金 芬，張忠壽，黃衛(wèi)鋒

(三峽大學醫(yī)學院，湖北 宜昌 443002)

上皮間質(zhì)轉化和內(nèi)皮間質(zhì)轉化在腎纖維化中的研究進展

金 芬，張忠壽，黃衛(wèi)鋒

(三峽大學醫(yī)學院，湖北 宜昌 443002)

上皮間質(zhì)轉化(EMT)和內(nèi)皮間質(zhì)轉化(EndMT)參與各種纖維化疾病的發(fā)病機制，EMT和EndMT已經(jīng)成為器官纖維化研究的一個重點課題。EMT和EndMT在腎的纖維化過程中起到至關重要的作用。越來越多細胞內(nèi)外分子可控制EMT和EndMT的表達，尤其是microRNA(miRNA)在EMT和EndMT中的調(diào)控作用，已被確定可利用于開發(fā)治療纖維化。本文綜述了EMT和EndMT在腎纖維化中的研究進展，了解EMT和EndMT參與腎病纖維化過程的機制，這將會給人類腎纖維化疾病的治療提供一種新的靶點和方法。

上皮間質(zhì)轉化；內(nèi)皮間質(zhì)轉化；腎的纖維化；miRNA

腎纖維化是腎長期損傷或正常傷口愈合過程中功能失調(diào)，導致過量的細胞外基質(zhì)(ECM)沉積造成的。EMT與EndMT過程中激活產(chǎn)生的成纖維細胞是腎成纖維細胞的主要來源。在腎纖維化過程中，腎成纖維細胞發(fā)揮著重要的作用。在EMT和EndMT過程中存在復雜的調(diào)控，最新的研究表明，miRNA在EMT和EndMT過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。miRNA是小的非編碼RNA，通過抑制蛋白質(zhì)翻譯或誘導mRNA降解來抑制靶基因的表達。miRNA可調(diào)控細胞的分化、增殖、死亡、代謝等多種病理生理機制的基本過程[1]。因此，研究EMT和EndMT過程在纖維化中的作用，可以推進我們對常見發(fā)病機制的理解，也可能為治療干預提供新的靶點。這篇綜述側重于上皮間質(zhì)轉化和內(nèi)皮間質(zhì)轉化在腎臟疾病中的生物學角色。

1 EMT在腎纖維化中的作用

在上皮-間質(zhì)轉化過程中上皮細胞有一系列的變化，它的極性喪失，遷移和運動能力增強，同時獲得間質(zhì)細胞特性。EMT在細胞運動和發(fā)育過程中可促進新組織的產(chǎn)生，但也是多種疾病的發(fā)病機制之一。上皮細胞是位于皮膚或腔道表層的細胞，它們與相鄰的細胞存在著緊密的細胞連接，從而抑制上皮細胞潛在的運動和分離。與此相反，間充質(zhì)細胞不形成規(guī)則的細胞層。間充質(zhì)細胞相對于上皮細胞其形狀較長，呈現(xiàn)極性，遷移能力較強。間充質(zhì)細胞與鄰近細胞的相互作用可能影響間充質(zhì)細胞的極性，但是它們?nèi)狈Φ湫偷纳掀ぜ毎?底極性。此外，在組織內(nèi)間充質(zhì)細胞容易單獨遷移。間充質(zhì)細胞的發(fā)生發(fā)展對于個體的發(fā)育至關重要，他們能夠在胚胎中長距離的遷移，并進一步形成一個特定器官。在成人體內(nèi)，成纖維細胞是由胚胎時期間充質(zhì)細胞分化而成的，它的主要功能是分泌細胞外基質(zhì)來保持結構完整性。Kalluri等[2]將EMT分為以下三種類型：第一種類型的主要生物學功能是通過間充質(zhì)細胞上皮化(MET)過程產(chǎn)生上皮細胞，與胚胎植入、發(fā)育和器官形成相關。這種類型EMTs既不引起纖維化，也不誘導侵襲；第二種類型的EMT是上皮細胞轉化成組織成纖維細胞，與組織的損傷修復、組織再生和器官纖維化相關。與第一種類型的EMT相比，炎癥反應誘導第二種類型的EMT發(fā)生，但當炎癥反應消失或緩解后，該類型的EMT即自行停止，尤其是在創(chuàng)傷愈合和組織再生中[3]。在器官纖維化過程中，持續(xù)的炎癥反應導致第二種類型的EMT持續(xù)進行，并最終造成器官纖維化[3]；第三種類型的EMT是指與上皮細胞惡性腫瘤相關的上皮-間質(zhì)轉化過程。原發(fā)性上皮組織腫瘤細胞通過第三種類型EMT形成具有遷移能力的間充質(zhì)細胞，隨血液流動轉移至不同部位，進而通過MET過程形成上皮細胞的腫瘤轉移灶[4]。

成纖維細胞特異蛋白(Fibroblast-specific proteinl，F(xiàn)SP-1)、S100類細胞骨架蛋白、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和Ⅰ型膠原蛋白是各種器官纖維化過程中EMT的可靠標志物[2]。以上這些標記物，連同盤狀結構域受體酪氨酸激酶2 (Discoidin domain receptor tyrosine kinase 2，DDR2)、波形蛋白和結蛋白，在腎、肝、肺、腸等器官中，已被用于識別慢性炎癥誘導的EMT過程中的上皮細胞。有些細胞既表現(xiàn)出形態(tài)學方面的上皮特異性和分子標志物，如角蛋白和上皮細胞鈣黏蛋白(E-cadherin)，同時又伴隨FSP-1和α-SMA等間充質(zhì)細胞的標記，這一現(xiàn)象則表示這類細胞有可能處于EMT的中間階段。種種跡象表明，炎癥反應誘導的上皮細胞EMT過程，使上皮細胞進行了不同程度的上皮-間質(zhì)轉化。最終，這些細胞離開上皮細胞層，穿過底層基底膜，堆積在間質(zhì)組織中，擺脫所有的上皮標記，并獲得完全的成纖維細胞表型。

炎性損傷的小鼠腎臟可以引起一系列的炎癥細胞聚集和入侵，炎癥細胞通過釋放細胞因子，如：轉化生長因子(TGF-β)、血小板衍生因子(PDGF)、表皮生長因子(EGF)、成纖維細胞生長因子-2(FGF-2)等，誘發(fā)腎臟上皮細胞發(fā)生EMT[2]。炎癥細胞中巨噬細胞和被激活的成纖維細胞起最主要的作用，它們聚集在損傷部位釋放出這些生長因子。此外，這些細胞還釋放趨化因子和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)，特別是MMP-2、MMP-3和MMP-9[5]。TGF-β在器官纖維化過程中誘導EMT的意義已被廣泛研究。在小鼠的腎、肝、肺、腸纖維化模型中，骨形態(tài)發(fā)生蛋白7 (BMP-7)是TGF-β的拮抗劑[6]，它可以逆轉TGF-β誘導的E-cadherin蛋白丟失。BMP-7通過活化素受體樣激酶2(Activin like kinase-2/-3/-6，ALK-2/3/6)和下游轉錄因子Smad蛋白，恢復E-cadherin蛋白的表達[6]。在嚴重纖維化的小鼠中重新表達BMP-7可以逆轉EMT和修復受損的腎上皮結構，BMP-7的作用通過MET來起作用的。BMP-7在逆轉EMT的同時還伴隨器官功能的恢復，F(xiàn)SP-1+與α-SMA+陽性標志著間質(zhì)成纖維細胞的減少以及BMP-7信號通路的重新激活[6]。不同類型的EMT及EMT過程中的不同階段可能由一組共同的刺激、信號轉導途徑、轉錄因子、轉錄后調(diào)節(jié)，誘發(fā)和調(diào)節(jié)[3]。

2 miRNA在EMT中的調(diào)節(jié)作用

miRNA的全基因組分析表明，miR-200、miR-205與EMT高度相關，miR-200與眾多細胞系及上皮組織E-cadherin蛋白的表達有很大關系[7-8]。miR-200與鋅指E盒結合同源蛋白1(ZEB1)和Smad相互作用蛋白1(SIP1)的3'非編碼RNA結合，抑制ZEB1和SIP1的表達，從而提高E-cadherin的蛋白表達，增強上皮細胞的表型。miR-200家族及其他miRNAs與EMT有關的下游靶點已經(jīng)確定，miR-141能夠抑制TGF-β2[8]，miR-200a可以抑制β-鏈蛋白(β-Catenin)[9]。miRNAs與TGF-β的信號通路也存在緊密的聯(lián)系。在TGF-β誘導EMT的乳腺上皮細胞中，smad4介導的轉錄可以激活miR-155的表達，miR-155使上皮細胞失去極性的同時影響上皮細胞間的緊密連接[10-11]。表達miR-155的上皮細胞對TGF-β的應答更為迅速。RhoA是miR-155下游的一個關鍵靶基因，它在細胞連接的形成和穩(wěn)定中起主要作用。RhoA mRNA中有三個與miR-155結合的保守位點，它們可能是miR-155的結合調(diào)控位點[10]。這些研究表明，除了TGF-β介導的泛素化降解RhoA外，miR-155在EMT的過程也會起到進一步抑制RhoA的作用。在TGF-β誘導EMT的乳腺上皮細胞中，miR-29a和miR-21的表達水平上升[10]，但它們在EMT中的作用尚未完全闡明。過表達miR-29會誘導細胞發(fā)生EMT，抑制鋅指同源蛋白36(Zinc finger protein 36 homolog，ZFP36)，激活Ras信號通路[11]。miR-21在各種腫瘤中高表達，并可通過誘導癌細胞的EMT而使癌細胞轉移。miR-21的啟動子區(qū)域存在有典型的E-box結合原件。E-box結合原件作為ZEB1的結合位點，結合ZEB1后誘導miR-21轉錄同時解除BMP-6對乳腺癌細胞EMT的抑制作用[13]。另外有研究表明，miR-9直接作用于E-cadherin蛋白的mRNA編碼區(qū)[12]。miR-9的表達異常會誘導乳腺上皮細胞EMT的發(fā)生[13]。

3 EndMT在腎纖維化中的作用

血管內(nèi)皮細胞與上皮細胞有一些共同的性質(zhì)，它也可以通過類似EMT的表型過渡產(chǎn)生成纖維細胞，這一過程稱為內(nèi)皮間質(zhì)細胞轉化(EndMT)[14]。內(nèi)皮細胞排列在整個循環(huán)系統(tǒng)和淋巴系統(tǒng)中，形成內(nèi)襯血管和淋巴管。這些細胞在解剖學上與鱗狀上皮類似，表達出上皮細胞的頂-底極性同時又以粘合連接和緊密連接的方式緊密連接在一起[15]。這些細胞表達不同的生物標志，如：VE-cadherin、CD31和細胞角蛋白。在EndMT過程中與EMT類似，內(nèi)皮細胞失去了附著力以及上皮細胞頂-底極性，形成了具有高度侵襲力、遷徙力、梭形細長的間充質(zhì)細胞。隨著細胞極性和形態(tài)的變化，細胞內(nèi)的生化狀態(tài)也隨之改變，失去內(nèi)皮細胞特異性標志物CD31和VE-鈣粘蛋白，獲得間質(zhì)細胞特異性標志物α-SMA和FSP1[15]。

Zeisberg等[16]在2008年運用三種小鼠模型，在單側輸尿管梗阻(Unilateral ureteral obstruction)、鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病腎病、COL4A3(α3 chain of collagen type 4)基因敲除的小鼠模型中進行了具有里程碑意義的實驗。該實驗證實了EndMT在腎臟纖維化中的作用，他們在三種小鼠模型中發(fā)現(xiàn)有肌纖維母細胞表達內(nèi)皮標記物CD31和血小板內(nèi)皮細胞粘附分子-1(Platelet endothelial cell adhesion molecule-1)，同時也表達成纖維細胞標記物α-SMA和FSP-1。此外，在6個月內(nèi)單次注射鏈脲佐菌素后誘導的CD1小鼠腎臟模型中，它的腎臟表現(xiàn)出漸進性腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化。采用雙免疫標記實驗顯示，約40%的FSP-1(+)和50%的α-SMA(+)腎臟間質(zhì)細胞顯示出CD31+[16]。在22周齡COL4A3基因敲除小鼠的腎臟中約有45%的α-SMA(+)和60%的FSP-1(+)的成纖維細胞呈現(xiàn)CD31+。這些現(xiàn)象表明這些成纖維細胞可能是內(nèi)皮細胞的起源，EndMT可能會在腎臟纖維化的過程中促進成纖維細胞的積累[16]。Li等[17]在2009年也證實了EndMT在早期糖尿病腎病中可以促進肌纖維母細胞的產(chǎn)生。利用增強型綠色熒光蛋白基因(EGFP)的轉基因小鼠，他們發(fā)現(xiàn)在STZ誘導的糖尿病腎病小鼠中有大量的間質(zhì)α-SMA+細胞(成纖維細胞)是內(nèi)皮細胞的來源。

4 miRNA在EndMT中的作用

miRNA可以通過抑制轉錄復合物間接地上調(diào)許多基因的表達。在血管內(nèi)皮細胞中，TGF-β能夠抑制磷酸酶以及人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(PTEN)的活性，從而激活AKT，誘導miRNA-21的表達上調(diào)[18]。Smad3信號可增加miR-21在腎臟中的表達，促進由TGF-β引起的腎臟纖維化，而Smad2信號對miR-21的轉錄后修飾過程起負調(diào)控作用[19]。miR-23可以抑制TGF-β誘導小鼠內(nèi)皮細胞的EndMT過程。通過miRNA芯片技術，Ghosh等[20]發(fā)現(xiàn)，在EndMT的過程中miR-125 b、let-7c、let-7g、miR-21、miR-30 b和miR-195的水平顯著上升，而miR-122a、miR-127、miR-196和miR-375的表達水平下降。阻礙FGF信號可以誘導EndMT過程的發(fā)生，let-7b可以模仿這一過程誘導EndMT，而let-7c會抑制這一過程。雖然這些研究大多集中在血管內(nèi)皮細胞中，但研究表明，特異性的作用于相應miRNA，如：抑制miR-21的上調(diào)或使miR-125b的表達下調(diào)，對于阻斷腎臟中EndMT的誘導也許是一種可行的方法。

5 展望

目前已有的數(shù)據(jù)表明，在西方有近45%的人死于各種慢性纖維疾病[21]。EMT和EndMT已經(jīng)成為器官纖維化研究的一個重要研究方向。EMT和EndMT參與各種纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展，包括腎的纖維化，盡管人們在分子生物學水平上獲得很多關于EMT和EndMT的分子機制，但是這些分子機制需要通過進一步研究人體臨床病理資料來確認和驗證。未來的研究工作應加強了解miRNA在腎臟疾病中的作用[22]，這些研究有可能會給人類腎纖維化疾病的治療提供一種新的靶點和方法。

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A

1003—6350（2014）18—2723—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.18.1068

2014-03-27)

黃衛(wèi)鋒。E-mail：huangwf006@126.com