張 倩， 張加余， 董魯艷， 張紅霞， 喬延江， 盧建秋*

(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)科研實驗中心，北京 100029；2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102)

清開靈注射液是由八味藥組成的大復(fù)方，含有多種化學(xué)成分，主要包括環(huán)烯醚萜類、黃酮類、有機酸類等。其中綠原酸作為有機酸類成分的代表，具有抑菌、抗病毒、解熱消炎等作用，一般被當作金銀花藥材及制劑的定性、定量指標。目前有關(guān)清開靈注射液中有機酸類成分的測定大多以綠原酸為測定指標[1-3]。然而《中國藥典》2010年版和清開靈注射液質(zhì)量標準草案中并沒有對其進行質(zhì)量控制。本課題組在前期工作中發(fā)現(xiàn)注射液及相關(guān)藥味中含有多種綠原酸類成分[4-5]，該類成分分子結(jié)構(gòu)中存在酯鍵、不飽和雙鍵及多元酚，在提取、貯存過程中，受溫度、pH等的影響會通過水解和分子內(nèi)酯基遷移而發(fā)生異構(gòu)化[6-8]，導(dǎo)致該類成分制備難度較大、成本較高。而王智民課題組提出的用于多成分質(zhì)量控制的“一測多評”法[9]，克服了對照品不易得、檢測成本較高的難題，并成功應(yīng)用于丹參[10]、三黃片[11]等常用中藥及制劑的成分定量測定，同時該法被《中國藥典》2010年版采納收錄。為了更好地控制清開靈注射液產(chǎn)品質(zhì)量，實現(xiàn)多指標質(zhì)量控制，本研究采用“一測多評”法對清開靈注射液中6種綠原酸類成分進行測定，并對不同廠家、同一廠家不同批號的產(chǎn)品進行質(zhì)量評價。

1 儀器與試藥

Agilent 1100 高效液相色譜儀(美國Agilent 公司)；Waters2695_2998高效液相色譜儀(美國Waters公司)；R200D型電子分析天平(德國Sartorius公司)；Millipore Synergy UV型超純水機(美國Millipore公司)。

綠原酸對照品(批號：110753-200413)購于中國食品藥品檢定研究院；新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C對照品(純度分別為99.3%、99.8%、99.2%、98.9%、99.3%)均購于成都普瑞法科技有限公司；8個廠家清開靈注射液(編號分別為F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7、F8)，F(xiàn)6廠的11批清開靈注射液(批號分別為211005A、211405A、210905A、211605A、211505A、212005A、211705A、211305A、211105A、211205A、211805A)，均為市售產(chǎn)品。甲酸為分析純，乙腈為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 基本原理[9]在一定范圍(線性范圍)內(nèi)，成分的量(質(zhì)量或濃度)與檢測器響應(yīng)成正比，即f=W/A(W表示成分的量，A表示響應(yīng)值)。在多指標(s，a，b…，i…)質(zhì)量評價時，可以用樣品中某一典型成分(有對照品供應(yīng)，價廉易得、穩(wěn)定性較好)為內(nèi)參物(s)，建立該成分與其他成分(a，b…，i…)之間的相對校正因子，通過相對校正因子計算其他成分的量，此即“一測多評”法(QAMS)。

相對校正因子(fsi)的計算公式為：

(1)

式中Ai為樣品中待測成分i的峰面積，Ci為質(zhì)量濃度；As為樣品中內(nèi)參物s的峰面積，Cs為質(zhì)量濃度。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液的配制 分別取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為37.20、63.60、43.20、22.20、32.80、43.20 μg/mL的混合對照品貯備液，于4 ℃冰箱中儲存。

2.2.2 供試品溶液的配制 取各批次清開靈注射液，用0.45 μm微孔濾膜濾過, 取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件 色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫為30 ℃；流動相為0.1%甲酸水(A)-乙腈(B),線性梯度洗脫(0～15 min，0～10% B；15～22 min，10%～12% B；22～45 min，12%～18% B； 45～55 min，18%～23% B)；體積流量為0.5 mL/min；檢測波長為327 nm；進樣量為10 μL。結(jié)果如圖1所示。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性范圍 精密吸取上述混合對照品溶液，用甲醇稀釋至6個不同質(zhì)量濃度(1#、2#、3#、4#、5#、6#)，進樣分析，每個質(zhì)量濃度進樣3次，取平均值，以質(zhì)量濃度對峰面積均值進行回歸處理，得到6種成分的線性回歸方程，結(jié)果見表1。

1. 新綠原酸 2. 綠原酸 3. 隱綠原酸 4. 異綠原酸B 5. 異綠原酸A 6. 異綠原酸C1.neochlorogenic acid 2.chlorogenic acid 3.cryptochlorogenic acid 4. Isochlorogenic acid B 5. Isochlorogenic acid A 6. Isochlorogenic acid C

2.4.2 精密度考察 取同一混合對照品溶液連續(xù)進樣6次，記錄各成分的峰面積，結(jié)果6種綠原酸類成分峰面積的RSD均<3%，表明儀器的精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性考察 取同一批號清開靈注射液(010705A)，按“2.1.2”項下制備供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10 h進樣測定，計算各成分的量，結(jié)果6種綠原酸類成分的RSD均<3%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)，各成分較穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性考察 取同一批號清開靈注射液(010705A)，按“2.1.2”項下方法平行制備6份，進樣測定，計算各成分的量，結(jié)果6種綠原酸類成分的RSD均<3%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率考察 取含有量已知的同一批號清開靈注射液(010705A)6份，每份2.5 mL，分別精密加入新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C質(zhì)量濃度分別為17.60、9.30、15.20、3.60、1.48、4.02 μg/mL的混合對照品溶液2.5 mL，混勻，按上述色譜條件進行測定，計算各成分的量，結(jié)果6種成分的回收率在98.71%～102.05%。

2.5 相對校正因子的確定

2.5.1 待測成分相對校正因子的計算 根據(jù)公式(1)，以綠原酸為內(nèi)參物，分別計算其他5種成分的相對校正因子，結(jié)果見表2。

表1 線性關(guān)系結(jié)果

表2 相對校正因子計算結(jié)果(n=2)

2.5.2 校正因子的重現(xiàn)性考察 采用Zorbax SB-C18色譜柱，分別考察了Agilent 1100和Waters 2695_2998液相色譜系統(tǒng)；采用Agilent 1100液相色譜儀，考察了3種不同型號的色譜柱(Zorbax SB-C18、BDS Hypersil C18、Phenomenex Luna)；采用Agilent 1100液相色譜儀、Zorbax SB-C18柱，分別考察了不同柱溫(25、30、35 ℃)、不同體積流量(0.5、0.6、0.8 mL/min)對綠原酸類成分相對校正因子的影響，結(jié)果各成分的相對校正因子的重現(xiàn)性良好(RSD<5%)，結(jié)果見表3。

表3 相對校正因子重現(xiàn)性考察結(jié)果(n=2)

2.5.3 相對校正因子的確定 根據(jù)《一測多評法建立的技術(shù)指南》[9]，綜合上述影響相對校正因子的因素，將各次試驗獲得的相對校正因子取平均值，最終確定新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B及異綠原酸C的相對校正因子分別為0.934、0.958、0.722、1.011、0.860。

2.6 待測色譜峰的定位 本研究采用相對保留值法進行綠原酸類成分色譜峰的定位。結(jié)果表明相對保留值的波動較小，其RSD均小于5%，結(jié)果見表4。

表4 各成分的相對保留值(n=2)

2.7 “一測多評”法與外標法測定結(jié)果的比較 分別精密吸取“2.1.2”項下不同廠家及同一廠家不同批次的清開靈注射液10 μL注入高效液相色譜儀，測定。采用外標法和“一測多評”法計算清開靈注射液中6種綠原酸類成分的量，結(jié)果見表5～6。

表5 8個廠家注射液中的綠原酸類成分測定結(jié)果(mg·mL-1，n=2)

表6 同一廠家(F6)不同批次注射液中的綠原酸類成分測定結(jié)果(mg·mL-1，n=2)

外標法與“一測多評”所測結(jié)果經(jīng)t檢驗和Pearson相關(guān)分析，兩種方法測得的成分量沒有顯著性差異。

8個廠家注射液中綠原酸類成分的量存在較大差異，其中異綠原酸C和異綠原酸B量的最低值與最高值相差分別達14倍和20倍之多，其他4種成分相差約7～10倍。同一廠家不同批次綠原酸類成分的量也存在一定差異，各成分量最低值與最高值相差約3～4倍。

3 討論

3.1 相對于其他5種有機酸類成分，綠原酸常作為金銀花藥材及含金銀花的中藥制劑中主要指標性成分，且該成分比較常見、價廉易得，因此選取綠原酸作為內(nèi)參物，建立該成分與其他5種有機酸的相對校正因子。

3.2 采用“一測多評”法進行多成分的質(zhì)量評價，各成分相對校正因子的獲得和待測成分色譜峰的定位至關(guān)重要。本實驗針對影響相對校正因子重現(xiàn)性的儀器、色譜柱、柱溫、體積流量進行了考察，結(jié)果均表明本實驗所獲得的相對較正因子具有較好的可靠性。在進行待測成分色譜峰定位時，分別對相對保留值和保留時間差進行了考察，結(jié)果利用保留時間差進行定位時，新綠原酸和隱綠原酸的RSD大于10%，不符合要求。但采用相對保留值結(jié)果良好，6種成分的RSD均小于5%，最終選擇相對保留值作為定位色譜峰的依據(jù)。

3.3 不同廠家的注射液中綠原酸類成分的量差異較大，可能是由于產(chǎn)品的原藥材不同或生產(chǎn)工藝不同造成的。為保證清開靈注射液的質(zhì)量，應(yīng)對其生產(chǎn)工藝進行統(tǒng)一，加強原藥材的質(zhì)量控制及中間體、成品的監(jiān)測。

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