暴麗莎 郝玲 劉芳 任常軍

·綜述與講座·

早產(chǎn)動(dòng)物GMH-IVH模型的制作

暴麗莎 郝玲 劉芳 任常軍

生發(fā)基質(zhì)-腦室內(nèi)出血；模型，動(dòng)物；早產(chǎn)

隨著圍產(chǎn)技術(shù)及重癥監(jiān)護(hù)技術(shù)的提高，目前越來(lái)越多的早產(chǎn)兒得以存活。因此，早產(chǎn)兒的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥日漸成為人們首要關(guān)注的問題之一[1]。生發(fā)基質(zhì)-腦室內(nèi)出血(germinal matrix hemorrhage-intraventricular hemorrhage，GMH-IVH)是早產(chǎn)兒主要的腦損傷形式[2]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道在胎齡<32周或(和)出生體重<1 500 g的早產(chǎn)兒中GMH-IVH的發(fā)生率為20%左右，其中Ⅳ級(jí)出血占8.3%[3]。出生體重為500～750 g的超低出生體重兒GMH-IVH的發(fā)生率高達(dá)45%[4]。我國(guó)早產(chǎn)兒GMH-IVH的發(fā)生率明顯高于發(fā)達(dá)國(guó)家。我國(guó)早產(chǎn)兒GMH-IVH的發(fā)生率為56.6%，其中重度出血的發(fā)生率為16.3%，并且存活者約35%遺留慢性神經(jīng)障礙。GMH-IVH后出現(xiàn)的主要神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥包括腦性癱瘓、癲癇、學(xué)習(xí)困難和認(rèn)知異常等[5]，因此GMH-IVH是早產(chǎn)兒早期死亡的主要原因，也是早產(chǎn)兒以后智力、運(yùn)動(dòng)發(fā)育障礙的主要原因。這些不僅給家庭、社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，還給家庭帶來(lái)沉重的心理負(fù)擔(dān)。目前GMH-IVH造成的腦損傷機(jī)制還在研究中，同時(shí)在臨床治療中GMH-IVH無(wú)特效療法，主要依靠支持療法，許多新的治療辦法還有待于驗(yàn)證[6]。GMH-IVH動(dòng)物模型的建立是解決這些問題十分有效的途徑。當(dāng)前存在的主要問題是如何建立較為標(biāo)準(zhǔn)的GMH-IVH動(dòng)物模型，它不僅在出血后形態(tài)學(xué)及病理生理機(jī)制上要接近人類早產(chǎn)兒，還要具有價(jià)格合理、容易復(fù)制和操作的優(yōu)點(diǎn)。2008年美國(guó)Georgiadis等[3]首次報(bào)道了該類動(dòng)物模型的建立及相關(guān)研究。目前在國(guó)內(nèi)相關(guān)研究中尚無(wú)標(biāo)準(zhǔn)GMH-IVH動(dòng)物模型用于描述這種GMH-IVH后的急性腦損傷。本文綜述了近年來(lái)在國(guó)內(nèi)外各類文獻(xiàn)中應(yīng)用的GMH-IVH動(dòng)物模型，以供大家參考，同時(shí)對(duì)國(guó)外建立的早產(chǎn)動(dòng)物GMH-IVH模型進(jìn)行介紹，希望可借助此動(dòng)物模型對(duì)早產(chǎn)兒GMH-IVH進(jìn)行更加深入、細(xì)致的研究。

1 早產(chǎn)兒腦出血的類型及機(jī)制

1.1 新生兒腦出血根據(jù)出血部位主要分為四種類型：(1) GMH-IVH；(2)硬腦膜下出血；(3)蛛網(wǎng)膜下腔出血；(4)小腦出血。GMH-IVH是早產(chǎn)兒最常見的腦出血類型。

1.2 早產(chǎn)兒腦出血與成人腦出血機(jī)制不盡相同，目前早產(chǎn)兒GMH-IVH造成的腦損傷機(jī)制還在研究中，大多數(shù)研究認(rèn)為早產(chǎn)兒GMH-IVH是多種原因共同作用的結(jié)果[7]，最主要的原因被認(rèn)為是[8]：(1)早產(chǎn)兒生發(fā)基質(zhì)脈管系統(tǒng)的脆弱性：毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞間緊密連接、基膜、星形膠質(zhì)細(xì)胞足突、周細(xì)胞和極狹小的細(xì)胞外隙共同構(gòu)成了血-腦屏障，這些成分中，任何一處存在薄弱或受損，均有可能導(dǎo)致顱內(nèi)壓升高，引起GMH-IVH[7]。(2) 腦血管內(nèi)血流量的波動(dòng)：早產(chǎn)兒的腦出血好發(fā)于室管膜下的生發(fā)基質(zhì)。室管膜下生發(fā)基質(zhì)的血液供應(yīng)來(lái)自于大腦前動(dòng)脈及中動(dòng)脈，在此處形成供血豐富的毛細(xì)血管床，且來(lái)自腦白質(zhì)，脈絡(luò)叢，紋狀體的多條靜脈在尾狀核頭部位匯合成端靜脈，形成“U”字形回路，這種特殊的走形極易發(fā)生血流動(dòng)力學(xué)的變化而致出現(xiàn)腦出血。(3)早產(chǎn)兒血小板及凝血功能障礙：新生兒肝臟功能不成熟，凝血因子生成不足，凝血功能較差，且目前通過研究發(fā)現(xiàn)，凝血功能與胎齡有關(guān)，胎齡越低，凝血功能低下程度越嚴(yán)重，越易發(fā)生GMH-IVH。此外一些影響因子如缺血、缺氧、感染、免疫及理化因素等均可能引起緊密連接結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生改變?cè)斐裳X屏障損害，從而導(dǎo)致血腦屏障通透性升高引起腦水腫、腦出血。早產(chǎn)兒生后易受血糖、血壓、氧分壓、二氧化碳分壓、機(jī)械通氣等因素的影響，尤其高碳酸血癥時(shí)，可擴(kuò)張腦血管，從而增加腦血流，導(dǎo)致GMH-IVH的發(fā)生[9，10]。由此可見，早產(chǎn)兒GMH-IVH與成人腦出血發(fā)生機(jī)制的不同，建立的GMH-IVH模型要與早產(chǎn)兒GMH-IVH的機(jī)制具有臨床相似性，以便為進(jìn)一步研究早產(chǎn)兒GMH-IVH后的急性腦損傷奠定研究基礎(chǔ)。

2 GMH-IVH模型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇

許多動(dòng)物如兔、犬及嚙齒類動(dòng)物被用來(lái)制作GMH-IVH動(dòng)物模型，但是目前尚無(wú)一種動(dòng)物模型能模擬早產(chǎn)兒GMH-IVH后所有的病理生理及神經(jīng)行為的變化，且在對(duì)動(dòng)物的選擇上，每種動(dòng)物均有自己的優(yōu)缺點(diǎn)。無(wú)論何種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，制作模型的目的是希望其出血后腦組織的形態(tài)學(xué)變化及病理生理的改變與早產(chǎn)兒GMH-IVH具有良好的相似性。目前國(guó)內(nèi)外用以建立GMH-IVH常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有嚙齒類動(dòng)物(如大鼠)、靈長(zhǎng)類動(dòng)物(如猩猩)、以及兔、貓、狗等多腦回動(dòng)物。靈長(zhǎng)類動(dòng)物如獼猴、猩猩等，與人類腦成熟度及其損傷形式具有很高的一致性，能準(zhǔn)確反應(yīng)人類新生兒的損傷機(jī)制及神經(jīng)病理情況，可提供用于人體實(shí)驗(yàn)前極有價(jià)值且安全有效的方法和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，但因其價(jià)格昂貴，數(shù)量有限，此模型的應(yīng)用受到了限制，不適合進(jìn)行大量的基礎(chǔ)研究。大鼠繁殖快、價(jià)格低廉，體積小，易于管理，喂養(yǎng)，可被大量的用以實(shí)驗(yàn)研究，且大鼠的腦血管解剖及生理與人類較為接近，同時(shí)目前大量科研工作多用大鼠，已積累了大量關(guān)于大鼠的生理、病理等方面的實(shí)驗(yàn)資料。但是大鼠為嚙齒類動(dòng)物，屬于單腦回動(dòng)物，此點(diǎn)與人類不符合，且大鼠的體積小，GMH-IVH后的影像學(xué)的評(píng)價(jià)較為困難。應(yīng)用早產(chǎn)兔進(jìn)行GMH-IVH模型制作的優(yōu)勢(shì)在于其許多方面與人類有相似之處：(1)腦組織生長(zhǎng)極限發(fā)生在圍產(chǎn)期，這與人類相似，常用于腦損傷后的運(yùn)動(dòng)研究；(2)腦基質(zhì)含量十分豐富；(3)腦血流通過頸內(nèi)動(dòng)脈和椎動(dòng)脈；(4)肺的完全成熟發(fā)生在胎內(nèi)，這使它們即使是早產(chǎn)兔，也有能力存活；(5)它們有發(fā)生自發(fā)性GMH-IVH的風(fēng)險(xiǎn)；(6)家兔基底節(jié)發(fā)達(dá)，而基底節(jié)是人類GMH-IVH的好發(fā)部位，同時(shí)家兔體積大，其GMH-IVH后的影像學(xué)的評(píng)價(jià)也較為方便。此外家兔價(jià)格相對(duì)低廉，兔子妊娠期為30～32 d，孕周29 d的兔子生理上屬于早產(chǎn)兔，較容易獲得，因而適合作為研究人類早產(chǎn)兒GMH-IVH的動(dòng)物模型。

3 常見的腦出血?jiǎng)游锬Ｐ?/h2>

筆者尚未見到我國(guó)目前早產(chǎn)動(dòng)物GMH-IVH模型研究的報(bào)道，很多實(shí)驗(yàn)研究顯示了目前人們建立的成年動(dòng)物腦出血模型。比較常見的為成年大鼠或家兔腦出血模型的建立，常見的腦出血模型包括四種：(1)自體血或血凝塊腦內(nèi)注入腦出血模型。20世紀(jì)60年代就開始應(yīng)用此法進(jìn)行腦出血模型的建立，隨著立體定位技術(shù)的問世，使此法更加完善。此法可通過立體定位技術(shù)建立我們所需要的腦出血模型，同時(shí)可通過控制血液注入量制作分級(jí)實(shí)驗(yàn)性腦出血的研究，這種模型的制作接近臨床腦實(shí)質(zhì)的出血，可用于更好的觀察腦實(shí)質(zhì)出血后的病理形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，但注入的血量與血腫產(chǎn)生的大小沒有確定的關(guān)系，所以此實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較差，而且即使有立體定位儀，注入血可能進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔，引起腦實(shí)質(zhì)的潛在損傷[11]。(2)腦內(nèi)植入填充物腦出血模型。此模型填充物大多應(yīng)用微球囊。但此種方法為單純機(jī)械性損傷，不能進(jìn)一步模擬腦出血后腦細(xì)胞及其神經(jīng)的病理生理變化，目前此法較少應(yīng)用。(3)腦內(nèi)注入膠原酶誘導(dǎo)腦出血模型。此法制作模型快捷且重復(fù)性好，肝素化的膠原酶能夠破壞血腦屏障，與人類腦出血的病理生理學(xué)有許多相似之處，但血腫形成時(shí)間過長(zhǎng)，病理上類似出血性腦梗死，與腦出血后急性腦損傷不相同，因此此模型的應(yīng)用受到限制。(4)自發(fā)性腦出血模型。此模型中使用一種為應(yīng)用血壓表型為標(biāo)志近交培育的自發(fā)性高血壓大鼠，但此種大鼠培育不便，應(yīng)用受到很大的限制。第二種為腎型高血壓大鼠，但是此法造成腦出血的發(fā)生率及部位不穩(wěn)定，使其應(yīng)用受到限制。

國(guó)內(nèi)目前建立的腦出血?jiǎng)游锬Ｐ突旧鲜褂玫氖浅赡陝?dòng)物，從病理生理上也是為進(jìn)一步模擬成年人腦出血后腦損傷的病理生理變化情況。但是早產(chǎn)兒作為特殊的群體，其腦出血的機(jī)制與成年人腦出血的機(jī)制不同，腦出血后造成的急性腦損傷亦與成年人有差別，成年動(dòng)物腦出血模型不能直接被用來(lái)研究早產(chǎn)動(dòng)物腦出血的機(jī)制。同時(shí)有實(shí)驗(yàn)指出可應(yīng)用缺氧或高碳酸血癥造成腦血管擴(kuò)張，血流量增多，從而建立腦出血?jiǎng)游锬Ｐ?。但是這種實(shí)驗(yàn)力度不易掌握，且容易造成動(dòng)物死亡，復(fù)制困難，使實(shí)驗(yàn)失敗。因此需要尋找一種安全的，更為接近早產(chǎn)兒腦出血發(fā)生機(jī)制的動(dòng)物模型。

4 國(guó)外已建立的早產(chǎn)動(dòng)物GMH-IVH模型

丙三醇(俗稱甘油)，是一種高滲溶液，是對(duì)硝基化合物的終產(chǎn)物，分娩時(shí)或分娩后快速腹腔注射丙三醇，使腦組織血漿滲透性急劇增加，組織間水分向血漿轉(zhuǎn)移，血流量增加，嚴(yán)重者出現(xiàn)腦組織血管破裂，引起新生動(dòng)物顱內(nèi)出血[12]。更為重要的是，丙三醇對(duì)模型動(dòng)物無(wú)直接腦損傷和肝、腎、肺、心等其他重要臟器毒副作用。在大鼠腹腔注射丙三醇實(shí)驗(yàn)中，研究者檢測(cè)動(dòng)物血漿肌酐、血尿素氮及電解質(zhì)，發(fā)現(xiàn)丙三醇并沒有對(duì)腎小管上皮細(xì)胞造成任何損害[13]。有相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)腹腔或靜脈注射丙三醇后不會(huì)產(chǎn)生神經(jīng)細(xì)胞的毒性，對(duì)腦組織內(nèi)谷氨酸、丙酮酸的代謝無(wú)影響。甚至有關(guān)于應(yīng)用靜脈注射丙三醇治療缺氧性腦水腫、腦腫瘤等方面的報(bào)道[14，15]。利用腹腔注射丙三醇建立的早產(chǎn)兔GMH-IVH模型，與早產(chǎn)兒GMH-IVH發(fā)病機(jī)制及GMH-IVH后的腦損傷具有臨床相似性。

2008年Georgiadis等[3]通過向早產(chǎn)兔腹腔注射丙三醇建立了GMH-IVH的早產(chǎn)兔動(dòng)物模型。通過對(duì)孕29 d(足月為32 d)的孕兔進(jìn)行剖宮產(chǎn)，將生后3 h的早產(chǎn)兔腹腔注射50%丙三醇，建立GMH-IVH模型。對(duì)此模型進(jìn)行超聲影像學(xué)評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)約80%左右的早產(chǎn)兔出現(xiàn)顱內(nèi)出血。同時(shí)超聲影像顯示了早產(chǎn)兔腦出血的部位與人類早產(chǎn)兒GMH-IVH后的超聲影像具有相同的特點(diǎn)，將早產(chǎn)兔安樂死，肉眼觀察出血腦組織的大體標(biāo)本也證實(shí)了超聲所見。對(duì)GMH-IVH早產(chǎn)兔根據(jù)Derrick法[16]進(jìn)行神經(jīng)行為評(píng)分，發(fā)現(xiàn)GMH-IVH早產(chǎn)兔神經(jīng)行為學(xué)上的改變亦符合早產(chǎn)兒GMH-IVH后的神經(jīng)行為學(xué)改變。

通過對(duì)建立的GMH-IVH早產(chǎn)兔動(dòng)物模型進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)出血腦組織周圍可見較多的嗜中性粒細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞圍繞，可見細(xì)胞的凋亡及神經(jīng)元的壞死及軸索的損傷[17]。β-淀粉樣前體蛋白和神經(jīng)微絲的免疫標(biāo)記提示發(fā)生了軸突的損害。同時(shí)，通過對(duì)早產(chǎn)兒進(jìn)行尸解也發(fā)現(xiàn)了同樣的GMH-IVH后腦室周圍細(xì)胞的凋亡及浸潤(rùn)[3]。由此可見此種動(dòng)物模型不但具有很好的重復(fù)性，且與臨床上GMH-IVH早產(chǎn)兒腦組織的病理生理變化較為一致，因此非常適合作為進(jìn)一步研究早產(chǎn)兒GMH-IVH的理想動(dòng)物模型，也將為進(jìn)一步研究早產(chǎn)兒GMH-IVH后的繼發(fā)性腦損傷機(jī)制，驗(yàn)證新的治療方法奠定基礎(chǔ)。

隨著醫(yī)療水平的提高，越來(lái)越多的早產(chǎn)兒得以救治、存活。但是早產(chǎn)兒存活只是我們臨床救治的初級(jí)目標(biāo)，我們更需要做的是提高其生存質(zhì)量。GMH-IVH作為早產(chǎn)兒常見的腦損傷形式之一，需要給予極大的關(guān)注。對(duì)于早產(chǎn)兒GMH-IVH的研究，基礎(chǔ)研究的前提是動(dòng)物模型的建立，只有建立了較為完善的動(dòng)物模型，我們才能進(jìn)一步從發(fā)病機(jī)制、治療、預(yù)后等方面更加細(xì)致的研究早產(chǎn)兒GMH-IVH，為今后的治療策略及治療方法開辟進(jìn)一步的研究方向。相信通過我們的不斷努力，可以建立更為完善的早產(chǎn)動(dòng)物GMH-IVH模型，從而進(jìn)一步應(yīng)用于臨床，為人類帶來(lái)更大的福音。

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·消 息·

醫(yī)學(xué)論文中有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物描述的要求

在醫(yī)學(xué)論文的描述中，凡涉及到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物者，在描述中應(yīng)符合以下要求：(1)品種、品系描述清楚；(2)強(qiáng)調(diào)來(lái)源交待；(3)遺傳背景；(4)微生物學(xué)質(zhì)量；(5)明確體質(zhì)量；(6)明確等級(jí)；(7)明確飼養(yǎng)環(huán)境和實(shí)驗(yàn)環(huán)境；(8)明確性別；(9)有無(wú)質(zhì)量合格證；(10)有對(duì)飼養(yǎng)的描述(如飼料類型、營(yíng)養(yǎng)水平、照明方式、溫度要求、濕度要求)；(11)所有動(dòng)物數(shù)量準(zhǔn)確；(12)詳細(xì)描述動(dòng)物的健康狀況；(13)對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的處理方式有單獨(dú)清楚的交代；(14)全部有對(duì)照，部分可采用雙因素方差分析。

本刊編輯部

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.02.049

項(xiàng)目來(lái)源：河北省科學(xué)術(shù)研究與發(fā)展指導(dǎo)計(jì)劃(編號(hào)：10276159)

050082 石家莊市，中國(guó)人民解放軍白求恩國(guó)際和平醫(yī)院兒科NICU(暴麗莎、劉芳)；河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院兒科(郝玲、任常軍)

R 722.6

A

1002-7386(2014)02-0266-03

2013-07-18)