張曉云，馬巧玲，姜利群

（中國人民解放軍第184醫(yī)院檢驗科，江西 鷹潭 335000）

白色念珠菌耐藥相關(guān)UPC2基因的研究進展

張曉云，馬巧玲，姜利群

（中國人民解放軍第184醫(yī)院檢驗科，江西 鷹潭 335000）

本文綜述了白色念珠菌對唑類抗真菌藥物的耐藥機制、UPC2基因結(jié)構(gòu)特征、UPC2基因編碼產(chǎn)物的功能，指出白色念珠菌UPC2基因編碼產(chǎn)物能對ERG基因以及某些藥物外排泵蛋白基因表達發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，從而誘導(dǎo)白色念珠菌對唑類藥物產(chǎn)生耐藥性。

白色念珠菌；UPC2基因；氟康唑；耐藥

白色念珠菌(Candida albicans)是一種常見條件致病菌，通常存在于正常人皮膚、口腔、上呼吸道、腸道及陰道等黏膜部位[1]?；颊咛幱跈C體免疫力下降、介入性治療等情況下，白色念珠菌可侵襲機體，引起院內(nèi)機會性感染[2]。近年來，隨著廣譜抗菌藥物的濫用、器官移植免疫抑制劑應(yīng)用、放化療增多、各種生物裝置體內(nèi)置入和導(dǎo)管留置等，使得免疫功能低下者不斷增多，白色念珠菌引起的醫(yī)院內(nèi)獲得性感染呈增多趨勢，已成為此類患者死亡的主要原因。國內(nèi)學(xué)者報道，臨床真菌感染患者中白色念珠菌感染占67.54%[3]。氟康唑、伏立康唑等唑類藥物抗真菌譜廣、毒性低、半衰期長[4]，臨床上被廣泛用于防治真菌感染。在藥物選擇性壓力下，臨床分離的白色念珠菌對常用抗真菌藥物產(chǎn)生了一定耐藥性，導(dǎo)致藥物效能降低乃至失效，給臨床用藥安全帶來了巨大挑戰(zhàn)[5]。

1 唑類藥物的作用靶點以及抗菌機制

膽固醇是高等生物細(xì)胞膜的重要組分，為細(xì)胞膜發(fā)揮功能所必需。麥角固醇是膽固醇的同功異構(gòu)物，存在于真菌等真核細(xì)胞的細(xì)胞膜上，是此類細(xì)胞膜發(fā)揮功能所必需的固醇物質(zhì)之一。白色念珠菌細(xì)胞膜上含有麥角固醇，是白色念珠菌生長所必須的組分。白色念珠菌細(xì)胞合成麥角固醇時，細(xì)胞色素p450復(fù)合體中的14α-羊毛固醇去甲基酶(Erg11p)是關(guān)鍵限速酶。Erg11p由白色念珠菌的ERG11基因(又名CYP51基因)編碼[6]。一旦Erg11p酶活性受到干擾，細(xì)胞合成的麥角固醇減少，一方面導(dǎo)致膽固醇合成途徑中的有毒中間體物質(zhì)增加，另一方面造成細(xì)胞膜流動性以及細(xì)胞膜蛋白(例如參與細(xì)胞壁合成的酶以及轉(zhuǎn)運蛋白等)活性發(fā)生改變，真菌細(xì)胞生長受到抑制乃至死亡[4]。唑類抗真菌藥物的作用靶酶是Erg11p[7]。唑類抗真菌藥與Erg11p的血紅素鐵活性中心結(jié)合后，Erg11p酶活性受抑，麥角固醇合成被抑制或阻斷，引起真菌細(xì)胞作用生長受抑或死亡。

2 真菌對唑類藥物的耐藥機制

白色念珠菌對唑類抗真菌藥物的耐藥機制主要如下：①藥物作用靶酶(主要是Erg11p酶)基因突變或過度表達[8]，使得Erg11p酶活性未受明顯影響，真菌細(xì)胞的麥角固醇合成繼續(xù)維持，真菌繼續(xù)生長。②藥物外排泵基因表達上調(diào)，使得真菌細(xì)胞對藥物的主動外排能力增強，減少了藥物在真菌細(xì)胞內(nèi)的累積[9]，真菌得以繼續(xù)生長。白色念珠菌通過主動耗能方式將氟康唑從細(xì)胞內(nèi)排出到細(xì)胞外，白色念珠菌多個基因表達產(chǎn)物參與了對藥物的主動外排。白色念珠菌藥物外排相關(guān)的泵蛋白主要包括兩類[9]，一類是Abc轉(zhuǎn)運蛋白，由CDR基因編碼，含有ATP結(jié)合區(qū)；另一類是易化子家族蛋白，由MDR基因編碼。白色念珠菌對藥物的敏感性與藥物外排泵蛋白基因表達水平有關(guān)。泵蛋白表達水平主要受到兩類基因的影響：一類是藥物外排泵蛋白編碼基因，編碼跨膜轉(zhuǎn)運蛋白，這些蛋白負(fù)責(zé)將藥物從細(xì)胞內(nèi)排出到細(xì)胞外；另一類是轉(zhuǎn)錄因子編碼基因，編碼轉(zhuǎn)錄因子，對上述泵蛋白的編碼基因表達發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，直接影響泵蛋白表達水平，從而影響藥物敏感性。

3 UPC2基因在真菌對唑類藥物耐藥中的作用

3.1 UPC2基因結(jié)構(gòu)特征白色念珠菌UPC2基因?qū)儆谝环N轉(zhuǎn)錄因子編碼基因，編碼產(chǎn)物為Upc2蛋白(Upc2 protein，Upc2p)。Upc2p為一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，屬于鋅簇家族轉(zhuǎn)錄因子成員，含有2個鋅離子和6個半胱氨酸殘基，對白色念珠菌的多個基因表達具有調(diào)節(jié)作用轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能[10]，如調(diào)節(jié)ERG11基因轉(zhuǎn)錄與表達。鋅簇家族轉(zhuǎn)錄因子的其他成員參與調(diào)節(jié)白色念珠菌的其他新陳代謝活動，例如CAP1轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)真菌細(xì)胞應(yīng)對氧化應(yīng)激壓力，GAT1轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)氮元素代謝，CPH1、EFG1、TUP1等轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)節(jié)菌絲形態(tài)轉(zhuǎn)換[11]。UPC2基因5'端的啟動子區(qū)域存在兩個結(jié)構(gòu)域：ATG上游的-450～-350 bp區(qū)域為UDR(Upc2p-dependent region)，ATG上游的-350～-250 bp區(qū)域為UIR(Upc2p-independent region)。UPC2基因啟動子中的這兩個元件都能夠結(jié)合Upc2p，因此，UPC2基因表達水平受到順式作用調(diào)節(jié)。接受轉(zhuǎn)錄因子Upc2p調(diào)節(jié)的靶基因的啟動子區(qū)域帶有固醇反應(yīng)元件(Sterol response element，SRE)。SRE含有7 bp的保守核心序列，正義鏈為5'-TCGTATA-3'，反義鏈為5'-TATACGA-3'。體外實驗表明，Upc2p帶有DNA結(jié)合區(qū)域，能夠與靶基因的SRE直接結(jié)合，從而激活靶基因，上調(diào)靶基因表達。真菌某些對唑類藥物耐藥基因也帶有SRE元件，接受Upc2p的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[12]。

3.2 UPC2基因編碼產(chǎn)物Upc2p的功能Upc2p參與白色念珠菌對唑類藥物耐藥主要與兩方面因素有關(guān)：第一，Upc2p是真菌細(xì)胞膜麥角固醇合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子；第二，Upc2p通過調(diào)節(jié)藥物外排泵基因的表達水平來影響菌株對藥物的敏感性。

3.2.1 野生型Upc2p上調(diào)ERG11基因表達在白色念珠菌臨床耐藥株的中，ERG11基因過度表達引起藥物靶酶Erg11p蛋白增加，是唑類藥物敏感性下降的主要原因。ERG11基因表達水平高低與Upc2p活性和ERG11基因突變有關(guān)[13]。在氟康唑耐藥的白色念珠菌中，ERG11基因產(chǎn)物增多，氟康唑無法阻止全部的酶活性，白色念珠菌繼續(xù)合成麥角固醇，得到存活。由于Upc2p能夠直接激活ERG11基因以及多個參與麥角固醇合成的ERG基因的轉(zhuǎn)錄與表達，因此白色念珠菌對唑類藥物耐藥與Upc2p活性改變密切相關(guān)。UPC2基因表達水平變化以及基因突變是Upc2p活性的重要影響因素。在氟康唑耐藥的臨床白色念珠菌中發(fā)現(xiàn)，UPC2基因、ERG11基因以及參與麥角固醇合成的其他基因表達均發(fā)生了上調(diào)，證實UPC2基因過度表達后激活ERG11基因表達，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Erg11p酶增加，引起白色念珠菌對唑類藥物耐藥。

3.2.2 突變型Upc2p上調(diào)ERG11基因表達白色念珠菌UPC2基因發(fā)生有義突變后引起ERG11基因表達上調(diào)，導(dǎo)致菌株產(chǎn)生耐藥性[14]。研究發(fā)現(xiàn)，白色念珠菌Upc2p的C末端是重要的功能區(qū)，是基因突變的熱點地區(qū)，UPC2基因易發(fā)生G648D或A643T突變[15]，兩種突變均會引起真菌對唑類藥物耐藥。將G648D突變型UPC2基因引入敏感株，突變型Upc2p活性增強，造成突變菌株ERG11基因持續(xù)性表達上調(diào)，白色念珠菌對氟康唑呈現(xiàn)耐藥性。另有研究指出，白色念珠菌臨床耐藥株的UPC2基因發(fā)生了A643V突變。A643V突變型白色念珠菌的氟康唑MIC提高了兩倍，麥角固醇含量高于野生型菌株。QRT-PCR表明，突變型菌株的UPC2基因以及ERG2、3、5、6、9、10、11基因的mRNA水平均高于野生型。值得注意的是突變型菌株的ERG1基因的mRNA水平低于野生型。這些結(jié)果提示：UPC2基因的點突變，除了自身具有順式調(diào)節(jié)作用外，還發(fā)揮反式調(diào)節(jié)作用，調(diào)節(jié)其他ERG基因的轉(zhuǎn)錄[13]。

3.2.3 Upc2p調(diào)節(jié)藥物外排泵基因表達在白色念珠菌臨床耐藥株中還觀察到，TAC1、MRR1等轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生功能性突變后會導(dǎo)致CDR1、MDR1等藥物外排泵蛋白過度表達，繼而引起菌株產(chǎn)生多重耐藥性[16]。這也提醒我們，Upc2p可能也具有類似功能，通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)某些藥物外排泵蛋白的表達，而誘導(dǎo)真菌對某些藥物產(chǎn)生多重耐藥性。另外，在白色念珠菌臨床耐藥株中還發(fā)現(xiàn)，氟康唑類藥物的靶標(biāo)酶的編碼基因ERG基因發(fā)生點突變，也會引起ERG基因過度表達，從而使菌株產(chǎn)生耐藥。臨床研究已發(fā)現(xiàn)，Erg11p有60多種突變型，其中的Y132H、G450E、G464S、R467K和S405F突變型與氟康唑和伏立康唑的敏感性有關(guān)，與泊沙康唑敏感性無關(guān)[17]。

綜上所述，白色念珠菌UPC2基因編碼的Upc2p是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，能對ERG基因以及某些藥物外排泵蛋白基因表達發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，從而誘導(dǎo)白色念珠菌對唑類藥物產(chǎn)生耐藥性。

[1]劉奇,武有聰,王曉麗,等.HIV相關(guān)性口腔白色念珠菌的毒力研究[J].中國病原生物學(xué)雜志,2010,5(8):564-566.

[2]黃麗芳,劉洪利.院內(nèi)感染白色念珠菌危險因素的分析[J].檢驗醫(yī)學(xué)與臨床,2011,8(12):1479-1480.

[3]韋仕喻,黃翠波.某院2008～2010年真菌感染臨床分析[J].檢驗醫(yī)學(xué)與臨床,2012,9(18):2353-2354.

[4]Akins RA.An update on antifungal targets and mechanisms of resistance in Candida albicans[J].Med Mycol,2005,43(4):285-318.

[5]盧運照,莫海岸.白色念珠菌的臨床耐藥性變遷及控制措施研究[J].檢驗醫(yī)學(xué)與臨床,2012,9(23):2945-2946.

[6]Snelders E,Karawajczyk A,Schaftenaar G,et al.Azole resistance profile of amino acid changes in Aspergillus fumigatus CYP51A based on protein homology modeling[J].Antimicrob Agents Chemother,2010,54(6):2425-2430.

[7]Lamb DC,Kelly DE,White TC,et al.The R467K amino acid substitution in Candida albicans sterol 14alpha-demethylase causes drug resistance through reduced affinity[J].Antimicrob Agents Chemother,2000,44(1):63-67.

[8]Chau AS,Mendrick CA,Sabatelli FJ,et al.Application of real-time quantitative PCR to molecular analysis of Candida albicans strains exhibiting reduced susceptibility to azoles[J].Antimicrob Agents Chemother,2004,48(6):2124-2131.

[9]Holmes AR,Keniya MV,Ivnitski-Steele I,et al.The monoamine oxidase A inhibitor clorgyline is a broad-spectrum inhibitor of fungal ABC and MFS transporter efflux pump activities which reverses the azole resistance of Candida albicans and Candida glabrata clinical isolates[J].AntimicrobAgents Chemother,2012,56(3):1508-1515.

[10]Vandeputte P,Ischer F,Sanglard D,et al.In vivo systematic analysis of Candida albicans Zn2-Cys6 transcription factors mutants for mice organ colonization[J].PLoS One,2011,6(10):e26962.

[11]Johnston DA,Eberle KE,Sturtevant JE,et al.Role for endosomal and vacuolar GTPases in Candida albicans pathogenesis[J].Infect Immun,2009,77(6):2343-2355.

[12]Oliver BG,Song JL,Choiniere JH,et al.cis-Acting elements within the Candida albicans ERG11 promoter mediate the azole response through transcription factor Upc2p[J].Eukaryot Cell,2007,6(12): 2231-2239.

[13]Hoot SJ,Smith AR,Brown RP,et al.An A643V amino acid substitution in Upc2p contributes to azole resistance in well-characterized clinical isolates of Candida albicans[J].Antimicrob Agents Chemother,2011,55(2):940-942.

[14]MacPherson S,Akache B,Weber S,et al.Candida albicans zinc cluster protein Upc2p confers resistance to antifungal drugs and is an activator of ergosterol biosynthetic genes[J].Antimicrob Agents Chemother,2005,49(5):1745-1752.

[15]Heilmann CJ,Schneider S,Barker KS,et al.An A643T mutation in the transcription factor Upc2p causes constitutive ERG11 upregulation and increased fluconazole resistance in Candida albicans[J]. AntimicrobAgents Chemother,2010,54(1):353-359.

[16]Lohberger A,Coste AT,Sanglard D.Distinct roles of Candida albicans drug resistance transcription factors TAC1,MRR1,and UPC2 in virulence[J].Eukaryot Cell,2014,13(1):127-142.

[17]Xu Y,Chen L,Li C.Susceptibility of clinical isolates of Candida species to fluconazole and detection of Candida albicans ERG11 mutations[J].JAntimicrob Chemother,2008,61(4):798-804.

R372

A

1003—6350（2014）17—2564—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.17.1001

2014-03-25)

南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)科技創(chuàng)新項目（編號：12MA050）

張曉云。E-mail：zhangxy167@163.com