程鳳峽 張海芳 楊玉鵬 田華 劉勇

牙周病是牙周致病菌及其毒性產(chǎn)物引發(fā)的宿主免疫和炎性反應，是造成牙周組織破壞的主要原因，其最終結(jié)果將導致牙周袋形成，牙槽骨吸收，牙齒松動、脫落。近年來，局部用藥尤其是局部緩釋制劑受到越來越多的關(guān)注。多西環(huán)素和骨碎補可在牙周治療中起到抑菌，抑制膠原酶活性，刺激牙周膜細胞增殖及新附著生成等重要作用［1－3］，將其聯(lián)合應用于牙周局部藥物治療筆者尚未見報導。聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)是FDA認證的生物可降解高分子聚合物，具有良好的生物相容性和持久的緩釋能力［4］。復方多西環(huán)素緩釋凝膠以多西環(huán)素和骨碎補為主藥，PLGA為緩釋輔料制成凝膠，體外釋放試驗提示其緩慢釋放可長達7 d。本研究應用高效液相色譜法，檢測牙周上藥后不同時間齦溝液內(nèi)多西環(huán)素的濃度，以確定凝膠的體內(nèi)緩釋效應，指導臨床治療時復診給藥時間。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 島津LC-20AT高效液相色譜儀，Kromasil C18(100 mm ×4.6 mm，5 μm)，SPD-M20A 紫外檢測器，LCsolution色譜工作站，梅特勒AG-254電子天平。多西環(huán)素對照品(批號:0485-0401)由中國藥品生物制品檢定所提供。復方多西環(huán)素緩釋凝膠(含10%多西環(huán)素、骨碎補提取液和適量聚乳酸-羥基乙酸共聚物PLGA75∶25)和復方多西環(huán)素凝膠(含10%多西環(huán)素和骨碎補提取液)均為自制。

1.2 方法

1.2.1 入選條件:按美國牙周病學會制定的牙周炎診治參照標準［5］，選擇我院門診患者中確診為中、重度慢性牙周炎病例11例，其中男6例，女5例;平均年齡48.7歲;入選患牙26顆。選擇標準:①無全身系統(tǒng)疾病，女性未妊娠或哺乳，無近期受孕計劃;②無四環(huán)素藥物過敏史;③口腔內(nèi)至少有兩顆不在同一象限的牙齒牙周袋探診深度(PD)≥4 mm、牙齦探診出血(BOP)(+)，X線片顯示牙槽骨有不同程度的吸收;④3個月內(nèi)未接受過牙周治療，未使用抗生素或非甾體類抗炎藥物;⑤患者了解本實驗過程，知情同意自愿參加本實驗。

1.2.2 試驗設(shè)計:本實驗采用同一患者口腔內(nèi)病情相近牙齒的自身對照設(shè)計，將患者口內(nèi)符合納入標準位于不同象限的牙位隨機分為實驗組和對照組。入選患者接受口腔衛(wèi)生宣教，進行徹底的基礎(chǔ)治療。1周后復診，0.9%氯化鈉溶液沖洗牙周袋，隔濕牙面，實驗組牙周上藥用復方多西環(huán)素緩釋凝膠，對照組牙周上藥用復方多西環(huán)素凝膠。上藥方法均為將凝膠注射器針頭輕輕插入牙周袋袋底，邊注射邊后退，至袋口有少許凝膠溢出，囑患者一小時內(nèi)勿刷牙、漱口及進食。1周內(nèi)每天定時采集齦溝液樣本一次進行藥物濃度測定。

1.2.3 齦溝液采集:將whatman3號濾紙裁成規(guī)格為2 mm×10 mm的濾紙條，將每兩個濾紙條置入一個Ep管中電子天平稱量(W1)，備用。隔濕，擦干牙面，將濾紙條分別置于頰側(cè)正中和舌側(cè)正中牙周袋口30 s取出，將濾紙條重新置入Ep管中并稱重(W2)。若有血液則棄去，重新釆集。齦溝液的量(W)=W2－W1，并按照1 mg/μl換算成體積，－70℃冰箱避光保存。

1.3 高效液相色譜法測定齦溝液內(nèi)藥物濃度

1.3.1 液相色譜條件:色譜柱:Kromasil C18(100 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相:乙腈-1‰醋酸銨水溶液(50∶50)，調(diào) pH 值到8.0 左右。流量:1.0 ml/min;柱溫:室溫;檢測波長:350 nm。

1.3.2 輔料干擾試驗:取不含多西環(huán)素的緩釋凝膠約0.1 g注射到甲醇溶液100 ml中，過濾，取濾液進樣20 μl。結(jié)果在波長350 nm下，輔料在多西環(huán)素的保留時間處無吸收，不干擾測定。

1.3.3 空白試驗:按齦溝液采集方法用濾紙條取治療后未上藥的齦溝液樣本，精密吸取200 μl甲醇溶液加入裝有樣品的Ep管，超聲處理30 min，8 000 r/min離心3 min，取上清液20 μl進樣。觀察在多西環(huán)素保留時間處無吸收峰，不干擾測定。見圖1。

圖1 GCF的色譜圖

1.3.4 標準曲線標準曲線:取多西環(huán)素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每毫升中含多西環(huán)素1 000 μg的溶液，作為對照品溶液A。精密稱取對照品溶液A適量，用甲醇稀釋至濃度分別為 0、25、50、100、200、300、400、500 μg/ml，進樣20 μl測定峰面積，以峰面積對濃度進行線性回歸，得出回歸方程為:A=2710.7CX+11249，r=0.9995。結(jié)果表明，多西環(huán)素在0～500 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。見圖2A。

1.3.5 齦溝液樣品內(nèi)多西環(huán)素濃度測定:精密吸取200 μl甲醇溶液加入裝有樣品的 Ep管，超聲處理30 min，使藥物充分溶出，8 000 r/min離心3 min，取上清液20 μl進樣。根據(jù)預先繪制的多西環(huán)素標準曲線計算出多西環(huán)素的濃度。見圖2B。

圖2 多西環(huán)素的色譜圖

2 結(jié)果

復方多西環(huán)素凝膠在用藥后第1天，齦溝液內(nèi)多西環(huán)素濃度為309.71 μg/ml。到用藥后第3天，齦溝液內(nèi)多西環(huán)素濃度已降至6.82 μg/ml。

復方多西環(huán)素緩釋凝膠在用藥后第1天，齦溝液內(nèi)多西環(huán)素濃度為425.57 μg/ml，至用藥后第3天，多西環(huán)素的濃度仍高達208.31 μg/ml，到用藥后第7天，齦溝液內(nèi)多西環(huán)素的濃度為60.46 μg/ml。見圖3。

圖3 應用兩種制劑后GCF內(nèi)多西環(huán)素濃度的對比

3 討論

牙周袋內(nèi)緩釋藥物的應用因其方便、無創(chuàng)、藥效持續(xù)時間長等優(yōu)點逐漸成為牙周病藥物治療的發(fā)展趨勢。牙周局部緩釋用藥的理想標準包括:藥物可持續(xù)釋放較長時間發(fā)揮作用，減少毒副作用;對牙周致病菌有較強的殺滅或抑制作用;可促進牙周組織再生;減少上藥頻率，提高患者依從性;藥物可貼附在牙周袋中不易脫落，無不適;緩釋載體有良好的生物相容性，可生物降解;劑型便于臨床操作，能深入牙周袋底及根分叉處等;但目前臨床尚沒有一種制劑能滿足這些要求［6，7］。

鹽酸多西環(huán)素不僅能抑制多種牙周致病菌，還能調(diào)節(jié)宿主防御反應，抑制膠原酶活性和骨吸收，可以減緩牙周組織炎癥時的組織破壞［1］。骨碎補具有促進骨折愈合、強骨補腎的功效。近年來很多研究發(fā)現(xiàn)骨碎補在牙周組織修復中起重要作用，它可以刺激成纖維細胞的附著和生長，另有實驗表明骨碎補可以抑制牙槽骨吸收，促進牙槽骨再生［2，3］。這些藥物在牙周組織的作用滿足了牙周局部制劑的治療需要。

將這些藥物局部應用并緩慢釋放需要一個合適的載體。PLGA是由兩種單體(乳酸和羥基乙酸)聚合而成的一種生物可降解高分子有機化合物，其降解產(chǎn)物為乳酸和羥基乙酸，并最終在人體中代謝為二氧化碳和水。由于其具有良好的生物相容性和生物可降解性且降解速度可控，PLGA材料已經(jīng)通過FDA認證，被正式作為藥用輔料收錄進美國藥典，作為人工導管、藥物緩釋載體、組織工程支架材料被較為廣泛的應用［8，9］。1MP 作為溶劑，GTA 作為增塑劑，均有良好的生物降解性能，對凝膠最終的物理性狀起到重要作用，滿足了牙周局部凝膠應用方便，可深入牙周袋底部及根分叉區(qū)，藥物緩慢釋放，不易脫落，異物感小等要求。

由于多西環(huán)素遇光不穩(wěn)定，在整個試驗過程均應注意遮光操作，避免其分解。本實驗中復方多西環(huán)素緩釋凝膠注入牙周袋內(nèi)凝結(jié)成膜狀，黏附于袋內(nèi)壁不易脫落，結(jié)果表明該緩釋凝膠在牙周袋內(nèi)可緩慢釋放，至第7天齦溝液內(nèi)復方多西環(huán)素的濃度仍高達60.46 μg/ml，遠遠高于多西環(huán)素對多種牙周可疑致病菌的最低抑菌濃度 0.06 ～6 μg/ml［10］。緩釋凝膠中的緩釋輔料PLGA遇水凝結(jié)形成多孔道骨架，藥物可沿多孔道緩慢釋放，這在藥物緩釋中起了主要作用。對照組所用的復方多西環(huán)素凝膠比較黏稠，但很難成膜，上藥后牙周袋內(nèi)多西環(huán)素的有效濃度也可維持2～3 d，這可能是GTA是凝膠遇水時收縮，凝聚，使藥物釋放減緩。由于中藥成分復雜，單個有效成分的釋放由于量比較微小很難監(jiān)測，因而骨碎補在牙周袋內(nèi)的釋放有待于進一步探討。

1 曹采方主編.臨床牙周病學.第1版.北京:北京大學出版社，2006.279-280.

2 胡其勇，陳莉麗，王仁飛.骨碎補柚皮苷對人牙周韌帶細胞增殖和成骨分化潛能的影響.浙江大學學報(醫(yī)學版)，2010，39:79-83.

3 劉斌，司徒鎮(zhèn)強，吳軍正，等.枸杞和骨碎補對HGF體外附著影響.中華口腔醫(yī)學雜志，1992，27:159.

4 The United States Pharmacopoeia Commission Inc.The United States Pharmacopoeia 32-NF27.Rockville:The United States Pharmacopoeia Convention，2009.2212.

5 牙周病診治的參照標準.美國牙周病學會制定.中華口腔醫(yī)學會牙周病學專業(yè)委員會翻譯.2004.

6 毛永利，劉魯川.牙周藥物緩釋系統(tǒng)研究進展.口腔醫(yī)學，2008，28:271-272.

7 Jain N，Jain GK，Javed S，et al.Recent approaches for the treatment of periodontitis.Drug Discov Today，2008，13:932-943.

8 Li M，Panagi Z，Avgoustakis K，et al.Physiologically based pharmacokinetic modeling of PLGA nanoparticles with varied mPEG content.Int J Nanomedicine，2012，7:1345-1356.

9 Khoee S，Rahmatolahzadeh R.Synthesis and characterization of pH-responsive and folated nanoparticles based on self-assembled brush-like PLGA/PEG/AEMA copolymer with targeted cancer therapy properties:A comprehensive kinetic study.Eur J Med Chem.2012，50:416-427.

10 Demetrick W，F(xiàn)rank J，Maria F，et al.In Vitro Activity of Amoxicillin，Clindamycin，Doxycycline，Metronidazole，and Moxifloxacin Against Oral Actinomyces.J Endod，2007，33:557-560.