胡 萍，魏琳琳，王新華，余大為，許小紅，翟育忠，劉愛(ài)芳

（1.甘肅省疾病預(yù)防控制中心，甘肅 蘭州 730020；2.甘肅省慶陽(yáng)市疾病預(yù)防控制中心，甘肅 慶陽(yáng)745000）

配方奶粉中克雷伯菌選擇性培養(yǎng)方法的研究

胡 萍1，魏琳琳1，王新華1，余大為1，許小紅1，翟育忠1，劉愛(ài)芳2

（1.甘肅省疾病預(yù)防控制中心，甘肅 蘭州 730020；2.甘肅省慶陽(yáng)市疾病預(yù)防控制中心，甘肅 慶陽(yáng)745000）

目的 為提高配方奶粉中克雷伯菌的分離鑒定效率，研制專門用于克雷伯菌分離培養(yǎng)的選擇性培養(yǎng)基。方法 依據(jù)克雷伯菌生化特性，研制成改良麥康凱（MACI）培養(yǎng)基，觀察克雷伯菌及其他乳糖陽(yáng)性的腸桿菌科細(xì)菌菌落在MACI平板、SS平板、麥康凱（MAC）平板和結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBGA）平板上的生長(zhǎng)特點(diǎn)；用產(chǎn)酸克雷伯菌（ATCC13182）和肺炎克雷伯菌（ATCC10031）檢測(cè)MACI培養(yǎng)基的生長(zhǎng)率和最低檢出限。結(jié)果 克雷伯菌在MACI平板上形成獨(dú)特的紅色菌落，而其他腸桿菌為無(wú)色菌落；肺炎克雷伯菌（ATCC10031）和產(chǎn)酸克雷伯菌（ATCC13182）在MACI培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)率分別為0.936 6和0.898 8；最低檢出限均為40 cfu/g。結(jié)論 MACI可作為分離克雷伯菌的理想選擇性培養(yǎng)基。

配方奶粉；克雷伯菌；選擇性培養(yǎng)方法

克雷伯菌屬腸桿菌科，營(yíng)養(yǎng)要求不高。其中的肺炎克雷伯菌及產(chǎn)酸克雷伯菌是重要的條件致病菌和醫(yī)源性感染菌，且對(duì)抗生素易產(chǎn)生耐藥性[1～5]。免疫力低下的個(gè)體感染此類菌后，可存在罹患肺炎、腸炎、腦膜炎、敗血癥和食物中毒等風(fēng)險(xiǎn)[2，6～14]。FAO/WHO于2004年5月在日內(nèi)瓦召開(kāi)的“嬰兒配方奶粉中阪崎桿菌和其他微生物”的聯(lián)席會(huì)議上，將克雷伯菌列為嬰兒配方奶粉中B類致病菌[15，16]，并要求成員國(guó)實(shí)施有效的監(jiān)控。

克雷伯菌分解乳糖，在以往的腸道選擇性培養(yǎng)基上，不易與其他乳糖陽(yáng)性的腸桿菌科的細(xì)菌區(qū)分。本項(xiàng)目組嘗試?yán)每死撞煞纸鈧?cè)金盞花醇的生化特點(diǎn)[17]，對(duì)傳統(tǒng)腸道菌選擇性培養(yǎng)基麥康凱（MAC）加以改良，研制出提高克雷伯菌分離培養(yǎng)效率的改良麥康凱（MACI）培養(yǎng)基，并對(duì)市場(chǎng)銷售配方奶粉中克雷伯菌進(jìn)行分離鑒別，比較4種腸道選擇性培養(yǎng)基的分離效率，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）、營(yíng)養(yǎng)肉湯（NB）、緩沖蛋白胨水（BPW）、SS瓊脂、麥康凱（MAC）瓊脂、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBGA）、3號(hào)膽鹽（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；中性紅（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；生理鹽水（甘肅扶正藥業(yè)科技股份有限公司）；瓊脂粉、蛋白胨（日本進(jìn)口分裝）；側(cè)金盞花醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；VITEK 2 GN-菌種鑒定卡（美國(guó)bioMerieux.Ine公司）。以上試劑均在有效期內(nèi)。

1.1.2 儀器 VITEK 2全自動(dòng)生化鑒定儀（bioMerieux）、恒溫培養(yǎng)箱、麥?zhǔn)蠞岫缺葷醿x（法國(guó)梅里埃公司）。

1.1.3 試驗(yàn)菌株 產(chǎn)酸克雷伯菌（ATCC13182）、肺炎克雷伯菌（ATCC10031）、產(chǎn)氣腸桿菌（NCIMB10102）、陰溝腸桿菌（ATCC23355）、費(fèi)勞地枸櫞酸桿菌（ATCC8090）標(biāo)準(zhǔn)菌株（上海漢尼生物技術(shù)有限公司）；大腸埃希菌（ATCC25922）標(biāo)準(zhǔn)菌株、產(chǎn)酸克雷伯菌（8株）和肺炎克雷伯菌（12株）臨床分離菌株由甘肅省人民醫(yī)院檢驗(yàn)中心饋贈(zèng)。

1.2 MACI培養(yǎng)基的研制

1.2.1 參照MAC培養(yǎng)基的制備方法[18]將其中的乳糖成分用側(cè)金盞花醇替代，配制方法如下：蛋白胨20 g，氯化鈉5 g，瓊脂20～25 g，膽鹽5 g，蒸餾水1 000 ml，將各成分加入蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH至7.4，加入1%中性紅水溶液5 ml，分裝適當(dāng)容器，115℃高壓滅菌15 min，溫度降至60℃左右，加入側(cè)金盞花醇10 g，充分混勻，制成平板備用。

1.2.2 選擇性培養(yǎng)基的分離培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)的菌株均經(jīng)VITEK 2進(jìn)行鑒定。菌株復(fù)活后，分別接種腸道菌選擇性培養(yǎng)基SS、MAC、VRBGA和MACI平板，培養(yǎng)后觀察菌株在各種平板上的菌落形態(tài)。

1.2.3 MACI培養(yǎng)基的質(zhì)控[19]（1）克雷伯菌在MACI培養(yǎng)基上生長(zhǎng)率的測(cè)定。產(chǎn)酸克雷伯菌（ATCC13182）和肺炎克雷伯菌（ATCC10031）經(jīng)NB培養(yǎng)后，菌液濃度達(dá)到108個(gè)/ml。用生理鹽水對(duì)菌液依次做10倍遞增稀釋，稀釋濃度至100個(gè)/ml。各取1 ml菌液，涂布法分別接種于NA平板和MACI平板，檢測(cè)克雷伯菌在MACI培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)率（生長(zhǎng)率=待測(cè)培養(yǎng)基菌落計(jì)數(shù)/對(duì)照培養(yǎng)基菌落計(jì)數(shù)），結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 克雷伯菌在不同濃度培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)試驗(yàn)

（2）克雷伯菌在MACI培養(yǎng)基上最低檢出限的測(cè)定。無(wú)菌取8份配方奶粉（已知無(wú)腸桿科細(xì)菌），每份25 g，分別加到225 ml NB中，均質(zhì)。取濃度為100～107個(gè)/ml的菌液各1 ml，分別加到8份配方奶粉中，混勻，然后各取1 ml，涂布法接種于MACI平板，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同濃度克雷伯菌在MACI瓊脂上的生長(zhǎng)計(jì)數(shù)情況

1.3 市場(chǎng)銷售配方奶粉中克雷伯菌的檢測(cè)及MACI培養(yǎng)基應(yīng)用效果的評(píng)判

1.3.1 樣品 市場(chǎng)銷售的1階段（0～6月）、2階段（6～12月）、3階段（1～3歲）和4階段（3歲以上）18個(gè)品牌的配方奶粉，共計(jì)98份。

1.3.2 配方奶粉中克雷伯菌的檢測(cè)步驟 無(wú)菌稱取配方奶粉100 g置于900 ml BPW中混勻培養(yǎng)后，從中取25 ml置于225 ml NB中混勻培養(yǎng)，分別轉(zhuǎn)種MACI、SS、MAC和VRBGA平板培養(yǎng)。挑取可疑菌落，涂片革蘭氏染色，應(yīng)用VITEK 2全自動(dòng)生化鑒定儀的GN-菌種鑒定卡對(duì)革蘭氏陰性桿菌進(jìn)行鑒定。檢測(cè)過(guò)程中，均帶標(biāo)準(zhǔn)菌株作參考。

1.3.3 MACI培養(yǎng)基的應(yīng)用效果評(píng)判 基本程序同1.3.2。分別將MAC、SS、VRBGA、MACI分離到的可疑菌落數(shù)與生化鑒定確認(rèn)的菌落數(shù)進(jìn)行比較，計(jì)算出各培養(yǎng)基的分離陽(yáng)性率（分離陽(yáng)性率=生化鑒定確認(rèn)的菌落數(shù)／可疑菌落數(shù)），并借此對(duì)MACI的分離特異性做出評(píng)判。

2 結(jié)果與分析

（1）實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)菌株經(jīng)VITEK 2鑒定，結(jié)果均符合試驗(yàn)要求。

（2）通過(guò)對(duì)試驗(yàn)菌株菌落的觀察發(fā)現(xiàn)，在VRBGA、SS和MAC培養(yǎng)基上，菌落均呈濕潤(rùn)、光滑、邊緣整齊、紅色的形態(tài)特點(diǎn)，因此，克雷伯菌不易與其他腸桿菌進(jìn)行判讀和鑒別。MACI平板上，試驗(yàn)菌株進(jìn)行中的克雷伯菌菌株均形成紅色、直徑約2 mm、突起、黏稠、相鄰融合的菌落，其他腸桿菌的菌落為無(wú)色，雖然產(chǎn)氣腸桿菌的菌落也為紅色，但相鄰菌落不發(fā)生融合現(xiàn)象。

（3）克雷伯菌在MACI上的生長(zhǎng)率。NA是需氧和兼性厭氧菌生長(zhǎng)的良好培養(yǎng)基。在此培養(yǎng)基上，肺炎克雷伯菌（ATCC 10031）和產(chǎn)酸克雷伯菌（ATCC13182）不同濃度的菌液均生長(zhǎng)良好、計(jì)數(shù)變化明顯。由表1可見(jiàn)，當(dāng)菌液稀釋濃度達(dá)到102cfu/ ml時(shí)，該菌即可在NA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，在MACI培養(yǎng)基上也能達(dá)到很好的生長(zhǎng)效果。依據(jù)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落計(jì)數(shù)測(cè)定的報(bào)告原則[20]，選擇菌落數(shù)在30～300的稀釋度結(jié)果，以NA培養(yǎng)基為對(duì)照，計(jì)算出MACI培養(yǎng)基的生長(zhǎng)率分別為0.936 6和0.898 8。

（4）最低檢出限。1 ml菌液加入250 ml含有25 g配方奶粉的NB中，菌濃度被稀釋了250倍。表2顯示，兩種菌在104cfu/ ml稀釋度時(shí)，均可生長(zhǎng)，故MACI平板上的最大稀釋生長(zhǎng)濃度為104cfu/250 ml，兩種克雷伯菌的最低檢出限均為40 cfu/g。

（5）市場(chǎng)銷售配方奶粉中克雷伯菌的檢測(cè)。表3顯示，在4種不同選擇性培養(yǎng)基分離克雷伯菌的試驗(yàn)中，MACI的分離陽(yáng)性率最高，為75.0%，VRBGA和MAC相同，分別為50.0%，SS為37.5%。

表3 不同選擇性培養(yǎng)基分離克雷伯菌效果比較

3 討論

在腸桿菌科細(xì)菌常用的分離培養(yǎng)基MAC、SS、VRBGA上，克雷伯菌與發(fā)酵乳糖陽(yáng)性的細(xì)菌菌落均呈紅色，不易區(qū)分。本項(xiàng)目組依據(jù)克雷伯菌可分解側(cè)金盞花醇的特點(diǎn)[17]，研制了MACI，經(jīng)測(cè)試，克雷伯菌在MACI上可形成特點(diǎn)顯著、易與其他腸桿菌區(qū)分的菌落，依據(jù)《培養(yǎng)基性能測(cè)試實(shí)用指南》的要求，經(jīng)對(duì)MACI培養(yǎng)基進(jìn)行的生長(zhǎng)率與最低檢出限試驗(yàn)結(jié)果表明，肺炎克雷伯菌（ATCC10031）和產(chǎn)酸克雷伯菌（ATCC13182）在該培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)率及最低檢出限均符合預(yù)期效果。

對(duì)市場(chǎng)銷售的98份嬰幼兒配方奶粉的檢測(cè)結(jié)果表明，MACI對(duì)克雷伯菌的分離陽(yáng)性率高于其他3種培養(yǎng)基，經(jīng)對(duì)4種選擇性培養(yǎng)基組份對(duì)比分析，SS瓊脂的抑菌劑成分最多，達(dá)4種，且含量高[19]，而VRBGA瓊脂為2種[21]，MAC和MACI瓊脂僅為1種，且含量都較低[19]，是否可以認(rèn)為，培養(yǎng)基中抑菌劑成分的多寡、含量的高低和可疑菌落挑選是造成克雷伯菌分離效率差異的原因。我們認(rèn)為MACI培養(yǎng)基為克雷伯菌分離培養(yǎng)的理想培養(yǎng)基。

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G424.31

B

1671-1246（2014）07-0114-03

注：本文系2010年甘肅省衛(wèi)生行業(yè)計(jì)劃項(xiàng)目（GSWST-2010-25）