張 玨，尹 歡，阮利霞，王躍華

(成都大學(xué)生物產(chǎn)業(yè)學(xué)院，四川成都 610106)

高生物產(chǎn)量川芎細(xì)胞懸浮培養(yǎng)條件優(yōu)化

張 玨，尹 歡，阮利霞，王躍華

(成都大學(xué)生物產(chǎn)業(yè)學(xué)院，四川成都 610106)

在基本培養(yǎng)基為MS的基礎(chǔ)上，研究激素濃度、接種量等因素對川芎懸浮細(xì)胞生長的影響，建立川芎細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系.實驗結(jié)果表明:川芎懸浮細(xì)胞同步化繼代培養(yǎng)液生長16 d左右，對數(shù)生長中后期時，按照1∶4(V/V)懸浮液，新鮮培養(yǎng)液，以MS+6-BA 0.5 mg·L-1+2，4-D 2 mg·L-1+30 g·L-1蔗糖培養(yǎng)基可獲得較高產(chǎn)量的川芎懸浮細(xì)胞，濕重達(dá)到182.6 g·L-1，干重達(dá)到39.2 g·L-1.

川芎;愈傷組織;懸浮細(xì)胞

0 引言

川芎為傘形科多年生草本植物川芎的干燥根莖，是著名的川產(chǎn)道地藥材，其氣濃，味苦、辛，稍有麻舌感，微回甜，具有活血星期，祛風(fēng)止痛的功效［1］.目前，四川地區(qū)所產(chǎn)川芎占全國總產(chǎn)量的90%以上.川芎為無性繁殖，經(jīng)過上千年的栽種，由于缺乏選種育種，導(dǎo)致一定程度的種質(zhì)資源退化，從而影響了藥材質(zhì)量.近年來，科研人員對川芎的野外調(diào)查幾乎沒有找到川芎的野生種群，基本上都是栽培種植［2］.目前，藥用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)因具有巨大的應(yīng)用潛力而得到廣泛應(yīng)用，從大多數(shù)藥用植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的研究現(xiàn)狀來看，其研究內(nèi)容主要集中在提高生物量和次生代謝產(chǎn)物含量方面［3］.本研究在對川芎組織培養(yǎng)獲得適合懸浮細(xì)胞培養(yǎng)愈傷組織基礎(chǔ)上，通過對培養(yǎng)物激素水平和接種量的進(jìn)一步研究，探討了如何提高川芎細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生物產(chǎn)量，擬為在較高細(xì)胞生物產(chǎn)量水平上，進(jìn)一步獲得藥用次生代謝產(chǎn)物提供參考.

1 材料與方法

1.1 懸浮培養(yǎng)用愈傷組織的誘導(dǎo)

實驗所用的川芎采自都江堰川芎種植基地，選取川芎幼嫩葉柄、幼嫩葉及地下莖作外植體.供試外植體均不用水洗，先經(jīng)紫外滅菌30 min，再用1‰的升汞消毒(幼嫩葉柄6～8 min;幼嫩葉5～8 min;地下莖8～10 min)，幼嫩葉柄及幼嫩葉消毒過程中更換1～2次升汞，地下莖消毒過程中更換2～3次升汞，最后全都用無菌水清洗4次.以上操作均在超凈工作臺上進(jìn)行，以避免材料再次污染.其后，將所得外植體接種在MS+6-BA 0.5 mg·L-1+2，4-D 2mg·L-1+30 g·L-1蔗糖培養(yǎng)基中［4-5］.經(jīng)14 ～21 d葉柄葉鞘處長出較疏松的淡黃色愈傷組織，經(jīng)21～28 d主葉柄與副葉柄間長出較緊密的白色愈傷組織.將獲得的愈傷組織在超凈工作臺上，切成3～5 mm左右的小塊，作為研究用懸浮培養(yǎng)材料.1.2 懸浮細(xì)胞繼代同步化培養(yǎng)

1)懸浮細(xì)胞初代培養(yǎng).取固體培養(yǎng)基上繼代15 d左右分散性好的淡黃色疏松愈傷組織2 g，接種時用鑷子將愈傷組織撥碎，盡量不對愈傷組織細(xì)胞造成損傷，接種于盛有50 mL液體基(培養(yǎng)基營養(yǎng)成分與固體培養(yǎng)基相同)容量為150 mL三角瓶中，在120 r/min搖床上恒溫(25±1℃)進(jìn)行懸浮培養(yǎng)(暗培養(yǎng))，懸浮液變?yōu)榈S色渾濁時，開始繼代.

2)懸浮細(xì)胞繼代培養(yǎng).將懸浮培養(yǎng)液搖勻，靜止10 min后，棄下層細(xì)胞團(tuán)塊較大的愈傷組織，取上層培養(yǎng)基及其中的小細(xì)胞團(tuán)塊，按照1∶5(V/V)取懸浮培養(yǎng)液加入新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行第二代培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min.

3)將第二代懸浮培養(yǎng)液靜止后，上層培養(yǎng)液經(jīng)60目尼龍膜過濾［6］，接種于50 mL新鮮液體培養(yǎng)基.經(jīng)連續(xù)二次同步化繼代培養(yǎng)后，繼代培養(yǎng)接種量按照1∶5(V/V)進(jìn)行.最后，將第四代培養(yǎng)物繼代培養(yǎng)于新鮮培養(yǎng)基中，共培養(yǎng)9瓶，備用.

1.3 懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長特性檢測

將經(jīng)同步化后培養(yǎng)的懸浮細(xì)胞，每4 d取1次樣測定其鮮重和干重，每次做3個重復(fù)，取平均值，直到第32 d.每次取出10 mL懸浮液經(jīng)100目銅網(wǎng)過濾，將銅網(wǎng)上的單細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)塊洗脫，測定細(xì)胞的鮮重和干重.

鮮重測定方法.用真空抽濾細(xì)胞培養(yǎng)液并用蒸餾水抽洗2次后稱重，

其中，W1為濾膜、細(xì)胞懸浮液和水的質(zhì)量，W2為濾膜和水的質(zhì)量，V為取樣細(xì)胞液體積.

干重測定方法.鮮重稱量完畢后，將尼龍膜放于60℃烘箱內(nèi)烘12 h，冷卻后稱重，

其中，W3為濾膜和細(xì)胞鮮重質(zhì)量，W4為濾膜質(zhì)量，V為取樣細(xì)胞液體積.

1.4 接種量對懸浮細(xì)胞生長的影響

取同步化培養(yǎng)16 d(對數(shù)生長中后期)的懸浮細(xì)胞液，混合均勻，接種于200 mL MS+6-BA 0.5 mg·L-1+2，4-D 2 mg·L-1+30 g·L-1蔗糖液體培養(yǎng)基，接種量分別為 20、30、40、50、60、70 和 80 mL，檢測細(xì)胞鮮重及干重，繪制生長曲線.

1.5 不同濃度2，4-D生長素對懸浮細(xì)胞生長的影響

以同步化繼代培養(yǎng)16 d的細(xì)胞懸浮液為母液，按照1∶4(V/V)接種到200 mL不同濃度2，4-D生長素培養(yǎng)液中.2，4-D生長素容易誘導(dǎo)出愈傷組織，當(dāng)濃度在0.5 mg·L-1以上時，愈傷組織生長普遍旺盛［5］.因此，本實驗研究不同濃度2，4-D生長素對川芎懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長的影響.以MS+6-BA 0.5 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1為基礎(chǔ)，添加不同量2，4-D生長素，檢測生長到第20 d的川芎懸浮細(xì)胞的鮮重和干重.2，4-D生長素濃度分別為，0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 mg·L-1，每個濃度配制3瓶，每瓶取樣3次，稱量鮮重和干重后，取平均值作為每個濃度的鮮重和干重值.

2 結(jié)果與討論

2.1 川芎細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的生長特性

以愈傷組織誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基營養(yǎng)成分為基準(zhǔn)，配制懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液，MS+6-BA 0.5 mg·L-1+2，4-D 2 mg·L-1+蔗糖 30 g·L-1，pH 值為 5.8，進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，經(jīng)同步化后，檢測第4代川芎懸浮細(xì)胞生長情況，結(jié)果如表1、圖1所示.

從表1、圖1可以看出，川芎懸浮培養(yǎng)細(xì)胞鮮重的增長分為3個生長階段:延遲期(0～4 d)，細(xì)胞增長量較緩慢，到第4 d，僅增長約58%;指數(shù)生長期(8～22 d)，細(xì)胞進(jìn)入快速增長期，到第16 d，細(xì)胞增長量超過4倍，到第20 d，細(xì)胞增長量超過6倍;靜止期(20～32 d)細(xì)胞增長量趨緩，且略呈下降趨勢.干重增長曲線呈現(xiàn)平穩(wěn)上升，到第20 d后，開始緩慢下降.此與與多數(shù)植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生長特性相似［7-8］.

表1 川芎同步化細(xì)胞繼代培養(yǎng)生長情況

圖1 川芎同步化細(xì)胞繼代培養(yǎng)生長特性

可見，在川芎細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過程中，在延遲期和指數(shù)生長期，細(xì)胞的鮮重和干重都呈現(xiàn)上升的趨勢，以一定速率增長，而細(xì)胞的干重增長較為緩慢，且增長平穩(wěn)，進(jìn)入對數(shù)生長期末后，由于營養(yǎng)成分被緩慢消耗，細(xì)胞生長環(huán)境逐漸趨于不利情況，細(xì)胞鮮重和干重均緩慢下降.因此，在懸浮培養(yǎng)搖瓶階段，轉(zhuǎn)接繼代培養(yǎng)應(yīng)在母液培養(yǎng)后的第8～18 d為最佳，此階段同步化細(xì)胞生長較好，細(xì)胞分散良好.

2.2 接種量對懸浮細(xì)胞生長的影響

每個接種量的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液到達(dá)對數(shù)生長期末時的鮮重及干重如表2、圖2所示.

表2 接種量對川芎懸浮細(xì)胞生長的影響

圖2 接種量對川芎懸浮細(xì)胞生長的影響

由表2、圖2可知，接種量太低，則細(xì)胞懸浮液濃度過低，使得細(xì)胞間的物質(zhì)交換不充分，不利于細(xì)胞的生長;細(xì)胞懸浮液的濃度過高，使得細(xì)胞密度過大，對于單個細(xì)胞間營養(yǎng)的吸收不充足，細(xì)胞慢慢地因營養(yǎng)不足而死亡.對于細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)，選擇合適的接種量至關(guān)重要.根據(jù)實驗，母液為在同步化繼代細(xì)胞生長到16 d，鮮重約108 g·L-1時，按照1∶4接種于新鮮培養(yǎng)基，能獲得較大生物產(chǎn)量.

2.3 2，4-D生長素濃度對懸浮細(xì)胞的生長影響

2，4-D生長素濃度的影響對懸浮細(xì)胞生長十分重要［9］.在實驗中，通過配制不同濃度的2，4-D生長素，在懸浮細(xì)胞生長最旺盛的時間段(接種后第20 d)，檢測懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的鮮重及干重，結(jié)果如表3、圖3所示.

表3 2，4-D濃度對懸浮細(xì)胞生長的影響

圖3 不同濃度2，4-D生長素對細(xì)胞生長的影響

由表3、圖3可知，過高或過低濃度的2，4-D生長素對懸浮細(xì)胞的生長都是不利的，2，4-D生長素濃度過低不利于懸浮細(xì)胞的生長，2，4-D生長素濃度過高對懸浮細(xì)胞有毒害作用，當(dāng)2，4-D生長系濃度為2 mg·L-1時在相同培養(yǎng)時間的情況下，能得到較大量細(xì)胞.鏡檢發(fā)現(xiàn)，在該濃度下川芎細(xì)胞有伸長和增大，且細(xì)胞內(nèi)含有葉綠素較多，說明細(xì)胞在進(jìn)行大量繁殖和分裂，細(xì)胞生長量達(dá)到最高值.當(dāng)2，4-D生長素濃度為4 mg·L-1的時候，懸浮細(xì)胞呈深紅棕色，細(xì)胞生長明顯受到抑制，鏡檢發(fā)現(xiàn)此時空細(xì)胞增多，已不利于懸浮細(xì)胞的生長.

3 結(jié)論

細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的起始一般是取一塊植物愈傷組織，接種到培養(yǎng)基中，進(jìn)行搖培.因此，愈傷組織的質(zhì)量高低直接影響到后期建立的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系的優(yōu)劣.本研究以前期川芎組織培養(yǎng)技術(shù)研究為基礎(chǔ)，采用 MS+6-BA 0.5 mg·L-1+2，4-D 2 mg·L-1+30 g·L-1蔗糖培養(yǎng)基誘導(dǎo)出適合懸浮培養(yǎng)的川芎愈傷組織.在液體懸浮初代培養(yǎng)時，未改變培養(yǎng)基配方，僅由固體變?yōu)橐后w，避免了由固體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到液體培養(yǎng)基時，由于培養(yǎng)基成分變化，對細(xì)胞生長造成影響.

將繼代培養(yǎng)后同步化生長細(xì)胞懸液接種于新鮮液體培養(yǎng)基，進(jìn)行轉(zhuǎn)接時間和接種量的研究可為放大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的研究奠定基礎(chǔ).在本實驗中，同步化培養(yǎng)川芎細(xì)胞在培養(yǎng)到第16 d左右的時候，即對數(shù)生長中后期，細(xì)胞生長旺盛、細(xì)胞活力較強(qiáng)，但營養(yǎng)物質(zhì)消耗較快.在此時進(jìn)行轉(zhuǎn)接，加入新培養(yǎng)基，對于細(xì)胞生長的營養(yǎng)補(bǔ)充較適合.

2，4-D細(xì)胞生長素濃度對川芎愈傷組織誘導(dǎo)較重要.2，4-D生長素濃度為2 mg·L-1時，能得到較大量的細(xì)胞，該濃度與固體培養(yǎng)基中川芎愈傷組織誘導(dǎo)使用的2，4-D生長素濃度一致，在過低和過高情況下，細(xì)胞生物產(chǎn)量都會受到影響.

本研究在對川芎愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，通過實驗對影響川芎細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的接種量、植物生長素等因素進(jìn)行了研究，獲得了較高的川芎生物產(chǎn)量，此為下一步在高生物產(chǎn)量基礎(chǔ)上研究次生代謝產(chǎn)物的合成奠定了一定基礎(chǔ).

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Optimization of Cell Suspension Culture Conditions of Lisgusticum Chuanxiong at High Biomass Yield

ZHANG Jue，YIN Huan，RUAN Lixia，WANG Yuehua

(School of Biological Industry，Chengdu University，Chengdu 610106，China)

To set up cell suspension culture system of Lisgusticum chuanxiong and optimize cell culture growth conditions，using MS as the basic medium，we study the impact of hormone concentrations，inoculum and other factors on the growth of suspension cells of Lisgusticum chuanxiong.The experimental results show that，when the synchronized suspension cells subculture of Lisgusticum chuanxiong grows about 16 days to the logarithmic growth medium-late period，according to 1∶4(V/V)suspension which includes fresh culture liquid，MS+6-BA 0.5 mg·L-1+2，4-D 2 mg·L-1as optimal culture medium，higher yields of suspension cells of Lisgusticum chuanxiong can be obtained，whose wet weight and dry weight can reach 182.6 g·L-1and 39.2 g·L-1respectively.

Ligusticum chuanxiong Hort;callus;cell suspension

S567.7+9

A

1004-5422(2014)01-0010-04

2013-11-25.

張 玨(1976—)，女，講師，從事中藥材資源與開發(fā)研究.