張立超， 李士春， 云 才， 尤錫東， 羅 軍

(1.北京市石景山醫(yī)院(首都醫(yī)科大學(xué)石景山教學(xué)醫(yī)院)，北京100043 2.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006)

骨質(zhì)疏松(osteoporosis)是一種以骨量低下、骨骼微結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致骨脆性增加，易發(fā)生骨折為特征的全身性疾病。2001年美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(NIH)提出骨質(zhì)疏松癥是以骨強(qiáng)度下降、骨折風(fēng)險(xiǎn)性增加為特性的骨骼系統(tǒng)疾病，骨強(qiáng)度反映了骨骼的兩個(gè)主要方面，即骨密度與骨質(zhì)量[1]。究其原因，主要為成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞之間的失平衡，一方面為成骨細(xì)胞形成不足，另一方面為破骨細(xì)胞破壞過(guò)多[2]。目前，骨質(zhì)疏松癥的體外研究主要是針對(duì)骨組織的3種主要細(xì)胞進(jìn)行研究，即成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和骨細(xì)胞，其中，成骨細(xì)胞來(lái)源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，能夠分泌很多調(diào)節(jié)骨基質(zhì)鈣化的酶以及調(diào)節(jié)自身與破骨細(xì)胞增殖、分化的許多細(xì)胞因子，因其特殊的生物學(xué)特性，現(xiàn)已成為了目前抗骨質(zhì)疏松體外研究方面的重要工具細(xì)胞[3]。本實(shí)驗(yàn)是通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究藥物綠原酸對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響尋找骨質(zhì)疏松新的防治手段。

綠原酸(chlorogenic acid)是由咖啡酸(caffeic acid)與奎尼酸(quinic acid)組成的縮酚酸，別名咖啡鞣酸、3-咖啡酰奎酸、氯原酸，分子式為C16H18O9，相對(duì)分子質(zhì)量354.31，廣泛存在于高等雙子葉植物和蕨類(lèi)植物中，其中主要來(lái)源于杜仲科植物的葉、金銀花、向日葵、咖啡、可可樹(shù)等[4]。綠原酸具有廣泛的生物活性，現(xiàn)代科學(xué)對(duì)綠原酸生物活性的研究已深入到食品、保健、醫(yī)藥和日用化工等多個(gè)領(lǐng)域。此外，它還是一種重要的生物活性物質(zhì)，具有抗菌、抗病毒、增高白細(xì)胞、保肝利膽、抗腫瘤、降血壓、降血脂、清除自由基和興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等作用。劉哲等發(fā)現(xiàn)應(yīng)用綠原酸對(duì)體外培養(yǎng)的干細(xì)胞來(lái)源的軟骨樣細(xì)胞具有抗凋亡作用[5]。本實(shí)驗(yàn)組前期研究表明，杜仲葉提取物(含綠原酸)不僅能提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)的增殖作用及向成骨細(xì)胞的骨性分化能力，而且能提高成骨細(xì)胞的增殖作用[6]，而且在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中對(duì)去勢(shì)骨質(zhì)疏松的大鼠代謝有明顯作用[7]，Zhang等也在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)杜仲能夠預(yù)防去勢(shì)大鼠的骨質(zhì)疏松[8]。因此綠原酸作為杜仲葉中的主要單體成分，是否對(duì)大鼠成骨細(xì)胞也具有相同的增殖作用是本研究的主要目的。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)綠原酸對(duì)大鼠成骨細(xì)胞具有增殖作用，并且這種增殖作用是通過(guò)Shp2/Erk(Src homology region 2-containing protein tyrosine phosphatase 2/ extracellular-signal regulated kinase)途徑實(shí)現(xiàn)的。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取新生24～48 h SD大鼠乳鼠，雌雄不限(由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(贛)2010-0002)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合2006年科技部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)意見(jiàn)》規(guī)定。

1.2 主要試劑 綠原酸購(gòu)自Sigma-Aldrich(Shanghai) Trading Co.,Ltd，產(chǎn)品編號(hào)C3878，形狀固體，熔點(diǎn)/凝固點(diǎn)210 ℃。無(wú)酚紅高糖DMEM培養(yǎng)基、低糖培養(yǎng)基和胎牛血清均購(gòu)自Hyclone；Phospho-SHP-2 (Tyr580)(#5431)、p-p44/42 MAPK(T202/Y204)(D13.14.4E)(#4370S)購(gòu)自cell signaling公司；Shp2(sc-280)、二抗goat-anti-mouse(sc-2005)、goat-anti-rabbit(sc-2040)均購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司；Shp2抑制劑NSC87887購(gòu)自TOCRIS公司；鼠β-Actin抗體、MTT粉末、PBS粉末購(gòu)自康為世紀(jì)；DMSO、Ⅱ型膠原酶和胰蛋白酶購(gòu)自solarbio；堿性磷酸酶染色試劑盒、western blot凝膠試劑盒、ECL顯色試劑盒購(gòu)自Sigma公司。

1.3 主要儀器 實(shí)驗(yàn)手術(shù)器械(常州世興醫(yī)療器械有限公司)；電熱恒溫水溫箱(上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠)；臺(tái)式低速冷凍離心機(jī)(美國(guó)SIGMA公司)；倒置相差顯微鏡(日本Olympus)；二氧化碳孵箱(美國(guó)Forman和Fisher公司)；超凈工作臺(tái)(美國(guó)Forman公司)；高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman)；脫色搖床(北京六一儀器廠)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 大鼠成骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、染色鑒定

2.1.1 選取新生24～48 h SD大鼠乳鼠3～4只，乙醚麻醉后頸椎脫臼處死后，完全浸入75%醫(yī)用酒精中8～10 min，無(wú)菌超凈臺(tái)中剪下顱蓋骨，置于含磷酸緩沖液(PBS)的10 cm直徑培養(yǎng)皿中，充分剔除附著于顱骨面上的軟組織，并用PBS清洗3遍，后將顱蓋骨剪成1 mm×1 mm的碎塊，加入3～4 mL胰蛋白酶，37 ℃震蕩消化30 min，離心去酶后加入3 mL Ⅱ型膠原酶震蕩消化30 min，加入10%胎牛血清DMEM終止消化，離心去酶后加入4 mL 10%胎牛血清DMEM充分吹打，吹打均勻后種于6 cm直徑培養(yǎng)皿中，37 ℃，5% CO2孵箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后(約48～72 h)，更換新鮮培養(yǎng)液，去除未貼壁細(xì)胞及部分雜質(zhì)，以后每2～3天換液，細(xì)胞融合80%的時(shí)候1∶2傳代，選取第3至第5代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 成骨細(xì)胞的堿性磷酸酶染色，量取45 mL去離子水，溫度18～26 ℃之間，準(zhǔn)備重氮鹽溶液，緩慢翻轉(zhuǎn)混勻，并加入到去離子水中，加1 mL Naphthol A-S-B1 Alkaline溶液到稀釋的重氮鹽溶液中，充分混勻后置于玻片染色缸中，將檸檬酸-丙酮-甲醛固定劑預(yù)熱到18～26 ℃之間，將玻片置于固定劑中，去離子水漂洗45 s，后玻片浸入堿性磷酸酶混合物中避光孵育15 min，后用去離子水漂洗2 min，復(fù)染2 min后自來(lái)水漂洗并自然干燥，倒置光學(xué)顯微鏡下觀察。

2.2 四甲基偶氮唑鹽法(MTT)檢測(cè)細(xì)胞增殖 將MTT粉末避光條件下以PBS為溶媒配置成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的MTT液，振蕩器震蕩充分混勻，過(guò)濾器過(guò)濾后置于10 mL離心管中避光4 ℃保存，將第3代無(wú)血清的成骨細(xì)胞均液均勻種于96孔板中，每孔20 μL，2 000～6 000個(gè)細(xì)胞，37 ℃、5%CO2、無(wú)血清低糖DMEM條件下饑餓1 d后，設(shè)4組分別加入濃度梯度為0、 0.1、1、10 μmol/L的綠原酸，每組設(shè)6個(gè)副孔，并設(shè)調(diào)零孔，繼續(xù)孵育24 h后棄去培養(yǎng)液，并用PBS沖洗3遍，以避免藥物與MTT液反應(yīng)，每孔加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h后每孔加入150 μL 二甲基亞砜(DMSO)，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，用酶標(biāo)儀在490 nm處檢測(cè)OD值。

2.3 免疫印記方法(W B) 以50%密度的細(xì)胞鋪板于60 mm培養(yǎng)皿，第2天用無(wú)血清無(wú)酚紅的培養(yǎng)基饑餓大鼠成骨細(xì)胞6 h后，一組分別以0、 0.1、1、10 μmol/L 4種不同藥物濃度即A、B、C、D 4組干預(yù)大鼠成骨細(xì)胞2 h；另一組用10 μmol/L Shp2抑制劑即NSC87887預(yù)處理2 h后加入0.1 μmol/L綠原酸干預(yù)2 h，后加有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液至于冰上，分別收集細(xì)胞， 提取總蛋白， 4 ℃ 12 000 r /m離心10 min，取上清液，使用BCA試劑在波長(zhǎng)為560 nm條件下測(cè)定蛋白OD值。取適量蛋白樣品(約30 μg左右)進(jìn)行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上， 5%脫脂奶粉室溫下振蕩孵育封閉1 h。加入一抗4 ℃過(guò)夜孵育，TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，然后二抗室溫孵育1 h，再TBST洗膜3次，每次10 min，最后增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色。根據(jù)目的條帶判斷綠原酸對(duì)目的蛋白p-Shp2(Tyr580)、Shp2、P-Erk和Erk表達(dá)情況影響。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果采用均值比較分析；圖片的處理采用Adobo Photoshop CS4處理。

3 結(jié)果

3.1 原代培養(yǎng)出細(xì)胞證實(shí)為大鼠成骨細(xì)胞 大鼠成骨細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)多為梭形或不規(guī)則形，胞漿透明，核仁1～2個(gè),符合大鼠成骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征(圖1)；堿性磷酸酶(ALP)細(xì)胞染色呈紫紅色、即陽(yáng)性反應(yīng)，證實(shí)成骨細(xì)胞具有分泌ALP活性，符合成骨細(xì)胞生物學(xué)特性(圖2)。

圖1 大鼠成骨細(xì)胞形態(tài)圖

圖2 大鼠成骨細(xì)胞堿性磷酸酶染色圖

3.2 綠原酸促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞的增殖 MTT法檢測(cè)綠原酸對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖的影響，本研究發(fā)現(xiàn)綠原酸在0 ～ 1 μmol/L濃度時(shí)可以促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞的增殖，并具有濃度依賴(lài)性，但值得注意的是在濃度為10 μmol/L時(shí)反而相對(duì)有所下降(圖3)。

3.3 綠原酸通過(guò)激活Shp2和Erk1/2而促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞的增殖 綠原酸處理大鼠成骨細(xì)胞2 h時(shí)可以促進(jìn)Shp2-Tyr580的磷酸化和Erk的活性，并具有濃度依賴(lài)性，同樣也是在0 ～ 1 μmol/L時(shí)作用逐漸增大，10 μmol/L時(shí)相對(duì)有所下降(圖3)。

圖3 不同藥物濃度綠原酸對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖的影響

3.4 不同濃度綠原酸對(duì)大鼠成骨細(xì)胞P-Shp2、Shp2、P-Erk、Erk蛋白表達(dá)情況影響 圖4以0， 0.1，1，10 μmol/L 4種不同藥物濃度的綠原酸干預(yù)大鼠成骨細(xì)胞后western blot 檢測(cè)相應(yīng)蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示在濃度0～1 μmol/L時(shí)作用逐漸增大，但濃度在10 μmol/L時(shí)相對(duì)有所下降。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，圖中所示代表一般性結(jié)果(注：P代表蛋白磷酸化)。

圖4 示western blot 檢測(cè)相應(yīng)蛋白的表達(dá)情況(P代表磷酸化)

3.5 Shp2抑制劑阻斷綠原酸的促進(jìn)作用 大鼠成骨細(xì)胞用無(wú)血清無(wú)酚紅高糖DMEM饑餓6 h，中間加10 μmol/L Shp2抑制劑NSC87887預(yù)處理2 h，而后分別加入0、0.1 μmol/L綠原酸，10 μmol/L NSC87887，0.1 μmol/L綠原酸+10 μmol/L NSC87887處理細(xì)胞，2 d后MTT法檢測(cè)大鼠成骨細(xì)胞的增殖情況；結(jié)果顯示：Shp2抑制劑NSC87887抑制濃度為0.1 μmol/L的綠原酸對(duì)大鼠成骨細(xì)胞的促增殖作用，并阻斷了其對(duì)Erk1/2活化的促進(jìn)作用。

圖5 Shp2抑制劑阻斷綠原酸對(duì)大鼠成骨細(xì)胞的促增殖作用

圖6 Shp2抑制劑通過(guò)抑制ERK磷酸化阻斷綠原酸的促增值作用(P代表磷酸化，ACTIN代表內(nèi)參蛋白)

Western blot結(jié)果顯示：大鼠成骨細(xì)胞同樣饑餓6 h，中間加10 μmol/L Shp2抑制劑NSC87887預(yù)處理2 h，而后分別加入0、0.1 μmol/L綠原酸，10 μmol/L NSC87887，0.1 μmol/L綠原酸+10 μmol/L NSC87887處理細(xì)胞，western blot 檢測(cè)P-Erk、Erk蛋白表達(dá)情況。結(jié)果示Shp2抑制劑阻斷綠原酸的促進(jìn)作用。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，圖中所示代表一般性結(jié)果。

4 討論與結(jié)論

Shp2是一種由PTPN11基因編碼的非受體型蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶，調(diào)節(jié)Ras信號(hào)傳導(dǎo)通路，而Ras途徑參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和生存，其具體過(guò)程為:多種生長(zhǎng)因子與受體結(jié)合后，經(jīng)由Ras-Raf-MEK-ERK級(jí)聯(lián)反應(yīng)，將信號(hào)傳到細(xì)胞內(nèi)，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化[9-11]。ERK途徑是細(xì)胞增殖調(diào)控中最為重要的信號(hào)通路，其具體過(guò)程為:多種生長(zhǎng)因子與受體結(jié)合后，經(jīng)由Ras-Raf-MEK-ERK級(jí)聯(lián)反應(yīng)，將信號(hào)傳到細(xì)胞內(nèi)，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化。研究表明生長(zhǎng)因子的受體主要為酪氨酸激酶受體，在受體結(jié)合生長(zhǎng)因子后，其構(gòu)象發(fā)生改變，形成二聚體，同時(shí)激活受體的酪氨酸激酶活性，引起自身酪氨酸的磷酸化，磷酸化的酪氨酸可以激活蛋白激酶C(PKC)，或通過(guò)與介導(dǎo)蛋白Grb2的結(jié)合來(lái)招募Ras蛋白鳥(niǎo)昔酸釋放因子SOS，活化細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的Ras蛋白，進(jìn)而活化Raf，通過(guò)無(wú)活性的Ras-GDP向有活性的Ras-GTP狀態(tài)的變換，從而將外界信號(hào)從跨膜受體傳遞到下游蛋白激酶中，最終能誘導(dǎo)細(xì)胞周期素D1(Cyclin D1)表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞分裂[12-13]。有研究表明，包括胰島素或胰島素樣生長(zhǎng)因子1等生長(zhǎng)因子類(lèi)物質(zhì)能夠通過(guò)此Erk和Akt的信號(hào)途徑促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖與分化[14]。Yan等發(fā)現(xiàn)一定的機(jī)械應(yīng)力調(diào)控的成骨細(xì)胞增殖也是通過(guò)激活ERK實(shí)現(xiàn)的[15]。說(shuō)明成骨細(xì)胞的增殖與Erk信號(hào)途徑有著非常重要的關(guān)系。

本研究發(fā)現(xiàn)綠原酸可以促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞的增殖，濃度0 ～ 1 μmol/L時(shí)增殖逐漸增加，但在濃度為10 μmol/L時(shí)反而相對(duì)有所下降，同時(shí)western blot結(jié)果顯示綠原酸可以促進(jìn)p-Shp2(Tyr580)和Erk的活化水平，同樣在濃度0 ～ 1 μmol/L時(shí)促進(jìn)作用逐漸增加，濃度為10 μmol/L時(shí)，促進(jìn)作用相對(duì)低濃度又有所下降，這就表明在0 ～ 1 μmol/L之間可能有一個(gè)最佳濃度的節(jié)點(diǎn)；10 μmol/L的Shp2抑制劑NSC87887可以抑制綠原酸對(duì)大鼠成骨細(xì)胞促增殖的作用，并阻斷綠原酸對(duì)P-Shp2(Tyr580)和Erk的活化水平的促進(jìn)作用，表明Shp2的激活在綠原酸對(duì)大鼠成骨細(xì)胞的促增殖作用中起著非常關(guān)鍵的作用，也可以說(shuō)Shp2是綠原酸激活Erk的重要橋梁。

以上結(jié)果表明，綠原酸可以通過(guò)激活Shp2繼而促進(jìn)Erk的活性，從而促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞增殖，表明Shp2的磷酸化激活在其中起著一個(gè)關(guān)鍵的作用；但綠原酸的這種促增殖作用過(guò)程中是否充當(dāng)著類(lèi)似VEGF、EGF、胰島素等生長(zhǎng)因子的作用亦或是上調(diào)相關(guān)因子的受體，信號(hào)蛋白Shp2是否是通過(guò)單獨(dú)激活下游蛋白或者與其他蛋白形成復(fù)合物發(fā)揮作用還有待更深入一步研究，這將有助于我們對(duì)藥物對(duì)細(xì)胞促增殖作用機(jī)制的進(jìn)一步了解，并能為臨床上抗骨質(zhì)疏松治療的靶向治療提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)，為詢(xún)證醫(yī)學(xué)提供佐證。

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