾病的復(fù)發(fā)。本研究結(jié)果與國內(nèi)外相關(guān)報道一致［11～13］。

綜上所述，DC治療能明顯清除完全緩解AML患者的殘留白血病細(xì)胞，預(yù)防復(fù)發(fā)，值得臨床推廣應(yīng)用。

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