聶英軍，傅超美，廖 婉，傅 舒，嚴(yán) 鑫，甘彥雄

(成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137)

醋莪術(shù)配方顆粒HPLC指紋圖譜研究

聶英軍，傅超美，廖 婉，傅 舒，嚴(yán) 鑫，甘彥雄

(成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137)

采用HPLC法，色譜柱為Dikma Diamonsil C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)，以乙腈—水為流動相，梯度洗脫，檢測波長254 nm，色譜柱柱溫30℃，流速1.0 mL/min.建立了醋莪術(shù)飲片HPLC指紋圖譜共有模式，標(biāo)定了8個主要共有峰，并利用計算機(jī)輔助相似性評價系統(tǒng)對指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，表明相似度較大.實(shí)驗結(jié)果表明:該指紋圖譜研究方法簡便可靠，重復(fù)性好，可作為目前醋莪術(shù)配方顆粒內(nèi)在質(zhì)量控制有效方法之一.

醋莪術(shù)配方顆粒;HPLC;指紋圖譜;質(zhì)量控制

0 引言

莪術(shù)始載于《藥性論》，是破血消 要藥，莪術(shù)炮制始載于南北朝的《雷公炮炙論》，醋制后入肝經(jīng)血分，其活血化瘀、消積止痛作用增強(qiáng)，同時也可緩和其峻猛的藥性.《中國藥典》2010年版同時收載生莪術(shù)與醋莪術(shù)2種規(guī)格［1］.醋莪術(shù)配方顆粒是中藥新型飲片，目前已投入臨床應(yīng)用［2－3］.相對于傳統(tǒng)以單個或少數(shù)主要成分作為指標(biāo)來控制醋莪術(shù)質(zhì)量的方法［4－6］，HPLC 指紋圖譜能比較全面地反映中藥中所含化學(xué)成分的種類與數(shù)量，更好地表明中藥的內(nèi)在質(zhì)量［7－9］，所以本研究擬采取 HPLC 指紋圖譜法，以建立醋莪術(shù)配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn).

1 儀器與材料

1.1 儀 器

實(shí)驗所用的儀器包括:島津LC－10AT高效液相色譜儀(SPD－10AT紫外檢測器、LC－10AT色譜泵)，江申JS－3030色譜工作站.

1.2 試 藥

實(shí)驗所用試藥包括:莪術(shù)醇對照品(批號，120924;純度，HPLC≥98%);莪術(shù)二酮對照品(批號，120726;純度，HPLC≥98%)，2種對照品均購自于四川省維克奇生物科技有限公司;水為重蒸水(自制)，甲醇為色譜純，其余試劑純度均為分析純.

1.3 藥 材

實(shí)驗所用的藥材包括:醋莪術(shù)飲片10批，其生產(chǎn)廠家及批號如表1所示，配方顆粒按照最佳制備工藝制備而成.藥材經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥標(biāo)本中心盧先明教授鑒定為醋制姜科植物蓬莪術(shù)的干燥根莖.

表1 醋莪術(shù)藥材飲片編號表

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

實(shí)驗的色譜條件為:色譜柱，Dikma Diamonsil C18柱(Dikma 公司，5 μm，4.6 mm × 250 mm)，檢測波長，254 nm，流動相，乙腈(A)—水(B);梯度洗脫程序為:0 min→5 min，乙腈10%，水90%;5 min→30 min，乙腈20%，水80%;30 min→35 min，乙腈21%，水79%;35 min→45 min，乙腈35%，水 65%;45 min→90 min，乙腈 37%，水 63%;90 min→120 min，乙腈45%，水55%;120 min→160 min，乙腈50%→80%，水50%→20%;DAD檢測器，流速1.0 mL/min;色譜柱柱溫30℃.

2.2 供試品溶液的制備

精密稱定醋莪術(shù)配方顆粒1 g，置于三角錐形瓶中，加入100%甲醇40 mL，稱重，超聲提取(頻率20 kHz，功率250 W)1 h 后，稱重后補(bǔ)重，0.45 μm 微孔濾膜濾過，制得供試品溶液.

2.3 對照品溶液的制備

精密稱定莪術(shù)醇、莪術(shù)二酮對照品適量于容量瓶中，加入適量甲醇，振搖，定容，制得含0.00810 mg/mL莪術(shù)醇，0.00425 mg/mL莪術(shù)二酮的混合對照品溶液.

2.4 測定方法

精密吸取供試品溶液及對照品溶液各10 μL，進(jìn)樣，采集160 min內(nèi)的色譜峰.

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度考察.

取醋莪術(shù)配方顆粒供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次后，分別對保留時間為 18、51、70、75、121、128、141、144 min的8個主要共有色譜峰進(jìn)行考察.結(jié)果顯示，各共有指紋峰的相對保留時間和相對峰面積基本一致，各共有峰的相對保留時間RSD為，0.11%～0.67%，各共有峰的相對峰面積RSD為，0.6% ～1.65%，表明本方法精密度良好.

2.5.2 穩(wěn)定性考察.

取醋莪術(shù)配方顆粒供試品溶液，選取時間點(diǎn)0、1、2、4、8、12、24、48 h 進(jìn)樣檢測，計算指紋圖譜中保留時間為 18、51、70、75、121、128、141、144 min 的 8個主要共有色譜峰峰面積.由計算結(jié)果可知，各共有峰的相對保留時間RSD為，0.45% ～1.05%，各共有峰的相對峰面積RSD為，0.73% ～1.64%，表明該樣品在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好.

2.5.3 重復(fù)性考察.

取同一批次制得的醋莪術(shù)配方顆粒6組，對指紋圖譜中保留時間為 18、51、70、75、121、128、141、144 min的8個主要共有色譜峰進(jìn)行考察，采集峰面積數(shù)值，計算15個主要色譜峰的相對保留時間與峰面積.由計算結(jié)果可知，各共有峰的相對保留時間RSD為，0.20%～0.75%，各共有峰的相對峰面積RSD為，0.46% ～1.04%，表明本測定方法重復(fù)性良好.

2.6 HPLC指紋圖譜共有色譜峰確認(rèn)

對10批次醋莪術(shù)配方顆粒指紋圖譜中的色譜峰進(jìn)行校正，將分離度較差的色譜峰去除，最終確定8個色譜峰為特征峰.吸取10 μL對照品溶液，進(jìn)樣，通過分析色譜峰保留時間與峰面積確定其色譜峰相似性歸屬.

2.7 樣品測定結(jié)果

2.7.1 指紋圖譜的檢測.

精密稱定10組不同批次醋莪術(shù)配方顆粒，每組1 g，按照“2.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.3”項下方法制備對照品溶液，按照“2.1”項下色譜條件進(jìn)行檢測，采集160 min中色譜峰保留時間與峰面積數(shù)值.使用“中藥色譜圖分析與數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)”應(yīng)用軟件，對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果如圖1所示.

圖1 混合對照品溶液的HPLC指紋圖譜識別

2.7.2 指紋圖譜的相似度計算.

使用“中藥色譜圖分析與數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)”應(yīng)用軟件.以S1樣品譜圖為相似度計算的校正參照譜圖，時間窗寬度大小為0.1 min，采用平均算法，以多項式最小二乘擬合平滑法控制噪音，將參照譜圖作為基準(zhǔn)，各樣品的指紋圖譜和對照圖譜進(jìn)行對比，通過計算得各不同批次醋莪術(shù)配方顆粒的相似度，結(jié)果如表2、圖2～3所示.

表2 指紋圖譜相似度測定

圖2 醋莪術(shù)配方顆粒HPLC手動匹配MARK峰與指紋圖譜共有模式

圖3 10批次不同醋莪術(shù)配方顆粒HPLC指紋圖譜疊加譜圖

由實(shí)驗結(jié)果可知，對不同廠家與批次的同一基源制備的醋莪術(shù)配方顆粒，使用本研究方法所得10個不同批次醋莪術(shù)配方顆粒的指紋圖譜的相似度和校正參照圖譜相似度均在0.9以上.此與其藥材的產(chǎn)地均為四川有關(guān)，但使用夾角余弦法與相關(guān)系數(shù)法所計算得的相似度有略微差別.

3 討論

3.1 醋莪術(shù)配方顆粒指紋圖譜色譜條件的選擇

使用DAD檢測器對樣品在波長200～800 nm下進(jìn)行全波長掃描，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，醋莪術(shù)HPLC指紋圖譜于波長320～200 nm下色譜峰較多，故本研究選用310、280、254、216 nm 作為考察波長.結(jié)果顯示，在280 nm與254 nm 2個波長下色譜峰的吸收度最大，且峰形完好.由于波長280 nm下色譜峰的分離度較波長254 nm下色譜峰分離度低，且在154 min后的基線有向上漂移的現(xiàn)象發(fā)生，故最終考慮確定波長254 nm為指紋圖譜的測定波長.

醋莪術(shù)配方顆粒HPLC指紋圖譜中測定的成分主要是揮發(fā)油中小分子成分，有些化合物的結(jié)構(gòu)較為相似，甚至通過氧化、還原、催化等途徑發(fā)生某些化合物之間的結(jié)構(gòu)重排或者相互轉(zhuǎn)化，如莪術(shù)烯與呋喃二烯，導(dǎo)致部分色譜峰的分離難度增大，特別是在36～53 min之內(nèi)的色譜峰群.

3.2 配方顆粒研究的必要性

大多數(shù)批次的醋莪術(shù)配方顆粒HPLC指紋圖譜在152 min內(nèi)均能出峰完全，而少量批次中在保留時間為154 min左右任然會出現(xiàn)一個很小的色譜峰，如使用四川新荷花中藥飲片廠的醋莪術(shù)飲片制備的配方顆粒，所以在指紋圖譜測定中，設(shè)定保留時間為160 min，而且以色譜峰數(shù)量最多的四川新荷花中藥飲片廠的醋莪術(shù)飲片制備的配方顆粒測定得到的指紋圖譜作為參照譜圖.

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

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Study on HPLC Fingerprint of Vinegar Rhizoma Zedoariae Formula Particles

NIE Yingjun，F(xiàn)U Chaomei，LIAO Wan，F(xiàn)U Shu，YAN Xin，GAN Yanxiong
(College of Pharmacy，Chengdu University of TCM，Chengdu 611137，China)

This paper adopts HPLC method，Dikma Diamonsil C18column(4.6 mm ×250 mm，5 μm)as chromatographic column，acetonitrile-water as mobile phase.Gradient elution is used.The detection wavelength is 254 nm.The column temperature is 30 ℃.The flow rate is 1.0 mL·min－1.The HPLC fingerprint common model of vinegar rhizoma zedoariae yinpian is established，and the eight main common peaks are calibrated.By the computer aided similarity evaluation system，fingerprint similarity is analyzed，which indicates greater similarity.The experimental results show that this method is simple and reliable，and has good repeatability，which can be regarded as one of the effective methods for intrinsic quality control of vinegar rhizoma zedoariae formula particles.

vinegar rhizoma zedoariae formula particles;HPLC;fingerprint;quality control

R944.2+7

A

1004－5422(2014)01－0004－04

2014－01－16.

四川省科技支撐計劃(2013S20123)、四川省中醫(yī)藥管理局科技專項(2012－E－041)與四川省科技創(chuàng)新苗子工程(20133006)資助項目.

聶英軍(1986—)，男，碩士研究生，從事中藥新制劑、新技術(shù)與新工藝研究.