李曉玲 王滿俠 張博 原鉑堯 張?chǎng)╈o 張淑娟

腦出血后神經(jīng)功能惡化的原因有腦水腫的形成，神經(jīng)細(xì)胞死亡等。凋亡在腦出血后神經(jīng)細(xì)胞的損傷中發(fā)揮重要的作用。腦出血后線粒體釋放細(xì)胞色素C，激活各種胱冬酶，導(dǎo)致蛋白酶級(jí)鏈切割最終發(fā)生凋亡，此為經(jīng)典的caspase依賴性通路。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)另一種重要的線粒體內(nèi)介導(dǎo)凋亡的蛋白——AIF，其可以不依賴caspase-3的活性而通過(guò)另一條更為原始、更保守的途徑來(lái)誘導(dǎo)凋亡。研究證實(shí)，AIF在神經(jīng)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要的作用[1]。亞低溫對(duì)神經(jīng)元的凋亡有明顯的抑制作用[2]，但其具體機(jī)制尚未明確。目前關(guān)于亞低溫對(duì)caspase依賴性通路的研究較多，但對(duì)AIF的研究尚不多見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究亞低溫對(duì)非caspase依賴性通路中關(guān)鍵蛋白AIF的影響以進(jìn)一步探討其減輕神經(jīng)元凋亡的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD雄性大鼠108只，鼠齡10～12個(gè)月，體質(zhì)量(275±25)g，由北京天壇醫(yī)院動(dòng)物房提供(合格證書(shū)編號(hào)-604821)。隨機(jī)分為生理鹽水組、腦出血組和亞低溫+腦出血組(以下簡(jiǎn)稱亞低溫組)，每組再分為腦出血24 h、72 h 、7 d亞組，每個(gè)亞組12只。

1.2方法

1.2.1腦出血模型制備：以10%(質(zhì)量濃度)水合氯醛按體質(zhì)量400 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，俯臥位固定于動(dòng)物腦立體定位儀(美國(guó)Benchmark)上。行頭皮正中切口，切開(kāi)皮膚，剝離骨膜，暴露前囟及冠狀縫，前囟后1.0 mm中線右3.0 mm處為注射穿刺點(diǎn)(右側(cè)基底節(jié)區(qū)尾狀核)，用牙科鉆穿透顱骨，用微量注射器(寧波三愛(ài))抽取股動(dòng)脈血50 μL，將注射器固定于立體定位儀上，將針尖置于穿刺點(diǎn)平顱骨，垂直進(jìn)針5.5 mm后，以微量注射泵(美國(guó)Benchmark)緩慢注入自體血。生理鹽水組以同樣方法注入等量生理鹽水。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：以腦組織中出現(xiàn)明顯的圓形、橢圓形或不規(guī)則形的血腫為模型成功標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)參照Longa及Bederson五級(jí)評(píng)分法，評(píng)分為2～3分者作為成功模型入組。摒除血液針道反流進(jìn)入腦室或死亡者。

1.2.2亞低溫處理方法：將亞低溫組大鼠于腦出血后10 min內(nèi)放在冰毯上用冰塊覆蓋降溫,采用醫(yī)用電子溫度計(jì)(大連歐姆龍)間隔15 min監(jiān)測(cè)大鼠肛溫，約15 min左右將大鼠肛溫降至(33±1.0)℃, 6 h后在室溫下自動(dòng)復(fù)溫。腦出血組及生理鹽水組肛溫維持在(37.5±1.0)℃,并于大鼠蘇醒后(一般為3 h左右)再次給予10%(質(zhì)量濃度)水合氯醛按體質(zhì)量150 mg/kg腹腔注射麻醉。

1.2.3冷凍切片制備：4%(質(zhì)量濃度)多聚甲醛溶液250 mL經(jīng)心腔灌注固定，斷頭取腦，沿針孔冠狀面切開(kāi)，將針孔后2 mm腦標(biāo)本置于4%(質(zhì)量濃度)多聚甲醛溶液中固定72 h，后用20%(質(zhì)量濃度)蔗糖溶液脫水固定72 h，在注射針道平面切取腦組織塊后以冷凍切片機(jī)(Leica CM1850)行冷凍切片，切片厚10 μm。

1.2.4AIF免疫組化染色:(1)滴加3%(體積分?jǐn)?shù))過(guò)氧化氫抑制5 min，滴加一抗1∶100(羊抗小鼠AIF抗體，購(gòu)自Santa Cruz公司，貨號(hào)sc-9416)，4℃過(guò)夜；(2)滴加生物素標(biāo)記的二抗(DAKO K0690)；(3)滴加SABC；(4)DAB顯色；(5)蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片、鏡檢。采用彩色圖像分析儀(BI-2000)進(jìn)行分析，切片置于高倍鏡(400倍)下，隨機(jī)選取每張切片血腫周圍5個(gè)視野，測(cè)定AIF平均吸光度值。

1.2.5TUNNEL染色：參照原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)(試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司)。主要步驟包括：(1)滴加3%(體積分?jǐn)?shù))過(guò)氧化氫抑制30 min；(2)蛋白酶K 37℃消化30 min；(3)TUNNEL反應(yīng)混合液，37℃孵育；(4)加入酶標(biāo)記熒光素抗體37℃孵育；(5)DAB顯色，脫水、透明、封片、鏡檢。采用彩色圖像分析儀(BI-2000)進(jìn)行分析，切片置于高倍鏡(400倍)下，隨機(jī)選取每張切片血腫周圍5個(gè)視野，計(jì)數(shù)TUNNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組AIF表達(dá)比較生理鹽水組(注射針道周圍腦組織)、腦出血組及亞低溫組大鼠腦組織可見(jiàn)AIF免疫陽(yáng)性細(xì)胞。生理鹽水組各時(shí)間點(diǎn)間腦組織AIF表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，而腦出血組和亞低溫組各時(shí)間點(diǎn)AIF表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與生理鹽水組比較，腦出血組和亞低溫組各時(shí)間點(diǎn)AIF表達(dá)均升高(P<0.05)，而亞低溫組各時(shí)間點(diǎn)AIF表達(dá)較腦出血組降低(P<0.05)。腦出血組AIF的表達(dá)于出血后24 h增加，72 h達(dá)高峰，7 d后下降(P<0.05)。具體結(jié)果見(jiàn)(表1)。

2.2各組TUNNEL陽(yáng)性細(xì)胞比較生理鹽水組(注射針道周圍腦組織)、腦出血組及亞低溫組大鼠腦組織可見(jiàn)TUNNEL陽(yáng)性細(xì)胞。生理鹽水組各時(shí)間點(diǎn)間腦組織TUNNEL陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，而腦出血組和亞低溫組各時(shí)間點(diǎn)TUNNEL陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與生理鹽水組比較，腦出血組和亞低溫組各時(shí)間點(diǎn)TUNNEL陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)均升高(P<0.01)，而亞低溫組各時(shí)間點(diǎn)TUNNEL陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)較腦出血組降低(P<0.01)。腦出血組TUNNEL陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)于出血后24 h增加，72 h達(dá)高峰，7 d后下降(P<0.01)。具體結(jié)果見(jiàn)(表2)。

3 討論

凋亡誘導(dǎo)因子是一種凋亡誘導(dǎo)蛋白，與細(xì)胞色素C一樣位于線粒體膜，死亡信號(hào)誘導(dǎo)AIF釋放。AIF在多種組織中廣泛分布，其基因定位于X染色體上，在人類定位在Xq25-26,在大鼠位于X染色體A6區(qū)。AIF是一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為57的核黃素蛋白[3]，前體蛋白在胞質(zhì)中合成后，通過(guò)其N端的線粒體定位信號(hào)有效地穿入線粒體膜間隙，進(jìn)而成為具有凋亡潛能的成熟AIF分子[4]。在死亡信號(hào)或細(xì)胞應(yīng)激的刺激下，線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔開(kāi)放，釋放AIF到細(xì)胞質(zhì)溶質(zhì)中，具有核定位信號(hào)序列的AIF便進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，引起染色質(zhì)的初步凝集和DNA大量片段化(約50 kb)，進(jìn)而引發(fā)不依賴于caspase的細(xì)胞凋亡途徑[4]。AIF的促凋亡作用還在于AIF還可導(dǎo)致線粒體腫脹，改變線粒體外膜的通透性引起AIF和細(xì)胞色素C的進(jìn)一步釋放，形成正反饋促進(jìn)凋亡。

表 1 各組大鼠腦出血后不同時(shí)間點(diǎn)腦組織AIF表達(dá)(吸光度)比較

注：與生理鹽水組比較，*P<0.05；與腦出血組比較，△P<0.05；與同組72 h時(shí)間點(diǎn)比較，#P<0.05

表 2 各組大鼠腦出血后不同時(shí)間點(diǎn)腦組織TUNNEL陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)比較

注：與生理鹽水組比較，*P<0.01；與腦出血組比較，△P<0.01；與同組72 h時(shí)間點(diǎn)比較，#P<0.01

腦出血后由于血腫的占位效應(yīng)會(huì)造成出血同側(cè)及對(duì)側(cè)部位均有不同程度的腦缺血現(xiàn)象。目前已經(jīng)有大量的研究證實(shí)局灶性腦缺血可以引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡。腦出血后神經(jīng)細(xì)胞的死亡存在兩種形式即壞死和凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，生理鹽水組針道周圍可以看TUNNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞和AIF表達(dá)，表明生理鹽水導(dǎo)致的水腫的占位效應(yīng)可引起針道周圍神經(jīng)細(xì)胞凋亡，但在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)其表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；腦出血組、亞低溫組在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)TUNNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞和AIF表達(dá)均低于生理鹽水組。腦出血組在24 h時(shí)血腫周圍可看TUNNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞，在72 h時(shí)其表達(dá)達(dá)高峰，7 d后下降。這與腦出血后凋亡細(xì)胞的形成與腦水腫的變化趨勢(shì)一致。由此推測(cè)，腦出血后引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡與腦損傷后caspase-3的表達(dá)增加有關(guān)[5]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腦出血大鼠腦組織AIF表達(dá)于出血后24 h開(kāi)始增加，72 h達(dá)高峰，7 d后下降，但均高于生理鹽水組，其變化同TUNNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞變化結(jié)果相一致。表明腦出血后在各種死亡信號(hào)或者細(xì)胞脅迫的刺激下，神經(jīng)細(xì)胞的凋亡與AIF的合成增加有關(guān)；另外，也與線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔開(kāi)放增加引起AIF的釋放有關(guān)。實(shí)際上細(xì)胞凋亡的控制通過(guò)整個(gè)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)完成，多種信號(hào)途徑相互作用，所以其具體機(jī)制比較復(fù)雜，推測(cè)可能是通過(guò)對(duì)多個(gè)途徑的影響來(lái)促進(jìn)出血后凋亡的發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，亞低溫組TUNNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)在腦出血后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均低于腦出血組，提示亞低溫可減輕腦出血后的神經(jīng)元凋亡。其機(jī)制可能與亞低溫可減輕腦出血后的炎性反應(yīng)、抑制神經(jīng)元凋亡的始動(dòng)[6]有關(guān)；也可能與增強(qiáng)Bcl-2的表達(dá)[7]、抑制Bax基因表達(dá)[8]、抑制 caspase與 Fas蛋白活性有關(guān)?？梢?jiàn)，既往針對(duì)亞低溫對(duì)caspase依賴性通路的影響研究較多。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察亞低溫對(duì)非caspase依賴性通路中的關(guān)鍵蛋白AIF的影響，以進(jìn)一步探討其減輕神經(jīng)元凋亡的機(jī)制。在本實(shí)驗(yàn)中亞低溫組大鼠腦組織AIF的表達(dá)于24 h、72 h、7 d時(shí)均低于腦出血組，與TUNNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞的變化一致，提示亞低溫可以通過(guò)減少腦出血后各種死亡信號(hào)和細(xì)胞刺激引起AIF表達(dá)下降，延緩AIF激活，從而減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，如阻斷其引起核DNA凝聚斷裂為長(zhǎng)的DNA片段導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，其具體機(jī)制可能為：亞低溫可以保持線粒體的完整性，抑制線粒體通透性增加釋放AIF至細(xì)胞核中，從而阻斷AIF引起的DNA大規(guī)模斷裂；也可能與亞低溫阻斷AIF的核轉(zhuǎn)移有關(guān)。還有研究顯示亞低溫可通過(guò)抑制腦缺血再關(guān)注后AIF的轉(zhuǎn)錄而減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡[9]。本研究結(jié)果提示亞低溫可有效延緩腦出血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的進(jìn)程，發(fā)揮腦保護(hù)作用。

總之，腦出血后的神經(jīng)元凋亡是由各種凋亡刺激信號(hào)始動(dòng)，受細(xì)胞內(nèi)源性基因、酶和信號(hào)傳導(dǎo)途徑等調(diào)控的瀑布式激活過(guò)程。亞低溫抑制神經(jīng)元凋亡，可能是對(duì)其多個(gè)環(huán)節(jié)的影響，具體有待于進(jìn)一步研究。

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