李光明，李能蓮，張嶺漪，王 亮，趙 睿

（1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院，甘肅 蘭州 730030；2.甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000）

組蛋白去乙?；?在胃癌中的表達(dá)及意義

李光明1，李能蓮2，張嶺漪1，王 亮1，趙 睿1

（1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院，甘肅 蘭州 730030；2.甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000）

目的 了解組蛋白去乙酰化酶6（HDAC6）在胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義。方法 采用組織芯片與免疫組織化學(xué)SP法檢測75例胃癌組織、15例癌旁正常組織和18例中-重度異型增生胃黏膜組織中HDAC6的表達(dá)情況，并分析其表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果 HDAC6在胃癌組織中的陽性表達(dá)率（52.0%）顯著高于正常（0.0%）或中-重度異型增生組織（22.2%），差異具有顯著性（P<0.05）；并且HDAC6在胃癌組織中的陽性表達(dá)率與腫瘤的浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均具有相關(guān)性（P<0.05）。結(jié)論 HDAC6在胃癌組織中過表達(dá)，可能與胃癌的發(fā)生發(fā)展以及浸潤和轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。

組蛋白去乙?；?；胃癌；免疫組織化學(xué)

腫瘤的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，近十余年來組蛋白去乙?；福╤istone deacetylases，HDACs）在腫瘤發(fā)生中的作用成為研究熱點(diǎn)。目前的研究多集中在Ⅰ類HDACs，認(rèn)為其主要通過使核心組蛋白去乙酰化，導(dǎo)致染色質(zhì)的空間構(gòu)象由疏松型轉(zhuǎn)為緊密型，從而引起某些腫瘤抑制基因轉(zhuǎn)錄抑制。研究[1~3]表明，組蛋白去乙酰化酶6（HDAC6）與肺癌、乳腺癌和口腔鱗癌等實(shí)體瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。但有關(guān)HDAC6與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，目前文獻(xiàn)報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)利用免疫組織化學(xué)法分別檢測胃癌組織、癌旁正常組織和中-重度異型增生的胃黏膜組織中HDAC6的表達(dá)水平，并分析其與胃癌各臨床病理特征之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料

選取2012年10月至2013年10月蘭州大學(xué)第二醫(yī)院收治的術(shù)前未經(jīng)過放、化療的胃癌手術(shù)切除石蠟標(biāo)本75例，正常對(duì)照標(biāo)本15例（距癌組織5 cm以上），均為同批次手術(shù)的正常胃組織標(biāo)本；中-重度異型增生18例，均為同年胃鏡活檢的組織。75例胃癌病例中，男性42例，女性33例；年齡31～76歲，平均55歲，≥55歲者45例，<55歲者30例；組織學(xué)分類：高分化腺癌16例，中分化腺癌26例，低分化腺癌33例（包括黏液腺癌7例，黏液細(xì)胞癌1例）；癌組織突破漿膜層21例，未突破漿膜層54例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移46例。

1.2 方法

1.2.1 組織芯片的制備 先制備模板蠟塊，在模板上用組織陳列儀打出直徑為2 mm的孔，然后鏡下觀察病理HE切片，對(duì)照相應(yīng)蠟塊選取典型腫瘤組織區(qū)域。在此區(qū)域獲取2 mm的柱形組織，置于模板蠟塊已打好的孔內(nèi)，按號(hào)碼順序排列，表面壓平，做二次包埋。常規(guī)石蠟切面，厚4 μm，進(jìn)行免疫組化染色。

1.2.2 免疫組化染色 試劑采用鼠抗人單克隆抗體HDAC6（北京中杉公司），工作濃度為1∶100，SP9000通用型試劑盒和DAB顯色劑（北京中杉公司）。具體操作按說明書染色步驟進(jìn)行?？乖迯?fù)用微波修復(fù)。用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定

免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果：光鏡下HDAC6表達(dá)主要定位于腫瘤細(xì)胞漿，以黃色、棕色、棕褐色顆粒為陽性表達(dá)。采用IP（Intensity Percentages）評(píng)分方法，綜合染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)兩項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行判斷。具體方法：（1）染色強(qiáng)度記分：細(xì)胞質(zhì)無染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；（2）陽性細(xì)胞數(shù)記分：0分為無陽性細(xì)胞，1分為陽性細(xì)胞≤10%，2分為11%<陽性細(xì)胞<50%，3分為51%<陽性細(xì)胞<75%，4分為陽性細(xì)胞＞75%。陽性強(qiáng)度為兩項(xiàng)記分之和：0分者為陰性（-），1～2分者為弱陽性（+），3～5分者為中等強(qiáng)度陽性（++），6～7分者為強(qiáng)陽性（+++）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有資料比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 HDAC6的表達(dá)

胃癌組織中HDAC6主要表達(dá)于癌細(xì)胞胞漿（見圖1），其陽性細(xì)胞主要出現(xiàn)于腫瘤壞死區(qū)的周圍以及浸潤腫瘤的邊緣（見圖1）。75例胃癌標(biāo)本中，有39例HDAC6陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率為52.0%；腫瘤組織內(nèi)浸潤的淋巴細(xì)胞無著色。15例正常胃黏膜組織無HDAC6表達(dá)。18例中-重度異型增生胃黏膜組織中，有4例陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率為22.2%，主要在增生腺體腺細(xì)胞胞漿（見圖2）。HDAC6在胃癌組織和正常胃黏膜組織中的表達(dá)差異有顯著性（χ2=13.765，P=0.000）；HDAC6在胃癌組織和中-重度異型增生胃黏膜組織中的表達(dá)差異有顯著性（χ2= 5.178，P=0.025）。

2.2 HDAC6的表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

HDAC6的表達(dá)與腫瘤的浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均相關(guān)，有顯著性差異（P＜0.05），與患者年齡、性別、腫瘤分化程度之間無顯著性差異（P＞0.05），見表1。

圖1 HDAC6在胃癌組織中的表達(dá)（免疫組化SP法×400）

圖2 HDAC6在癌旁組織中的表達(dá)（免疫組化SP法×200）

表1 HDAC6的表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討論

3.1 HDAC6在胃癌組織中高表達(dá)可促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展

在HDACs家族中，HDAC6是一個(gè)比較獨(dú)特的組蛋白去乙?；?，具有核質(zhì)穿梭功能，主要定位于細(xì)胞質(zhì)[4]，分子量約為131.4 kDa[5]。研究表明，選擇性HDAC6抑制劑與抗腫瘤藥物紫杉醇聯(lián)合作用，可協(xié)同抑制雌激素受體陽性乳腺癌細(xì)胞MCF-7的生長[6]。另有文獻(xiàn)報(bào)道，HDAC6在肺癌組織[1]和乳腺癌組織[2]中的表達(dá)水平與腫瘤的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，在口腔鱗癌組織[3]中HDAC6呈上調(diào)表達(dá)并且與腫瘤的侵襲性明顯相關(guān)。研究者還發(fā)現(xiàn)[7]，HDAC6過表達(dá)的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（NIH3T3）運(yùn)動(dòng)性比對(duì)照細(xì)胞強(qiáng)。HDAC6與胃癌發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系，目前文獻(xiàn)報(bào)道較少。我們的研究表明，胃癌組織中HDAC6的表達(dá)水平顯著高于正?；蛑?重度異型增生的胃黏膜組織，且穿透漿膜層的胃癌組織中HDAC6的表達(dá)水平也高于未穿透者，同時(shí)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者HDAC6的表達(dá)水平明顯高于無轉(zhuǎn)移者。

3.2 HDAC6促進(jìn)胃癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制可能與其調(diào)節(jié)HIF-1а、HSP90、細(xì)胞肌動(dòng)蛋白及IIp45的生物學(xué)功能有關(guān)

HDAC6促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移的機(jī)制目前尚不明了。研究表明[8~11]，HDAC6可增強(qiáng)缺氧誘導(dǎo)因子-1а（hypoxia-inducible factor1-а，HIF-1а）和熱休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）的生物學(xué)功能，可能是二者的上游調(diào)節(jié)因子。已知HIF-1а和HSP90可促進(jìn)多種腫瘤（包括胃癌）的發(fā)生發(fā)展，是重要的致瘤因子。還有研究發(fā)現(xiàn)，HDAC6可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白的功能進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞遷移[12]。另外，新發(fā)現(xiàn)的IIp45（aka MIIP）基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物抑制細(xì)胞移動(dòng)的功能可通過抑制HDAC6實(shí)現(xiàn)[13]。據(jù)此可以推測，本實(shí)驗(yàn)中HDAC6與胃癌發(fā)生發(fā)展以及浸潤和轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)，其部分機(jī)制可能是通過增強(qiáng)HIF-1а、HSP90以及細(xì)胞肌動(dòng)蛋白的生物學(xué)功能和抑制IIp45生物學(xué)功能實(shí)現(xiàn)的。

[1]Osada H，Tatematsu Y，Saito H，et al.Reduced expression of class II histone deacetylase genes is associated with poor prognosis in lung cancer patients[J].Int J Cancer，2004，112（1）：26-32.

[2]Zhang Z，Yamashita H，Toyama T，et al.HDAC6 Expression Is Correlated with Better Survival in Breast Cancer[J].Clinical Cancer Research，2004（10）：6962-6968.

[3]Sakuma T，Uzawa K，Onda T，et al.Aberrant expression of histone deacetylase 6 in oral squamous cell carcinoma[J].Int J Oncol，2006，29（1）：117-124.

[4]DE Ruijter A J，Van Gennip A H，Caron H N，et al.Histone deacetylases（HDACs）：characterization of the classical HDAC family[J].Biochem J，2003（370）：737-749.

[5]Voelter-Mahlknecht S，Mahlknecht U.Cloning and structural characterization of the human histone deacetylase 6 gene[J].Int J Mol Med，2003，12（1）：87-93.

[6]Itoh Y，Suzuki T，Kouketsu A，et al.Design，synthesis，structure-selectivity relationship，and effect on human cancer cells of a novel series of histone deacetylase 6-selective inhibitors[J].J Med Chem，2007，50（22）：5425-5438.

[7]Hubber C，Guardiola A，Shao R，et al.HDAC6 is a microtubule-associated deacetylase[J].Nature，2002，417（6887）：455-458.

[8]Kong X，Lin Z，Liang D，et al.Histone Deacetylase Inhibitors Induce VHL and Ubiquitin-Independent Proteasomal Degradation of Hypoxia-Inducible Factor-1а[J].MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY，2006，26（6）：2019-2028.

[9]Qian D Z，Kachhap S K，Collis S J，et al.Class II Histone Deacetylases Are Associated with VHL-Independent Regulation of Hypoxia-Inducible Factor-1a[J].Cancer Res，2006，66（17）：8814-8821.

[10]Aoyagi S，Archer T K.Modulating molecular chaperone Hsp90 functions through reversible acetylation[J].TRENDS in Cell Biology，2005，15（11）：565-567.

[11]Bali P，Pranpat M，Bradner J，et al.Inhibition of Histone Deacetylase 6 Acetylates and Disrupts the Chaperone Function of Heat Shock Protein 90[J].THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，2005，280（29）：26729-26734.

[12]Close P，Creppe C，Gillard M，et al.The emerging role of lysine acetylation of non-nuclear Proteins[J].Cell Mol Life Sci，2010（67）：1255-1264.

[13]Ying Wu，Sonya W，Song，et al.IIp45 Inhibits Cell Migration through Inhibition of HDAC6[J].THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，2010，285（6）：3554-3560.

R735.2

B

1671-1246（2014）13-0136-03