陳美霓 郭 巍 趙菊梅 魏曉麗 王愛紅 龐秋霞

1.延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，陜西延安 716000；2.延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科，陜西延安 716000

原發(fā)性肝細(xì)胞癌是全球第5 位常見惡性腫瘤，其 病死率占惡性腫瘤病死率的第3 位。 據(jù)2008 年的報(bào)道，中國肝癌5 年患病數(shù)為29.6 萬例，約占全球肝癌5 年患病數(shù)的48.3%。 在未來10 年肝癌的發(fā)病數(shù)和病死數(shù)均將呈現(xiàn)上升趨勢。 采用手術(shù)切除等治愈方法僅適合10%～20%的肝癌患者，在5 年內(nèi)復(fù)發(fā)率仍超過70%[1]。 所以尋找以腫瘤細(xì)胞特性為作用靶點(diǎn)的分子靶向治療有著特別重要的意義。 HSP90 抑制劑17-丙烯胺基-17-去甲氧格爾德霉素（17-AAG）對多種腫瘤細(xì)胞有抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用，但目前尚未見17-AAG 對肝癌細(xì)胞生長及凋亡影響的報(bào)道，本文探討17-AAG 對HepG2 細(xì)胞增殖、生長周期、誘導(dǎo)凋亡及對重組人血管內(nèi)皮生長因子相關(guān)蛋白（VEGF-C）的表達(dá)進(jìn)行初步探討，為17-AAG 治療肝癌的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細(xì)胞株HepG2 由延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供。 RPMI-1640 培養(yǎng)基（賽默飛世爾公司），17-AAG、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）及碘化丙啶（PI）（美國Sigma 公司）AnnexinV FITC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（美國BD pharmingen 公司），RNase A 酶（德國Merck 公司），胎牛血清（美國Hyclone 公司），兔抗人VEGF-C蛋白、兔二抗及DAB 顯色劑（武漢博士德公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取液氮保存的人肝癌HepG2 細(xì)胞在37℃恒溫水浴箱中快速復(fù)蘇，接種于內(nèi)含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)，選取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.2 MTT 法檢測細(xì)胞增殖能力 選取對數(shù)生長期的人肝癌HepG2 細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化，加完全培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，以每孔為3×103個(gè)細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h 后棄上清液，設(shè)無細(xì)胞孔作為空白組，不加藥孔為對照組，實(shí)驗(yàn)組17-AAG 濃度為0.63、1.25、2.5、5.0 μmol/L，每組設(shè)5 個(gè)平行孔。分別溫育24、48、72 h后，每孔加入20 μL 濃度為5 mg/mL 的MTT 溶液，培養(yǎng)4 h，吸凈上清液，每孔加入150 μL 二甲基亞砜（DMSO），振蕩10 min，使用酶標(biāo)儀測定波長為490 nm處的吸光度值，空白組調(diào)零。細(xì)胞增殖抑制率（%）＝（對照組OD 值-實(shí)驗(yàn)組OD 值）/對照組OD 值×100%。 以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3 次。

1.2.3 PI 染色觀察細(xì)胞核形態(tài) 人肝癌HepG2 細(xì)胞接種于內(nèi)有重鉻酸鉀處理過的蓋玻片的24 孔板內(nèi)培養(yǎng)。在細(xì)胞對數(shù)生長期時(shí)設(shè)對照組和實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)48 h后終止，去上清液，用PBS 洗滌3 次，用50 μg/mL 的PI 熒光染液在4℃冰箱中避光染色20 min 后，夾出蓋玻片蓋在載玻片上，用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核形態(tài)并拍照。

1.2.4 流式細(xì)胞儀分析 取對數(shù)生長期的人肝癌HepG2 細(xì)胞接種于6 孔板內(nèi)培養(yǎng)，設(shè)實(shí)驗(yàn)組和對照組，培養(yǎng)48 h 后胰酶消化，用磷酸鹽緩沖液（PBS）離心洗滌2 次。 ①細(xì)胞周期：預(yù)冷70%酒精固定，4℃過夜，離心，棄去固定液，然后加入PBS 含50 μg/mL 的PI，100 μg/mL RNase A 酶，0.2%Triton X-100 染色液，微量振蕩器上振蕩混勻，4℃避光孵育30 min，200 目不銹鋼篩網(wǎng)過濾后流式細(xì)胞儀檢測。 ②細(xì)胞凋亡：嚴(yán)格按照AnnexinV FITC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書步驟進(jìn)行。 兩個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.5 VEGF-C 蛋白表達(dá)的檢測 將人肝癌HepG2 細(xì)胞接種于內(nèi)有蓋玻片的6 孔板內(nèi)培養(yǎng)培養(yǎng)，設(shè)對照組和實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)48 h 后，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌3 次，用中性樹膠將細(xì)胞面朝上固定于載玻片上，采用免疫組化鏈霉親和素-生物素復(fù)合物 （SABC）法染色，胰酶抗原修復(fù)，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色。兔抗人VEGF-C 稀釋比例為1∶100，以PBS 代替一抗作為陰性對照。 結(jié)果判斷：細(xì)胞胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒判斷為陽性細(xì)胞，按照Fromowit 等綜合計(jì)分法在高倍鏡下對染色細(xì)胞著色反應(yīng)作結(jié)果判定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0 對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用方差分析，行t 檢驗(yàn)。 計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。 以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 17-AAG 對人肝癌HepG2 細(xì)胞生長的抑制作用

MTT 測定結(jié)果顯示，分別以0.63、1.25、2.5、5.0 μmol/L 4 個(gè)濃度的17-AAG 作用于人肝癌HepG2 細(xì)胞24、48、72 h 后，HepG2 細(xì)胞均有不同程度的抑制生長作用，各實(shí)驗(yàn)組增殖抑制率與對照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。其抑制作用經(jīng)方差分析，具有劑量和時(shí)間依賴關(guān)系，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 不同濃度的17-AAG 對人肝癌HepG2 細(xì)胞生長的抑制率（%，）

表1 不同濃度的17-AAG 對人肝癌HepG2 細(xì)胞生長的抑制率（%，）

注：與對照組比較，#P ＜0.05；17-AAG：17-丙烯胺基-17-去甲氧格爾德霉素

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2.2 PI 染色觀察凋亡細(xì)胞核形態(tài)變化

熒光顯微鏡下觀察17-AAG 不同濃度組48 h 后PI 染色下HepG2 細(xì)胞的形態(tài)變化（圖1）。 鏡下細(xì)胞核呈紅色熒光，對照組HepG2 細(xì)胞形態(tài)完整，細(xì)胞核大小一致，著色均勻；實(shí)驗(yàn)組可見HepG2 細(xì)胞體積變小，細(xì)胞核固縮，呈濃縮強(qiáng)熒光，并隨藥物濃度升高，細(xì)胞數(shù)下降，凋亡小體逐漸增多。

圖1 熒光顯微鏡下HepG2 的細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)變化（PI 熒光染色，100×）

2.3 17-AAG 對HepG2 細(xì)胞周期和凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，HepG2 細(xì)胞在17-AAG 48 h 作用下，隨藥物濃度的增加，G2/M 期的細(xì)胞比例增加，提示17-AAG 能使HepG2 細(xì)胞阻滯在G2/M 期，PI 染色法檢測細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示， 經(jīng)17-AAG作用48 h 后，不同濃度的17-AAG 均能使細(xì)胞被阻滯在G2/M 期。 細(xì)胞周期阻滯作用亦隨藥物濃度增加而升高。 肝癌HepG2 細(xì)胞凋亡率隨著藥物濃度的增加明顯高于對照組細(xì)胞，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意（P ＜0.05）。 見表2。

表2 17-AAG 對人肝癌HepG2 細(xì)胞周期和凋亡率的影響（%，）

表2 17-AAG 對人肝癌HepG2 細(xì)胞周期和凋亡率的影響（%，）

注：與對照組比較，＃P ＜0.05；17-AAG：17-丙烯胺基-17-去甲氧格爾德霉素

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2.4 免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測VEGF-C 蛋白表達(dá)結(jié)果

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，對照組HepG2 細(xì)胞VEGF-C 蛋白呈強(qiáng)陽性表達(dá)，棕黃色顆粒多，陽性細(xì)胞表達(dá)率高，見圖2A。17-AAG 作用HepG2 細(xì)胞48 h后，加藥細(xì)胞VEGF-C 蛋白與對照組比較，隨著17-AAG 濃度的增加，表達(dá)率及表達(dá)量呈逐漸降低趨勢。見圖2B～E。

圖2 17-AAG 處理HepG2 48 h 后VEGF-C 表達(dá)的影響（400×）

3 討論

肝癌是嚴(yán)重威脅著全球人類生命健康的疾病之一。近幾年，隨著腫瘤分子生物學(xué)研究的深入，分子靶向藥物已在多種腫瘤中進(jìn)行廣泛研究和應(yīng)用。 HSP90是一種高度保守的具有特殊分子伴侶的功能蛋白。HSP90 可以調(diào)節(jié)下游服務(wù)蛋白的穩(wěn)定性[2]。 還參與多重信號通路的調(diào)控以及細(xì)胞周期進(jìn)程，在致癌信號的傳導(dǎo)、血管的新生、抗細(xì)胞凋亡以及腫瘤轉(zhuǎn)移等方面有著重要的作用[3]。 抑制HSP90 可以消耗下游服務(wù)蛋白以及影響致癌的途徑，促進(jìn)凋亡的發(fā)揮和抗腫瘤的效應(yīng)[4]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，HSP90 抑制劑17-AAG 對白血病[5]、乳腺癌[6]、多發(fā)性骨髓瘤[7]、前列腺癌[8]等腫瘤有治療活性，并與多數(shù)細(xì)胞毒試劑、蛋白酶體抑制劑、組蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制劑和新型靶向藥物聯(lián)用具有協(xié)同或增強(qiáng)的效果[9]。 17-AAG 通過與ATP 特異性競爭ATP/ADP 位點(diǎn)，使HSP90 構(gòu)象改變導(dǎo)致效應(yīng)蛋白失活，從而發(fā)揮其抑制生長，促進(jìn)凋亡的作用[10]。 17-AAG還可誘導(dǎo)Flt3-ITD 的降解[11]，對有Flt3-ITD 的突變AML 患者有望改善其預(yù)后。 實(shí)驗(yàn)MTT 結(jié)果表明，HSP90 抑制劑17-AAG 對肝癌HepG2 細(xì)胞有抑制生長的作用，抑制作用隨著作用時(shí)間、藥物濃度的增加而增強(qiáng)。通過PI 熒光染色，觀察到17-AAG 作用過的HepG2 細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞核著色由大小均一變成體積小而深，并出現(xiàn)凋亡小體，提示17-AAG 對HepG2 細(xì)胞有抑制增殖并誘導(dǎo)凋亡的作用。本次試驗(yàn)通過細(xì)胞流式檢測，提示17-AAG 的體外抑制可能與阻滯HepG2 細(xì)胞在G2/M 期，并促進(jìn)凋亡有關(guān)。

血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）具有促進(jìn)惡性腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。 VEGF-C 是VEGF 家族中最早被發(fā)現(xiàn)的促淋巴管生成因子，與其受體VEGFR-3結(jié)合后促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的生長，主要為三條通路：①VEGF-3 胞內(nèi)的區(qū)酪氨酸Y1230/Y1231，發(fā)生自磷酸化、被識別、結(jié)合，通過誘導(dǎo)活化CRB2/ERX1/2和PI13K/AKT 信號通路，啟動DNA 復(fù)制，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增生；②VEGFR-3 酪氨酸殘基Y1063 發(fā)生磷酸化，誘導(dǎo)活化CRKⅠ/Ⅱ和c-Jun 氨基末端激酶Gnk1/2，引起細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng)的信號； ③通過蛋白激酶C（PKC）依賴的p42/p44 MAPK 活化途徑和PI3K/AKT磷酸化產(chǎn)生的信號[12]。 VEGFR-3 通過與VEGF-C 結(jié)合后，還調(diào)節(jié)血管滲透性，促進(jìn)腫瘤組織進(jìn)入淋巴管，抑制凋亡，導(dǎo)致腫瘤的高轉(zhuǎn)移率的發(fā)生[13]。 有研究報(bào)道HSP90 抑制劑根赤殼菌素類可以抑制VEGF 的表達(dá)[14]，17-AAG 可以通過阻斷STAT3 通路抑制胃癌和乳腺癌細(xì)胞VEGF 的表達(dá)[15]。 本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，VEGF-C 在人肝癌HepG2 細(xì)胞對照組中處于高表達(dá)，一定劑量的17-AAG 可以明顯下調(diào)VEGF-C 蛋白的表達(dá)。 提示VEGF-C 蛋白參與了肝癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移的相關(guān)生物學(xué)行為的調(diào)控，17-AAG 可以通過下調(diào)VEGF-C 蛋白的表達(dá)抑制淋巴管的生成，可能是17-AAG 抑制肝癌的機(jī)制之一。

總之，本次實(shí)驗(yàn)證實(shí)了HSP90 抑制劑17-AAG能夠抑制肝癌HepG2 細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)凋亡，并通過下調(diào)VEGF 蛋白阻礙腫瘤的侵襲。由于17-AAG 發(fā)揮抗腫瘤的機(jī)制很多，還需進(jìn)一步研究，為肝癌臨床上的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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