白艷玲，尚曉婭，趙豪賓，劉 歡，徐春蘭，牛衛(wèi)寧

（西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院，西北工業(yè)大學(xué)特殊環(huán)境生物物理學(xué)研究所，空間生物實驗?zāi)M技術(shù)國防重點學(xué)科實驗室，陜西西安 710072）

環(huán)境質(zhì)量問題和生態(tài)生活問題日益突出，如何增強人體自身免疫功能成為研究領(lǐng)域的熱點，多糖已被證實具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等生物活性，特別是能夠提高機體的免疫功能而對正常細(xì)胞沒有毒副作用而廣泛受到重視。絞股藍(lán)多糖、牡蠣多糖、地衣芽孢桿菌產(chǎn)生的胞外多糖等多種植物多糖、動物多糖和微生物多糖不僅提高小鼠的非特異性免疫，還提高小鼠的細(xì)胞免疫，具有顯著的免疫活性[1-4]。研究發(fā)現(xiàn)分子修飾對多糖生物活性有非常重要的影響，通過分子修飾可使原多糖活性提高，或產(chǎn)生新的活性。如黃精多糖的硫酸化、磷酸化、羧甲基化、乙?；突酋；揎椇蠡钚詸z測結(jié)果為：磷酸化多糖和硫酸化多糖對皰疹病毒具有顯著的抑制作用，表現(xiàn)出極強的抗病毒活性，磺?；嗵强共《拘Чc未改性的中性多糖相當(dāng)，乙?；嗵侵挥休p微的抗病毒活性，而羧甲基化多糖則幾乎沒有活性[5]。由此可見，官能團(tuán)的引入對多糖的生物活性影響較大。免疫功能作為生物活性中及其重要的一部分備受關(guān)注，免疫增強效應(yīng)將會極大的提高多糖的利用率。因此，采取適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，以求獲得免疫活性更好的多糖，不僅可以更好地研究多糖的構(gòu)效關(guān)系，而且也為新藥篩選提供結(jié)構(gòu)多樣的候選化合物。分子修飾主要包括化學(xué)修飾、生物修飾和物理修飾，目前最常用的修飾手段主要采用化學(xué)的方法引入其他基團(tuán)，改變多糖的結(jié)構(gòu)，從而提高其原來的生物活性，或者增加新的活性，包括硫酸酯化修飾、羧甲基化修飾、磷酸酯化修飾、硒化修飾、烷基化修飾、乙?；揎椀?。但是，有關(guān)多糖的分子修飾對多糖免疫活性的影響還未見綜述性文章報道。本文就多糖的分子修飾對其免疫活性的影響方面進(jìn)行了綜述。

1 化學(xué)修飾方法對多糖免疫活性的影響

1.1 硫酸化修飾對多糖免疫活性的影響

多糖的硫酸化修飾是多糖分子修飾中最為重要和常見的一種修飾方法。硫酸化修飾即是將多糖分子的羥基末端、羧基末端或者氨基末端用硫酸基團(tuán)取代，以便得到活性優(yōu)于原多糖分子的硫酸化多糖分子。其反應(yīng)其原理是，在路易斯堿溶液中由硫酸化試劑中的SO3H+取代多糖羥基中的H+，經(jīng)中和而得到多糖的硫酸鹽。目前最常用的硫酸酯化試劑是氯磺酸-吡啶復(fù)合物，因為其產(chǎn)率和取代度均較為理想，易于得到硫酸化樣品，但是由于氯磺酸本身具有強氧化性和刺激性，因此實際操作較為繁瑣，危險度高。此外常用的硫酸酯化試劑還有三氧化硫與吡啶或三乙胺或N，N-二甲基甲酰胺（DMF）的復(fù)合物，使用該硫酸酯化試劑進(jìn)行反應(yīng)時，操作簡單，安全度高，但是較氯磺酸-吡啶成本高。反應(yīng)過程常用到的溶劑有甲酰胺、DMF、二甲亞砜（DMSO）和吡啶等。

部分多糖經(jīng)硫酸化修飾后，其免疫活性顯著增強，主要體現(xiàn)在對脾淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的增殖、刺激細(xì)胞因子的分泌等方面。真姬菇多糖，中國柿子多糖和銀合歡種子多糖經(jīng)硫酸化修飾后，顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的分泌，并且增加了NO的釋放量[6-8]；金耳水果多糖經(jīng)硫酸化修飾后顯著促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖[9]；銀耳、黨參、黑木耳、麥冬等多糖經(jīng)硫酸化修飾后能顯著促進(jìn)雞外周血淋巴細(xì)胞的增殖，提高血清中的抗體滴度，同時提高雛雞細(xì)胞免疫和體液免疫的功能，且免疫功能的發(fā)揮受硫酸化取代度的影響[10-13]；龍須菜多糖經(jīng)硫酸化修飾后，顯著促進(jìn)免疫抑制小鼠溶血素和溶血空斑的形成[14]。由此可見硫酸化修飾對多糖免疫活性的增強有非常重要的作用，取代度大小同時也影響著免疫功能的發(fā)揮。該方法可作為提高多糖免疫活性的有效途徑之一。

1.2 羧甲基化修飾對多糖免疫活性的影響

羧甲基化修飾也是多糖結(jié)構(gòu)修飾的常用方法之一。羧甲基化修飾即多糖分子的羥基末端、羧基末端或氨基末端被羧基取代。羧甲基化反應(yīng)原理分為兩步：首先在堿性條件下多糖結(jié)構(gòu)上的羥基與氫氧化鈉反應(yīng)生成醇鹽，之后該醇鹽與氯乙酸發(fā)生雙分子親核取代反應(yīng)，生成所需的羧甲基化衍生物。通過控制氫氧化鈉與氯乙酸的量，可最終得到不同取代度的羧甲基化多糖樣品。

羧甲基基團(tuán)的引入能引起多糖溶解性的增加，有利于多糖發(fā)揮各類生物功能[15]。目前已研究發(fā)現(xiàn)，羧甲基化修飾對于部分多糖免疫活性的改變有極其重要的影響，主要通過增強機體的抗氧化酶活、促進(jìn)淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌等途徑發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)功能，并且證明其免疫活性受羧甲基取代度的影響。給養(yǎng)殖大黃魚分別注射酵母beta-1，3-葡聚糖和不同取代度的羧甲基葡聚糖后發(fā)現(xiàn)，羧甲基化改性后的葡聚糖顯著地提高大黃魚血清及血細(xì)胞中的SOD活力，增強了大黃魚的免疫活性[16]。將黃芪多糖進(jìn)行羧甲基化改性后，其促生長和增強免疫活性均非常明顯[17]。桑黃多糖進(jìn)行羧甲基化修飾后，細(xì)胞毒性增強，間接引起多糖免疫活性的提高[18]。

除了動物多糖和植物多糖，研究發(fā)現(xiàn)分子修飾對微生物多糖的免疫活性也有一定的影響。Dergunova等[19]從曲霉中提取制備得到新型的羧甲基甲殼素-葡萄糖（CM-CG），并與之前酵母中提取并制備的羧甲基化葡聚糖（CMG）進(jìn)行比較，結(jié)果顯示兩種多糖均能引起小鼠白血球、骨髓中單核細(xì)胞、肝臟巨噬細(xì)胞及二次溶酶體含量的增多，表明羧甲基化改性可以提高葡聚糖的免疫活性。雙歧桿菌胞外多糖進(jìn)行羧甲基化改性后，發(fā)現(xiàn)其對細(xì)胞因子IL-2、IFNγ的促進(jìn)作用高于未改性多糖，表現(xiàn)出了更好的體外免疫活性[20]。金磊等[21]制備出不同取代度的羧甲基化海洋真菌多糖，Griess法測定其誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌NO的活性，并通過流式細(xì)胞儀檢測其結(jié)合巨噬細(xì)胞的能力，結(jié)果表明，低取代度的羧甲基化多糖能提高原多糖的免疫活性，而高取代的多糖在一定程度上能抑制其免疫作用。證明羧甲基取代度對免疫功能的發(fā)揮將產(chǎn)生非常大的影響。由此可知，羧甲基基團(tuán)的引入對于多糖免疫活性的改善有重大的意義，可作為多糖免疫活性修飾的備選方法。

1.3 磷酸化修飾對多糖免疫活性的影響

如果多糖支鏈上的羥基被磷酸基團(tuán)所取代，則此方法為磷酸化修飾。多糖磷酸化的常用試劑有：五氧化二磷、三氯氧磷、磷酸鹽等，反應(yīng)過程需要用強酸做催化劑，因此通常會導(dǎo)致多糖降解，使反應(yīng)后的體系成分復(fù)雜，故限制了磷酸化的應(yīng)用但并未影響磷酸基團(tuán)引入多糖所帶來的免疫活性優(yōu)勢。研究發(fā)現(xiàn)，無論是相對較少的天然磷酸化多糖，還是經(jīng)過化學(xué)方法改性后的磷酸化多糖，均具有極高的藥用價值，是多糖構(gòu)效關(guān)系研究中不可或缺的一部分[22-23]。從蛋白核小球藻中分離得到的半乳聚糖磷酸酯基團(tuán)被證明具有很好的巨噬細(xì)胞刺激作用[24]。經(jīng)磷酸化修飾后的葡聚糖可顯著促進(jìn)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的增殖，增強B淋巴細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞表面CD86和CD69的表達(dá)，同時促進(jìn)IL-10的分泌[25]。從德氏乳桿菌保加利亞亞種OLL1073R-1中分離得到的胞外磷酸化多糖（APS）與分離得到的中性多糖（NPS）相比，可以明顯刺激小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖，激活巨噬細(xì)胞，同時抑制S180和P388腫瘤細(xì)胞的增殖；將APS中的磷酸根基團(tuán)水解清除之后，其免疫活性明顯下降甚至完全消失，表明磷酸根基團(tuán)對活性的發(fā)揮起著關(guān)鍵作用[26-27]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，APS較NPS能夠激活小鼠巨噬細(xì)胞樣J774.1細(xì)胞，顯著促進(jìn)IL-1α因子的基因表達(dá)，同時對IL-6、IL-10、IL-12p40 和TNF-α的表達(dá)也起到了不同程度的促進(jìn)作用[28]。綜上，多糖的磷酸化修飾對于多糖免疫活性的提高有非常重要的影響，磷酸化試劑還需進(jìn)一步的改善和優(yōu)化。

1.4 硒化修飾對多糖免疫活性的影響

機體缺硒元素后，T淋巴細(xì)胞特異性增殖作用和細(xì)胞毒效應(yīng)減低，巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞活性明顯降低，抗體生成減少。補充硒，或在體外實驗中加入一定量的硒，均可促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)，誘導(dǎo)或促進(jìn)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生干擾素、IL-2等可溶性免疫活性介質(zhì)[29]。硒化修飾多糖其化學(xué)結(jié)構(gòu)是硒元素與多糖中的單糖上兩個順式相鄰羥基形成五元環(huán)的亞硒酸酯，通過硒化修飾可將多糖與硒元素有機結(jié)合成硒多糖，有利于充分發(fā)揮硒元素和多糖本身的生物活性，提高了硒作為微量元素的利用率。硒化修飾通常以亞硒酸及其鹽為修飾劑，在一定條件下與多糖發(fā)生酯化反應(yīng)生成亞硒酸脂多糖。硒化修飾后的多糖其免疫功能也逐步受到重視。Qin等[30-31]用正交實驗制備得到三水平的9個硒化修飾當(dāng)歸多糖，體外實驗研究發(fā)現(xiàn)9個硒化當(dāng)歸多糖均能促進(jìn)雞外周血淋巴細(xì)胞的增殖，具有顯著的免疫活性，找出最佳免疫活性的硒化多糖進(jìn)行體內(nèi)實驗的研究，對雞外周血淋巴細(xì)胞增殖、血清中抗體滴度、白介素和干擾素等水平進(jìn)行評價，發(fā)現(xiàn)三個硒化修飾多糖組在大多數(shù)時間點的抗體效價顯著高于免疫對照組，在部分時間點顯著高于未修飾的當(dāng)歸多糖組。有免疫缺陷的小鼠口服硒化多糖后，血清半數(shù)溶血值顯著增高，使免疫低下的小鼠體液免疫功能正?；蚪咏Ｋ絒32-33]。在臨床上，化、放療患者口服硒化多糖后血清免疫球蛋白IgG、IgA含量顯著升高，巨噬細(xì)胞吞噬功能增強，表明硒化多糖能夠明顯提高化、放療患者及恢復(fù)期患者的免疫功能[34]。綜上表明，硒化修飾對于部分多糖免疫活性的提高非常有效。

1.5 其他化學(xué)修飾方法對多糖免疫活性的影響

其他化學(xué)修飾方法有：多糖的烷基化修飾、乙?；揎棥⒒酋；揎棥⒘u丙基修飾等[35-38]。烷基化修飾指在多糖主鏈的還原末端引入烷基、取代烷基或長鏈芳香醇，以此來獲得該多糖預(yù)期的生物活性；乙?；揎椫冈诙嗵堑闹ф溨幸胍阴；?；磺?；揎椉词嵌嗵侵ф溕系牧u基被磺酰基基團(tuán)取代，將磺?；攵嗵欠肿樱M(jìn)而發(fā)揮基團(tuán)的特殊生物功效。烷基化對于降低多糖的高粘度，提高多糖的低溶解度有很好的效果；引入乙酰基對于多糖長鏈的伸展、多糖羥基的暴露是非常有幫助的，而且水溶性會大大提高，溶解度的增加有利于其免疫活性的發(fā)揮，通過乙?；男缘母事毒厶?，競爭ELISA實驗證明其可以提高抗原活性，說明經(jīng)過乙酰化修飾后原甘露聚糖免疫調(diào)節(jié)活性明顯增強[39]。羥丙基化修飾提高了靈芝多糖的水溶性和抗氧化性，免疫活性受到影響[40]。這些化學(xué)修飾方法可改變多糖原有的生物活性，免疫活性也因此而改變?？勺鳛樘岣叨嗵敲庖呋钚允侄蔚膮⒖挤椒ㄖ弧?/p>

在實際研究的過程中，有時為了得到更有針對性的免疫效果，常常將以上化學(xué)修飾方法中的兩種或兩種以上結(jié)合使用，也可能得到免疫活性很好的多糖。將硫酸酯化多糖的C4位硫用硒取代制成的4-硒（代）硫酸酯多糖，能夠促進(jìn)淋巴母細(xì)胞的IL-2R表達(dá)，促進(jìn)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的數(shù)量，表明該產(chǎn)物能影響小鼠的免疫功能[41]。Chen等[42]從茯苓中提取制備得到（1→3）-β-D-葡聚糖（PCS3-II），并成功合成了其羧甲基化-硫酸化衍生物，記為CS-PCS3-II，研究發(fā)現(xiàn)CS-PCS3-II處理過的腫瘤細(xì)胞其病理組織學(xué)顯示有細(xì)胞壞死和凋亡，并且此衍生物具有比原葡聚糖更好的BALB/c小鼠腫瘤抑制率，推測其機制可能是硫酸根和羧甲基基團(tuán)的引入通過氫鍵和靜電力的作用提高了PCS3-II與免疫細(xì)胞受體之間的關(guān)聯(lián)，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖，導(dǎo)致更強的免疫應(yīng)答。進(jìn)一步的體內(nèi)實驗證明CS-PCS3-II使吞噬指數(shù)、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、溶血活性、抗體水平和遲發(fā)超敏反應(yīng)等免疫指標(biāo)均顯著提高，表明CS-PCS3-II的確顯著提高了小鼠的免疫功能。

2 生物修飾對多糖免疫活性的影響

生物修飾主要指酶修飾，酶修飾法即酶降解法，與化學(xué)修飾相比，酶修飾具有專一性、高效性、易控制、無副反應(yīng)發(fā)生等優(yōu)點，日益成為人們專注的重點。目前酶降解的主要過程是降解多糖的主鏈，使其分子量降低，粘度減小，活性易于發(fā)揮。酶修飾法可以有效提高多糖的生物活性[43-44]。對多糖免疫活性的影響也已在部分多糖中得到驗證。茶多糖經(jīng)β-D-半乳糖苷酶降解后，與同等劑量對照組相比，修飾后的茶多糖明顯提高脾指數(shù)、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)，能顯著提高DTH實驗耳腫程度、血清HC50、NK細(xì)胞活性，可見綠茶多糖經(jīng)過酶法修飾后免疫活性有所增強。同時在提高胸腺指數(shù)、ConA誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞的增殖、溶血空斑數(shù)以及小鼠碳廓清吞噬指數(shù)方面要略差，表明經(jīng)過酶法修飾后茶多糖免疫途徑發(fā)生了一定變化[45-46]，釀酒酵母細(xì)胞壁多糖經(jīng)酶法改性后其免疫活性有效增強[47]。可見，酶修飾法對多糖免疫活性也有重要的影響。

3 物理修飾法對多糖免疫活性的影響

物理修飾法是采用物理學(xué)的方法截斷原多糖分子主鏈，得到分子量較低的片段。該方法通常能保證多糖基本結(jié)構(gòu)不受破壞，而只是引起構(gòu)象發(fā)生變化[48]。目前常用的物理修飾法有超聲處理、離子輻射、高壓微射流法[49]等。有研究發(fā)現(xiàn)，用超聲波法、輻照法、微波法分別處理β-葡聚糖后，多糖的一級結(jié)構(gòu)未受影響，通過改變多糖的高級結(jié)構(gòu)使其構(gòu)象發(fā)生變化[50]。通過物理修飾法也可調(diào)控多糖免疫活性的發(fā)揮。研究惡性腫瘤患者外周血來源的NK細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)低劑量輻射作用后，NK細(xì)胞的殺傷活力顯著增強，NK細(xì)胞培養(yǎng)體系上清液中細(xì)胞因子TNF-α和IFN-γ的分泌水平均升高，其殺傷相關(guān)蛋白FasL、perforin的表達(dá)量均顯著增加，表明低劑量輻射可誘導(dǎo)惡性腫瘤患者外周血來源NK細(xì)胞免疫活性增強[51]。物理修飾法雖然并不像化學(xué)修飾法一樣被廣泛運用，但其對部分多糖免疫活性的影響已得到證實。關(guān)于物理修飾對多糖免疫活性的作用機制還有待后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)。

4 展望

多糖作為一種免疫調(diào)節(jié)劑和促進(jìn)劑，是許多植物最重要的免疫活性成分，對植物免疫系統(tǒng)起著重要的調(diào)節(jié)作用。免疫系統(tǒng)的發(fā)展和研究雖然已經(jīng)歷經(jīng)數(shù)百年，免疫機制也幾近完善，但是多糖作用于免疫系統(tǒng)的確切機制尚不清楚，多糖對于小分子識別機制還需加強。多糖雖然有種類多、活性好、天然無毒等優(yōu)勢，但是研究過程仍然面臨許多難題，如分離純化的技術(shù)難題，本身化學(xué)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，活性基團(tuán)等均需要有大量的科學(xué)實驗支持。而多糖作為活性成分，其產(chǎn)率低、利用率低的特點也較為突出。經(jīng)過不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾，得到不同結(jié)構(gòu)類型和生物活性的多糖，將有助于我們有針對性地獲得多糖特定生物活性，對于研究多糖功能性結(jié)構(gòu)基團(tuán)和活性之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。不同的功能性基團(tuán)和多糖分子協(xié)同作用，不僅能刺激細(xì)胞因子的分泌、激活巨噬細(xì)胞，NK細(xì)胞和T、B淋巴細(xì)胞、促進(jìn)抗體產(chǎn)生，還能激活補體系統(tǒng)、促進(jìn)紅細(xì)胞免疫功能及增強網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)功能?；钚曰鶊F(tuán)對免疫功能的影響有助于研究多糖的免疫機制。免疫功能的發(fā)揮又直接或者間接地影響著多糖其他功能的發(fā)揮，如抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等。如何讓多糖更好的為人類所利用是一項長遠(yuǎn)而艱巨的任務(wù)，還需要對此作出更多的研究和努力。

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