亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        亞低溫對腦出血后非caspase酶依賴性凋亡通路的影響

        2014-04-01 02:37:28李曉玲王滿俠張博原鉑堯張雯靜張淑娟
        關(guān)鍵詞:神經(jīng)細胞生理鹽水陽性細胞

        李曉玲 王滿俠 張博 原鉑堯 張雯靜 張淑娟

        腦出血后神經(jīng)功能惡化的原因有腦水腫的形成,神經(jīng)細胞死亡等。凋亡在腦出血后神經(jīng)細胞的損傷中發(fā)揮重要的作用。腦出血后線粒體釋放細胞色素C,激活各種胱冬酶,導(dǎo)致蛋白酶級鏈切割最終發(fā)生凋亡,此為經(jīng)典的caspase依賴性通路。近年來研究發(fā)現(xiàn)另一種重要的線粒體內(nèi)介導(dǎo)凋亡的蛋白——AIF,其可以不依賴caspase-3的活性而通過另一條更為原始、更保守的途徑來誘導(dǎo)凋亡。研究證實,AIF在神經(jīng)細胞凋亡中發(fā)揮重要的作用[1]。亞低溫對神經(jīng)元的凋亡有明顯的抑制作用[2],但其具體機制尚未明確。目前關(guān)于亞低溫對caspase依賴性通路的研究較多,但對AIF的研究尚不多見。本實驗通過研究亞低溫對非caspase依賴性通路中關(guān)鍵蛋白AIF的影響以進一步探討其減輕神經(jīng)元凋亡的機制。

        1 材料和方法

        1.1實驗動物SD雄性大鼠108只,鼠齡10~12個月,體質(zhì)量(275±25)g,由北京天壇醫(yī)院動物房提供(合格證書編號-604821)。隨機分為生理鹽水組、腦出血組和亞低溫+腦出血組(以下簡稱亞低溫組),每組再分為腦出血24 h、72 h 、7 d亞組,每個亞組12只。

        1.2方法

        1.2.1腦出血模型制備:以10%(質(zhì)量濃度)水合氯醛按體質(zhì)量400 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠,俯臥位固定于動物腦立體定位儀(美國Benchmark)上。行頭皮正中切口,切開皮膚,剝離骨膜,暴露前囟及冠狀縫,前囟后1.0 mm中線右3.0 mm處為注射穿刺點(右側(cè)基底節(jié)區(qū)尾狀核),用牙科鉆穿透顱骨,用微量注射器(寧波三愛)抽取股動脈血50 μL,將注射器固定于立體定位儀上,將針尖置于穿刺點平顱骨,垂直進針5.5 mm后,以微量注射泵(美國Benchmark)緩慢注入自體血。生理鹽水組以同樣方法注入等量生理鹽水。造模成功標(biāo)準(zhǔn):以腦組織中出現(xiàn)明顯的圓形、橢圓形或不規(guī)則形的血腫為模型成功標(biāo)準(zhǔn)。同時參照Longa及Bederson五級評分法,評分為2~3分者作為成功模型入組。摒除血液針道反流進入腦室或死亡者。

        1.2.2亞低溫處理方法:將亞低溫組大鼠于腦出血后10 min內(nèi)放在冰毯上用冰塊覆蓋降溫,采用醫(yī)用電子溫度計(大連歐姆龍)間隔15 min監(jiān)測大鼠肛溫,約15 min左右將大鼠肛溫降至(33±1.0)℃, 6 h后在室溫下自動復(fù)溫。腦出血組及生理鹽水組肛溫維持在(37.5±1.0)℃,并于大鼠蘇醒后(一般為3 h左右)再次給予10%(質(zhì)量濃度)水合氯醛按體質(zhì)量150 mg/kg腹腔注射麻醉。

        1.2.3冷凍切片制備:4%(質(zhì)量濃度)多聚甲醛溶液250 mL經(jīng)心腔灌注固定,斷頭取腦,沿針孔冠狀面切開,將針孔后2 mm腦標(biāo)本置于4%(質(zhì)量濃度)多聚甲醛溶液中固定72 h,后用20%(質(zhì)量濃度)蔗糖溶液脫水固定72 h,在注射針道平面切取腦組織塊后以冷凍切片機(Leica CM1850)行冷凍切片,切片厚10 μm。

        1.2.4AIF免疫組化染色:(1)滴加3%(體積分數(shù))過氧化氫抑制5 min,滴加一抗1∶100(羊抗小鼠AIF抗體,購自Santa Cruz公司,貨號sc-9416),4℃過夜;(2)滴加生物素標(biāo)記的二抗(DAKO K0690);(3)滴加SABC;(4)DAB顯色;(5)蘇木素復(fù)染,脫水、透明、封片、鏡檢。采用彩色圖像分析儀(BI-2000)進行分析,切片置于高倍鏡(400倍)下,隨機選取每張切片血腫周圍5個視野,測定AIF平均吸光度值。

        1.2.5TUNNEL染色:參照原位細胞凋亡檢測說明書進行檢測(試劑盒購自武漢博士德公司)。主要步驟包括:(1)滴加3%(體積分數(shù))過氧化氫抑制30 min;(2)蛋白酶K 37℃消化30 min;(3)TUNNEL反應(yīng)混合液,37℃孵育;(4)加入酶標(biāo)記熒光素抗體37℃孵育;(5)DAB顯色,脫水、透明、封片、鏡檢。采用彩色圖像分析儀(BI-2000)進行分析,切片置于高倍鏡(400倍)下,隨機選取每張切片血腫周圍5個視野,計數(shù)TUNNEL染色陽性細胞數(shù)。

        1.3統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用Dunnett-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1各組AIF表達比較生理鹽水組(注射針道周圍腦組織)、腦出血組及亞低溫組大鼠腦組織可見AIF免疫陽性細胞。生理鹽水組各時間點間腦組織AIF表達無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),而腦出血組和亞低溫組各時間點AIF表達有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與生理鹽水組比較,腦出血組和亞低溫組各時間點AIF表達均升高(P<0.05),而亞低溫組各時間點AIF表達較腦出血組降低(P<0.05)。腦出血組AIF的表達于出血后24 h增加,72 h達高峰,7 d后下降(P<0.05)。具體結(jié)果見(表1)。

        2.2各組TUNNEL陽性細胞比較生理鹽水組(注射針道周圍腦組織)、腦出血組及亞低溫組大鼠腦組織可見TUNNEL陽性細胞。生理鹽水組各時間點間腦組織TUNNEL陽性細胞計數(shù)比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),而腦出血組和亞低溫組各時間點TUNNEL陽性細胞計數(shù)比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與生理鹽水組比較,腦出血組和亞低溫組各時間點TUNNEL陽性細胞計數(shù)均升高(P<0.01),而亞低溫組各時間點TUNNEL陽性細胞計數(shù)較腦出血組降低(P<0.01)。腦出血組TUNNEL陽性細胞計數(shù)于出血后24 h增加,72 h達高峰,7 d后下降(P<0.01)。具體結(jié)果見(表2)。

        3 討論

        凋亡誘導(dǎo)因子是一種凋亡誘導(dǎo)蛋白,與細胞色素C一樣位于線粒體膜,死亡信號誘導(dǎo)AIF釋放。AIF在多種組織中廣泛分布,其基因定位于X染色體上,在人類定位在Xq25-26,在大鼠位于X染色體A6區(qū)。AIF是一個相對分子質(zhì)量為57的核黃素蛋白[3],前體蛋白在胞質(zhì)中合成后,通過其N端的線粒體定位信號有效地穿入線粒體膜間隙,進而成為具有凋亡潛能的成熟AIF分子[4]。在死亡信號或細胞應(yīng)激的刺激下,線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔開放,釋放AIF到細胞質(zhì)溶質(zhì)中,具有核定位信號序列的AIF便進入細胞核內(nèi),引起染色質(zhì)的初步凝集和DNA大量片段化(約50 kb),進而引發(fā)不依賴于caspase的細胞凋亡途徑[4]。AIF的促凋亡作用還在于AIF還可導(dǎo)致線粒體腫脹,改變線粒體外膜的通透性引起AIF和細胞色素C的進一步釋放,形成正反饋促進凋亡。

        表 1 各組大鼠腦出血后不同時間點腦組織AIF表達(吸光度)比較

        注:與生理鹽水組比較,*P<0.05;與腦出血組比較,△P<0.05;與同組72 h時間點比較,#P<0.05

        表 2 各組大鼠腦出血后不同時間點腦組織TUNNEL陽性細胞計數(shù)比較

        注:與生理鹽水組比較,*P<0.01;與腦出血組比較,△P<0.01;與同組72 h時間點比較,#P<0.01

        腦出血后由于血腫的占位效應(yīng)會造成出血同側(cè)及對側(cè)部位均有不同程度的腦缺血現(xiàn)象。目前已經(jīng)有大量的研究證實局灶性腦缺血可以引起神經(jīng)細胞凋亡。腦出血后神經(jīng)細胞的死亡存在兩種形式即壞死和凋亡。本實驗結(jié)果顯示,生理鹽水組針道周圍可以看TUNNEL染色陽性細胞和AIF表達,表明生理鹽水導(dǎo)致的水腫的占位效應(yīng)可引起針道周圍神經(jīng)細胞凋亡,但在3個時間點其表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義;腦出血組、亞低溫組在3個時間點TUNNEL染色陽性細胞和AIF表達均低于生理鹽水組。腦出血組在24 h時血腫周圍可看TUNNEL染色陽性細胞,在72 h時其表達達高峰,7 d后下降。這與腦出血后凋亡細胞的形成與腦水腫的變化趨勢一致。由此推測,腦出血后引起神經(jīng)細胞凋亡與腦損傷后caspase-3的表達增加有關(guān)[5]。本實驗發(fā)現(xiàn),腦出血大鼠腦組織AIF表達于出血后24 h開始增加,72 h達高峰,7 d后下降,但均高于生理鹽水組,其變化同TUNNEL染色陽性細胞變化結(jié)果相一致。表明腦出血后在各種死亡信號或者細胞脅迫的刺激下,神經(jīng)細胞的凋亡與AIF的合成增加有關(guān);另外,也與線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔開放增加引起AIF的釋放有關(guān)。實際上細胞凋亡的控制通過整個信號網(wǎng)絡(luò)完成,多種信號途徑相互作用,所以其具體機制比較復(fù)雜,推測可能是通過對多個途徑的影響來促進出血后凋亡的發(fā)生。

        本實驗結(jié)果顯示,亞低溫組TUNNEL染色陽性細胞表達在腦出血后3個時間點均低于腦出血組,提示亞低溫可減輕腦出血后的神經(jīng)元凋亡。其機制可能與亞低溫可減輕腦出血后的炎性反應(yīng)、抑制神經(jīng)元凋亡的始動[6]有關(guān);也可能與增強Bcl-2的表達[7]、抑制Bax基因表達[8]、抑制 caspase與 Fas蛋白活性有關(guān)??梢?,既往針對亞低溫對caspase依賴性通路的影響研究較多。本實驗通過觀察亞低溫對非caspase依賴性通路中的關(guān)鍵蛋白AIF的影響,以進一步探討其減輕神經(jīng)元凋亡的機制。在本實驗中亞低溫組大鼠腦組織AIF的表達于24 h、72 h、7 d時均低于腦出血組,與TUNNEL染色陽性細胞的變化一致,提示亞低溫可以通過減少腦出血后各種死亡信號和細胞刺激引起AIF表達下降,延緩AIF激活,從而減少神經(jīng)細胞凋亡,如阻斷其引起核DNA凝聚斷裂為長的DNA片段導(dǎo)致的細胞凋亡,其具體機制可能為:亞低溫可以保持線粒體的完整性,抑制線粒體通透性增加釋放AIF至細胞核中,從而阻斷AIF引起的DNA大規(guī)模斷裂;也可能與亞低溫阻斷AIF的核轉(zhuǎn)移有關(guān)。還有研究顯示亞低溫可通過抑制腦缺血再關(guān)注后AIF的轉(zhuǎn)錄而減少神經(jīng)細胞凋亡[9]。本研究結(jié)果提示亞低溫可有效延緩腦出血后神經(jīng)細胞凋亡的進程,發(fā)揮腦保護作用。

        總之,腦出血后的神經(jīng)元凋亡是由各種凋亡刺激信號始動,受細胞內(nèi)源性基因、酶和信號傳導(dǎo)途徑等調(diào)控的瀑布式激活過程。亞低溫抑制神經(jīng)元凋亡,可能是對其多個環(huán)節(jié)的影響,具體有待于進一步研究。

        [1]李澤東,馬靜萍.阿司匹林預(yù)處理對大鼠腦缺血再灌注后caspase3和AIF表達的影響[J]. 中國神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志, 2009,16:281-284.

        [2]Shibano T, Morimoto Y, Kemmotsu O,et al. Effects of mild and moderate hypothermia on apoptosis in neuronal PC12 cells[J]. Br J Anaesth,2002,89:301-305.

        [3]Lorenzo HK, Susin SA, Penninger J, et al. Apoptosis inducing factor: a phylogenetically old, capase independent effector of cell death[J]. Cell Death Differ,1999,6:516-524.

        [4]Norberg E, Orrenius S,Zhivotovsky B. Mitochondrial regulation of cell death:Processing of apoptosis-inducing factor(AIF)[J]. Biochem Biophys Res Commun,2010,396:95-100.

        [5]Ferrer I, Planas AM. Signaling of cell death and cell survival following focal cerebral ischemia:life and death struggle in the penumbra [J] . Neuropathol Exp Neurol,2003,62:329-339.

        [6]Marier CM, Ahen K, Cheng ML, et al. Optimal depth and duration of mild hypothermia in a focal model of transient cerebral ischemia effects on neurologic outcome, infarct size, apoptosis, and inflammation[J]. Stroke,1998,29:2171-2180.

        [7]Hocsak E, Racz B, Szabo A,et al.TIP47 confers resistance to taxol-inducing cell death by preventing the nuclear translocation of AIF and endonuclease G[J].Eur J Cell Biol, 2010,89:853-856.

        [8]Cabon L,Galan-Malo P,Bouharrour A,et al. BID regulates AIF-medicated caspase-independent necroptosis by promoting BAX activation[J]. Cell Death Differ,2012,19:245-256.

        [9]張麗,蘇志強,陳麗霞,等.亞低溫通過抑制兩種凋亡通路對大鼠腦缺血再灌注損傷發(fā)揮保護作用[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志,2006,23:318-321.

        猜你喜歡
        神經(jīng)細胞生理鹽水陽性細胞
        Physiological Saline
        熊果酸減輕Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞氧化應(yīng)激和細胞凋亡
        中成藥(2021年5期)2021-07-21 08:39:04
        自制生理鹽水
        大口黑鱸鰓黏液細胞的組織化學(xué)特征及5-HT免疫反應(yīng)陽性細胞的分布
        操控神經(jīng)細胞“零件”可抹去記憶
        人胎腦額葉和海馬中星形膠質(zhì)細胞的發(fā)育性變化
        Hoechst33342/PI雙染法和TUNEL染色技術(shù)檢測神經(jīng)細胞凋亡的對比研究
        NF-κB介導(dǎo)線粒體依賴的神經(jīng)細胞凋亡途徑
        生理鹽水的質(zhì)量分數(shù)為什么是0.9%
        急性白血病免疫表型及陽性細胞比例分析
        国产美女69视频免费观看| 欧洲乱码伦视频免费| 成人aaa片一区国产精品| 国产精品美女久久久浪潮av| 9丨精品国产高清自在线看| av人妻在线一区二区三区| 精品人妻一区二区三区四区在线| 色狠狠av老熟女| 亚洲黄色在线看| 色婷婷久久综合中文久久一本| 国产麻花豆剧传媒精品mv在线 | 中文字幕精品亚洲字幕| 国产肉体xxxx裸体137大胆| 久久亚洲黄色| 国产毛片三区二区一区| 少妇免费av一区二区三区久久| 中文字幕欧美人妻精品一区| 日韩h网站| av网站一区二区三区| 真人做爰试看120秒| 中国xxx农村性视频| 国产国拍亚洲精品永久69| 蜜桃高清视频在线看免费1| 中文天堂国产最新| 亚洲一区二区三区在线网站| 丝袜美女美腿一区二区| 色偷偷激情日本亚洲一区二区| 成 人 免费 黄 色 视频| 久久亚洲国产欧洲精品一| 精品私密av一区二区三区| 日韩一区国产二区欧美三区| 97超在线视频免费| 精品奇米国产一区二区三区| 女人张开腿让男人桶爽| 天天躁日日躁狠狠躁人妻| 极品人妻少妇一区二区| 开心五月婷婷激情综合网| 熟女熟妇伦av网站| 国产成人cao在线| 风流熟女一区二区三区| 少妇aaa级久久久无码精品片|