毛建華 羅慶豐 劉志禮 王 恒 朱糧博 龍新華 周榮平

PI3K/AKT信號通路在腫瘤細胞增殖凋亡及藥物耐受中起著非常重要的作用［1-2］，但是其化學(xué)抑制劑LY294002對成骨骨肉瘤細胞遷徙侵襲的影響尚未見報道，本研究以成骨肉瘤細胞系U2-OS細胞為研究對象，給予 LY294002干預(yù)，MTT，wound healing和 Transwell invasion實驗檢測細胞增殖、遷徙和侵襲能力，探討LY294002對成骨肉瘤細胞侵襲遷徙的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與細胞

骨肉瘤細胞株U2-OS購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所，并由南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)中心凍存。F12型培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司;胎牛血清(FBS)購自杭州四季青生物工程有限公司;PBS購自北京百靈威化學(xué)試劑有限公司;胰蛋白酶凍干粉(含EDTA)購自美國Sigma公司;DMSO、MTT購自美國Sigma公司，Transwell趨化板購于 Costar公司(8.0 μm Pore Size)。LY294002購于Sigma。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人骨肉瘤細胞株U2-OS細胞貼壁生長于含10%FBS的F12型培養(yǎng)液中，其中青霉素100 U/ml、鏈霉素 100 mg/ml，于 37℃、5%CO2的飽和濕度孵育箱中培養(yǎng)。待細胞長至約80%滿后，棄去舊培養(yǎng)基，以適量胰酶(0.25%胰蛋白酶:0.02%EDTA=1∶1)消化細胞，棄去消化液并加入適量培養(yǎng)基洗滌，再以適量培養(yǎng)基反復(fù)輕輕吹打后制備細胞懸液，計數(shù)，以1∶4的比例傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細胞增殖實驗 取對數(shù)生長期細胞進行實驗，調(diào)整細胞數(shù)為4×105/L，接種于無菌96孔培養(yǎng)板，每孔200 μl，于37℃、5%CO2飽和濕度孵育箱中培養(yǎng)12 h。按加入藥物的不同分為2組。實驗組分別給予5、10、20、40、80、160 μM 的 LY294002(5 mg LY294002粉末溶于1 ml的DMSO中配成10 μM的母液，再取母液用培養(yǎng)基稀釋配成實驗組濃度);對照組給予DMSO(DMSO的濃度為0.1%)。每組的每個濃度下設(shè)6個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μl的噻唑藍(MTT 5 g/L)。孵育4 h后，吸棄各孔培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μl。微振蕩10 min后，于酶標(biāo)儀波長490 nm處測吸光度(A)值。以上各組實驗重復(fù)6次。細胞增殖抑制率(%)=(1－實驗組A值/對照組A值)×100% 。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測LY294002對U2-OS細胞凋亡的影響 取對數(shù)生長期細胞進行實驗，調(diào)整細胞濃度為1×106/ml，接種于直徑為6 cm的培養(yǎng)皿中，每皿250 μl，于 37 ℃、5%CO2飽和濕度孵育箱中培養(yǎng) 12 h。按加入藥物的不同分為2組。實驗組分別給予20、40、80 μM 的 LY294002(5 mg LY294002 粉末溶于 1 ml的DMSO中配成10 μM的母液，再取母液用培養(yǎng)基稀釋配成實驗組濃度);對照組給予DMSO(DMSO的濃度為 0.1%)。培養(yǎng) 24 h后，每孔加入 1 ml 0.25 g/L胰酶(不含 EDTA)，消化重懸，PBS洗滌2次后(1 500 轉(zhuǎn)/分離心 3 min)500 μl Binding Buffer重懸，并加入 5 μl Annexin V-FITC 和 5 μl Propidium Iodide混勻，室溫、避光反應(yīng) 5～15 min，應(yīng)用FAcs calibur流式細胞儀檢測(BD，USA)。以上各組實驗結(jié)果重復(fù)6次。

1.2.4 Wound healing遷徙實驗 對數(shù)生長期處于細胞傳代后第3～5天，取對數(shù)生長期細胞進行實驗;用胰酶消化細胞，含10 g/L BSA的無血清DMEM-F12培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細胞數(shù)5×105/ml，接種于6孔細胞培養(yǎng)板，給予不同濃度(0、40 μmol/L)的 LY294002作用細胞24 h后，用200 μl槍頭單層細胞表面在孔中劃一直線垂直于記號線。用PBS漂洗2次以去除劃下的懸浮細胞;加入無血清DMEM-F12培養(yǎng)液(內(nèi)含1%BSA)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，倒置顯微鏡下觀察劃痕中細胞遷徙情況并照相;Image J分析軟件進行遷徙距離測量，計算各組細胞遷徙率;不同時間重復(fù)實驗6次。

1.2.5 Transwell侵襲實驗 將凍存于 －80℃ 冰箱的BD matrigel基質(zhì)膠4℃靜置24 h，使之轉(zhuǎn)為液態(tài)。常規(guī)細胞培養(yǎng)后，終止培養(yǎng)，吸除血清讓細胞饑餓12～24 h。按 1∶7 比例稀釋 Matrigel，取 20 μl的 Matrigel，加入140 μl的F12型無血清培養(yǎng)液，充分稀釋混勻(冰浴操作)。在Transwell小室的多聚碳酸濾膜上預(yù)鋪 Matrigel基質(zhì)膠(約 60 μl/孔)，每孔加入 50 μl含10 g/L BSA(牛血清白蛋白)的無血清培養(yǎng)液，37℃放置3 h，室溫過夜干燥。常規(guī)消化離心細胞后，用配備好的10 g/L BSA(牛血清白蛋白)重懸，調(diào)整細胞密度至1×105個/ml。在Transwell小室的上室中，分別加入150 μl已用40μM LY294002處理的細胞懸液和用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞懸液，每孔下室加入500 μl含血清的培養(yǎng)基。將小室置于37℃ 、5%CO2孵育箱中24 h后用棉簽輕輕地刮除小室內(nèi)微孔膜邊緣的細胞，甲醇固定15 min，再用4 g/L的結(jié)晶紫染色30 min后取出Transwell小室，PBS淋洗2遍，再倒置顯微鏡下觀察細胞穿膜情況并拍照，Image J分析軟件計數(shù)。進行不同時間重復(fù)實驗6次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13.0處理系統(tǒng)進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，采用Independent Samples T Test分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LY294002抑制U2-OS細胞增殖

不同濃度LY294002作用U2-OS細胞24 h，能有效抑制U2-OS細胞增殖并呈劑量依賴性，IC50為47.96 μM，所以確定進一步的遷徙和侵襲實驗中采用LY294002的濃度為40 μM。

2.2 LY294002誘導(dǎo)U2-OS細胞凋亡

不同濃度LY294002作用U2-OS細胞24 h凋亡率隨著濃度的增高而提高，這提示LY294002能誘導(dǎo)U2-OS細胞凋亡并呈劑量依賴性。

2.3 LY294002對U2-OS體外遷徙的影響

wound healing分析結(jié)果顯示，經(jīng)40 μM LY294002作用24 h組平均細胞遷徙率為(37.97±2.49)%，未經(jīng)LY294002作用細胞組遷徙率為(83.78±2.84)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.4 LY294002對U2-OS體外侵襲的影響

40 μM LY294002處理細胞24 h穿膜細胞數(shù)平均為(36.1 ±5.0)個/視野，未經(jīng) LY294002 作用細胞平均穿膜細胞數(shù)為(89.1±6.4)個/視野，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)院意義(P ＜0.01)。

3 討論

骨肉瘤是1種高度惡性的骨腫瘤，其發(fā)病率在兒童及青少年的原發(fā)骨腫瘤中占據(jù)首位。雖然隨著新輔助化療藥物使用骨肉瘤患者5年生存率有了大幅度的提高［3-5］，但是近30年來無明顯進一步的提高，主要原因是早期發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移和獲得性耐藥［3，6］。新的抗骨肉瘤策略是亟待解決的熱點。由于PI3K/Akt信號通路在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的重要作用，因此研究PI3K/Akt信號通路對于探索新的腫瘤治療方法具有重要價值。

LY294002是1種廣泛應(yīng)用的PI3K/AKT信號通路抑制劑，可特異性 抑制PI3Kp110亞單位的催化活性，但因其對細胞具有一定毒性作用，目前還限于體外研究，尚未發(fā)展到臨床應(yīng)用。郭花等［7］研究發(fā)現(xiàn)LY294002除了能特異性抑制PI3K和p-Akt表達外，對HIF-1mRNA表達也有一定抑制作用。大量文獻報道，LY294002能有效的誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡而抑制增殖［8-9］。本研究發(fā)現(xiàn)，LY294002能顯著的抑制U2-OS細胞增殖，并且呈劑量依賴;40 μM的LY94002作用細胞24 h后細胞凋亡率顯著的高于未經(jīng)LY294002處理細胞，這提示LY294002能通過誘導(dǎo)U2-OS細胞凋亡而抑制其增殖。最近有研究［10-12］發(fā)現(xiàn)LY294002能抑制腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移。本研究中，我們采用40 μM的LY94002作用U2-OS細胞24 h后通過wound healing和Transwell invasion檢測細胞遷徙、侵襲能力，結(jié)果顯示經(jīng)LY94002處理的細胞組細胞遷徙率和穿膜細胞數(shù)顯著的低于未經(jīng) LY94002作用組，這提示LY94002能抑制U2-OS細胞體外遷徙侵襲。

總之，我們結(jié)果提示，LY94002能通過誘導(dǎo)U2-OS細胞凋亡而抑制其增殖，并且能抑制其遷徙侵襲，有望成為抗骨肉瘤治療的藥物。但是，由于體內(nèi)微環(huán)境對腫瘤增殖、侵襲轉(zhuǎn)移起著非常重要的作用，所以，還需大量的實驗來證實其能否具有抗骨肉瘤作用;另外，其生物安全性也還有待于進一步探討。

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