劉知行張健東劉小燕李虹輝王開卓陳 琳褚武英張建社

(1．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院, 長沙 410128; 2. 長沙大學(xué)生物工程與環(huán)境科學(xué)系, 長沙 410003; 3. 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 湛江 524088)

鱖小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體PepT1基因分子特征及其表達(dá)研究

劉知行1,2張健東3劉小燕1李虹輝2王開卓2陳 琳2褚武英2張建社2

(1．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院, 長沙 410128; 2. 長沙大學(xué)生物工程與環(huán)境科學(xué)系, 長沙 410003; 3. 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 湛江 524088)

小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體(PepT1)是低親和力、高容量的肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體, 在小肽的吸收過程中發(fā)揮著重要的作用。研究采用同源克隆和RACE技術(shù)克隆了鱖魚(Siniperca chuatsi) PepT1基因全長cDNA序列, 其cDNA序列全長為2480 bp, 包含43 bp的5′UTR序列, 232 bp的3′UTR序列, 以及2205 bp開放閱讀框, 編碼735個氨基酸。氨基酸序列同源性分析結(jié)果顯示, 鱖魚與石斑魚(Epinephelus aeneus)、鱸魚(Dicentrarchus labrax)PepT1間同源性均為89%, 與其他非魚類物種的同源性則在46%—56%。經(jīng)預(yù)測, 鱖魚PepT1編碼蛋白的分子量為64.8 kD,等電點為8.97, 該蛋白具有與哺乳動物同源蛋白相似的12 個螺旋跨膜結(jié)構(gòu), 并且在跨膜區(qū)9和10之間有一個大的外環(huán); 跨膜區(qū)氨基酸高度保守, 并存在有5個膜外N-糖基化位點和3個膜內(nèi)含蛋白激酶C基序的相同區(qū)域。實時熒光定量表達(dá)分析表明, 鱖魚PepT1基因在前腸和中腸中表達(dá)量顯著高于后腸(P<0.05), 這說明前、中腸是鱖魚腸道吸收小肽的主要部位; 在胚后不同發(fā)育階段鱖魚前腸均能檢測到 PepT1基因的表達(dá),并且在10 g個體中表達(dá)量最高, 之后隨著體重的增加其表達(dá)量維持在一個穩(wěn)定水平。本研究結(jié)果首次報道了鱖魚PepT1基因全序列及其分子表達(dá)特征, 為魚類營養(yǎng)及生理學(xué)的研究提供有價值的參考資料。

鱖魚; 小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體; 克隆; 表達(dá)分析

Agar, et al.[1]在1953年首次對小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體進(jìn)行了研究, 然而直到1994年才有人首次成功克隆出兔的小腸小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體, 并將其命名為Ⅰ型肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體(PepT1)[2]。目前對于PepT1的研究還是主要集中在高等脊椎動物PepT1基因的分子結(jié)構(gòu)及其功能關(guān)系[3—9], 關(guān)于魚類PepT1基因的研究還相對較少,已見的報道有斑馬魚(Danio rerio, AY300011)[10]、鯽魚(Carassius auratus, AF295589.1)[11]和大西洋鱈(Gadus morhua, AY921634)[12]等。這些研究為探討魚類PepT1基因的分子結(jié)構(gòu)和生理功能奠定了基礎(chǔ)。在魚類組織中PepT1基因的表達(dá)有著極其重要的意義,它的組織特異性表達(dá)水平不僅能反映組織中細(xì)胞的功能關(guān)系, 而且還能體現(xiàn)出PepT1的轉(zhuǎn)運(yùn)活性[13]。熊剛等[11]研究發(fā)現(xiàn), PepT1基因在鯽魚成魚腸道前段的表達(dá)最高, 并沿著腸道縱軸方向從前往后的表達(dá)水平依次降低, 這為腸段分區(qū)即腸道前、中、后不同部位吸收蛋白質(zhì)的強(qiáng)度不同提供了理論依據(jù)。但魚類腸道PepT1在不同發(fā)育階段的表達(dá)規(guī)律研究尚未見報道。對PepT1在不同發(fā)育階段的表達(dá)進(jìn)行研究,將有助于認(rèn)識魚類PepT1對小肽轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)理。因此, 本研究采用RACE技術(shù)和同源克隆的方法首次克隆得到了鱖魚腸道小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體PepT1 cDNA的全長序列(KF668018), 對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,并首次采用實時熒光定量PCR技術(shù)分析該基因在鱖魚發(fā)育時期不同階段的表達(dá)變化規(guī)律, 為研究小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體PepT1基因在生物體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)小肽的分子機(jī)

1 材料與方法

理奠定了基礎(chǔ)。1.1 試驗材料

實驗成魚取自湖南省衡陽市湘鱖養(yǎng)殖公司。采集體重約500 g鱖魚成體6尾, 分別解剖獲取其前、中、后段腸道樣本, 保存于液氮中。其他階段實驗魚取自湖南省常德市興達(dá)鱖魚繁養(yǎng)場, 按體重不同將鱖魚分為5、10、50、100和250 g五組, 每組分別采集實驗魚6尾, 解剖獲取其前腸樣本, 250 g組取心、肝、腦、腎、白肌和紅肌樣本, 迅速于液氮中冷凍, 稍后保存于–80℃冰箱備用。

1.2 總RNA提取和cDNA第一鏈的合成

取鱖魚成魚腸道不同部位以及不同發(fā)育階段各組鱖魚樣品, 采用Trizol法提取總RNA。在1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測總 RNA的濃度和純度, 保證其A260/A280在1.8至2.0之間。以總RNA為模板, 利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒按說明合成cDNA第一鏈。

1.3 PepT1 基因的克隆

從我們已構(gòu)建的鱖魚成魚肌肉轉(zhuǎn)錄組文庫中找到PepT1序列部分片段, 通過DNAMAN軟件與多種相近魚類進(jìn)行比對分析其保守性。并用Premier5.0軟件在保守區(qū)內(nèi)設(shè)計特異性引物(表1), 由上海鉑尚公司合成。PCR反應(yīng)程序為95℃預(yù)變性3min; 94 ℃30s, 56 ℃ 30s, 72 ℃ 30s,共35個循環(huán); 72℃延伸10min。共設(shè)計 4條引物完成對 3′端片段的克隆, F1S、F2R、3′RACE Olig(T)-Adaptor 和 3′RACE Adaptor, 根據(jù)已獲得的中間片段序列設(shè)計特異性引物 3’F1和 3’F2, 且 3’F1在 3’F2的上游; 其中3′RACE Olig(T)-Adaptor和3′RACE Adaptor 是一對通用引物(表1)。反轉(zhuǎn)錄時, mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的Olig(T)用3′RACE Olig(T)-Adaptor代替; 擴(kuò)增時, 以 F1S和 3′RACE Adaptor為上下游引物進(jìn)行第一輪PCR, 擴(kuò)增條件為: 94℃預(yù)變性3 min;94℃ 30s, 58℃30s, 72℃ 30s,共30個循環(huán); 72℃延伸10min。第一輪產(chǎn)物稀釋50倍后再用F2R和3′RACE Adaptor為上下游引物做第二輪巢式 PCR, 反應(yīng)條件除第三步變?yōu)?0℃ 30s, 其余同上。通過已克隆得到的中間片段,在保守區(qū)內(nèi)用 Premier5.0設(shè)計特異性引物 Pe-F2和Pe-R2, 得到結(jié)果后, 用樣的方法設(shè)計引物 Pe-F3和Pe-R3, 其中Pe-F3在Pe-F2的上游。PCR擴(kuò)增條件: 95℃預(yù)變性3min; 94℃ 30s, 58℃ 30s, 72℃ 1min30s,共35個循環(huán); 72℃延伸10min。采用同源克隆的方法,從石斑魚(Epinephelus aeneus)PepT1 5′端非編碼區(qū)序列設(shè)計引物Pe-F4和從已克隆到的鱖魚PepT1序列設(shè)計引物 Pe-R4克隆鱖魚 PepT1 5′端非編碼區(qū)部分序列。條件為 95℃預(yù)變性 3min; 94℃ 30s, 60℃ 30s, 72℃ 30s, 共35個循環(huán); 72℃延伸10min。各段PCR產(chǎn)物通過 1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測、切膠回收并純化后過夜連接至 pGM-T載體, 轉(zhuǎn)化到感受態(tài)Top10, 藍(lán)白斑篩選通過菌液PCR檢測為陽性克隆后,送至上海鉑尚公司進(jìn)行測序。

表1 PepT1 基因克隆引物Tab. 1 The primers of PepT1 gene

1.4 鱖魚 PepT1基因的不同部位及不同發(fā)育階段表達(dá)分析

分別以鱖魚成魚腸道不同部位(前腸, 中腸, 后腸)及不同發(fā)育階段(5、10、50、100和250 g)cDNA為模板, 用Primer Primer 5.0軟件根據(jù)本實驗室已有的鱖魚 RPL13 (ribosomal protein L13)基因序列(BC063378)設(shè)計熒光定量 PCR內(nèi)參引物: RPL13-F(CACAAGAAGGAGAAGGCTCGGGT), RPL13-R (TTTGG-CTCTCTTGGCACGGAT), 產(chǎn)物長度為120 bp。在所得鱖魚PepT1基因的ORF區(qū)域內(nèi)設(shè)計引物, Pe-FA(GTGAAGATGGTGCTGAAGGTGC), Pe-FB(GAGAAATCCAAAGTCGCCGTT), 產(chǎn)物長度為126 bp; 采用RT-qPCR方法檢測PepT1基因在不同部位及不同發(fā)育階段的表達(dá)差異。實驗中設(shè)置了 6個生物學(xué)樣品重復(fù), 并且每個生物學(xué)樣品有 3個技術(shù)性重復(fù)。qPCR反應(yīng)體系: SYBR?Premix Ex TaqTM(2×) 12.5 μL, dH2O 10 μL, cDNA 1 μL, ROX Reference Dye(50×) 0.5 μL, 引物各0.5 μL。反應(yīng)條件為: 95 ℃ 3min; 95 ℃ 3s, 60 ℃ 25s, 40Cycles;繪制溶解曲線: (65—95)℃ , 每0.05 ℃ 讀板1次; 反應(yīng)結(jié)束后觀察實驗結(jié)果并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

對熒光定量PCR所得的實驗數(shù)據(jù)用Excel 2007軟件進(jìn)行初步處理, 去掉一個最高值和最低值后,用公式計算目的基因的表達(dá)量: 2–ΔΔCt, 其中ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)－(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)對照, Ct表示定量PCR儀上達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù), 通過SPSS16.0軟件對所得的表達(dá)豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)并采用最小顯著差數(shù)法(LSD)進(jìn)行多重比較(P<0.05表示顯著性差異)。所有的結(jié)果都用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)來表示。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用DNA MAN軟件對序列進(jìn)行比對分析, 用MEGA 5.1制作系統(tǒng)進(jìn)化樹, 數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 熒光定量數(shù)據(jù)采用 SPSS 16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析與顯著性檢驗。

2 結(jié)果

2.1 PepT1 cDNA序列和氨基酸序列分析

通過對鱖魚腸道中 PepT1的克隆, 將克隆的PepT1基因序列進(jìn)行拼接得到PepT1基因cDNA全序列, 通過 BLAST分析確認(rèn)為目的基因鱖魚PepT1基因。鱖魚PepT1基因cDNA全長2480 bp (圖1), 其中開放閱讀框ORF區(qū)為2205 bp, 編碼了734個氨基酸, 5′端非編碼區(qū)長43 bp, 3′端非編碼區(qū)長232 bp。

2.2 PepT1預(yù)測蛋白質(zhì)生物學(xué)分析

預(yù)測鱖魚PepT1蛋白質(zhì)分子量大小64.8 kD, 理論等電點 PI值為 8.97。通過在線軟件 TMpred和TMHMM-2.0進(jìn)行鱖魚 PepT1跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測, 其預(yù)測結(jié)果包含多個跨膜域。推薦模型為包含12個跨膜結(jié)構(gòu)域, 它的理論得分值最高; PepT1二級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn), 有3個蛋白激酶C位點和5個N-糖基化位點。通過生物學(xué)信息分析軟件的結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)PepT1是一種含有多個跨膜結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白, N端從第 16個氨基酸殘基(Cys16)開始到第 674 (Tyr674)個氨基酸殘基之間完成跨膜, 其一共進(jìn)行了12次跨膜; 且在第九個和第十個跨膜結(jié)構(gòu)域之間存在一個大的細(xì)胞外環(huán), 這和其他物種的預(yù)測結(jié)果是一致的。

2.3 PepT1氨基酸同源性與進(jìn)化分析

氨基酸序列的同源性結(jié)果分析表明, 鱖魚PepT1氨基酸序列比較于其他物種的同源性相似度都很高, 其中與鱸魚和石斑魚的同源性最高均為89%, 其次是斑馬魚和 云紋平 鲉均為88%, 與人、兔和豬的同源性在50%—56%。運(yùn)用DNAMAN軟件把鱖魚PepT1基因和其他物種該基因進(jìn)行多序列比對結(jié)果顯示, 鱖魚和其他物種之間存在著高度保守,尤其是與其他魚類。

2.4 種間系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

在對翹嘴鱖 PepT1基因進(jìn)行進(jìn)化樹分析, 用NCBI BLASTn(核苷酸-核苷酸)和BLASTX(蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì))搜索同源序列, 選取的魚類有: Epinephelus aeneus (JX122768.1), Danio rerio (AY300011.1), Cyprinus carpio (JN896885.1), Dicentrarchus labrax (FJ237043.2), Sebastes Nebulosus (EU160494.1), Perca flavescens (GQ906471.2), Chionodraco hamatus (AY-170828.2), Anguilla japonica (AB762417.1), Gadus morhua (AY921634.1), Oryctolagus cuniculus (U06467.1), Oreochromis niloticus (XM_003447363.1), Homo sapiens (AF043233.1), Mus musculus (AF205540.1), Sus scrofa (AY180903.1)。然后用MEGA4.1軟件, NJ鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果如下圖2。

2.5 鱖魚 PepT1基因在鱖魚不同部位以及不同發(fā)育階段的表達(dá)差異

采用qPCR方法對鱖魚PepT1基因在不同部位及不同發(fā)育階段的表達(dá)進(jìn)行分析, 用 SPSS 17.0軟件對所得表達(dá)豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(P<0.05), 所有結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。結(jié)果顯示: (1)在250 g鱖魚成魚中, PepT1在前腸中表達(dá)水平最高, 中腸次之, 后腸最低(圖3)。(2)在5 g、10 g、50 g、100 g、250 g和500 g不同發(fā)育時期個體中均檢測到 PepT1基因的表達(dá), 并且PepT1在5 g和10 g組中表達(dá)量較高, 隨著體重的增加在50 g、100 g、250 g和500 g組中反而下降, 其中在10 g組表達(dá)量最高, 且與其他組存在顯著性差異(P<0.05)(圖4)。(3)250 g鱖魚成魚中, PepT1在不同組織中的表達(dá)量, 腸道顯著高于其他組織, 腦次之, 在白肌和紅肌中均檢測到了表達(dá)量(P<0.05)。

圖1 鱖魚PepT1 cDNA全長序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig. 1 Full length cDNA sequences and the the deduced amino acid sequence of PepT1 fromS. chuatsi

3 討論

PepT1是小肽轉(zhuǎn)運(yùn)家族中最先發(fā)現(xiàn)的一種小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體, 它是一種低親和力、高容量的肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體, 其在細(xì)胞中利用質(zhì)子梯度來推動寡肽的吸收, PepT1基因在小腸中的表達(dá)最為顯著, 吸收食物中分解的小肽[14]。目前PepT1在魚類中的研究越來越受人們重視, 在斑馬魚(Danio rerio, AY300011)[10]、鯽魚(Carassius auratus, AF295589.1)[11] 和大西洋鱈(Gadus morhua, AY921634)[12]等中都已經(jīng)有過研究。通過對鱖魚PepT1基因克隆和表達(dá)研究有利于從分子水平闡明鱖魚吸收小肽的調(diào)控機(jī)理。

本研究從鱖魚前腸組織中成功克隆PepT1基因,包括其ORF序列2480 bp, 共編碼735個氨基酸。通過對氨基酸同源性進(jìn)行比對, 結(jié)果發(fā)現(xiàn) PepT1基因在跨膜結(jié)構(gòu)域中具有高度保守, 在大的細(xì)胞外環(huán)之間的氨基酸序列同源性較低, 而以往的研究認(rèn)為這些相似度較高的殘基會在基因的功能和結(jié)構(gòu)上發(fā)揮著重要的作用[12]。預(yù)測結(jié)果顯示, 鱖魚PepT1具有3個蛋白激酶C磷酸化位點(PKC), 5個N-糖基化位點, 在大西洋鮭魚, 鱸魚, 斑馬魚等其他物種中同樣存在這些結(jié)構(gòu)位點; 相關(guān)研究資料認(rèn)為, 蛋白質(zhì)功能位點區(qū)域的氨基酸結(jié)構(gòu)大部分都具有高度保守, 當(dāng)前已經(jīng)有很多研究是關(guān)于功能位點區(qū)域氨基酸保守模式[15]。這些保守區(qū)域能夠?qū)epT1的結(jié)構(gòu)和功能調(diào)節(jié)起著重要的作用[16]。有研究發(fā)現(xiàn) PepT1在Caco-2 (結(jié)腸腺癌細(xì)胞)細(xì)胞系中Gly-Sar 二肽的轉(zhuǎn)運(yùn)規(guī)律中, 使用佛波醇酯激活 PKC能夠抑制PepT1的轉(zhuǎn)運(yùn), 這是由于在Km不變的情況下, 最大速度降低了[17]。把鱖魚和各物種的PepT1基因推測出的氨基酸序列進(jìn)行樹聚類分析, 結(jié)果顯示鱖魚PepT1氨基酸序列和其他物種的同源性在 46%至89%之間。利用PepT1基因XX序列構(gòu)建的進(jìn)化樹符合系統(tǒng)發(fā)生規(guī)律: 鱖魚與鱸魚、石斑魚同屬于鱸形目, 聚為一枝; 魚類物種之間有明顯更近的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系, 而人、鼠、兔等哺乳動物另外聚為一類。

圖2 鱖魚PepT1基因與其他物種PepT1的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig. 2 Phylogenetic analysis of S. chuatsi PepT1 with other species PepT1

PepT1不僅在不同種屬動物體內(nèi)分布不一致,而且在同一個體內(nèi)不同器官的分布亦不一致[18]。有研究發(fā)現(xiàn)在哺乳動物中PepT1 mRNA主要在腎上皮細(xì)胞和小腸中表達(dá)[14], 特別是在腸道中前段的表達(dá)量很高, 在腦細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、結(jié)腸、腎和肝中表達(dá)相對較少[19—20], Ogijara H, et al.對小鼠的研究表明在腸道中, 沿腸管垂直方向的表達(dá)規(guī)律是PepT1 的表達(dá)從絨毛頂部向隱窩逐漸下降; 沿腸管縱軸方向的表達(dá)規(guī)律是從十二指腸到回腸PepT1 逐漸降低等兩種分布模式[21—23], 這種分布的差異性表明了對小肽利用程度和蛋白質(zhì)消化吸收部位的差異。本研究發(fā)現(xiàn)小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體PepT1 基因在鱖魚前腸、中腸、后腸等不同部位的表達(dá), 且在鱖魚前腸表達(dá)最高、中腸其次、后腸最低, 這與我們采用基因芯片技術(shù)所獲得的鱖魚小肽轉(zhuǎn)運(yùn)體基因表達(dá)結(jié)果相一致[24]。據(jù)此推斷, PepT1 在鱖魚腸道組織中的表達(dá)也是沿腸管縱軸方向從前腸到后腸的表達(dá)量逐漸降低, 這和其他的物種, 如虹鱒(O. mykiss)[25]、成體雞[13]、泥鰍(Misgurnus mizolepis Gunther)[26]、歐洲黑鱸(Dicentrarchus labrax)[27]等的研究結(jié)果相同。鱖腸道小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因的組織表達(dá)特征, 為更好的分析小肽的利用和吸收規(guī)律提供基礎(chǔ)。

圖3 鱖魚PepT1在腸道不同部位中的mRNA相對表達(dá)豐度Fig. 3 The abundance of PepT1 mRNA expression in different intestinal position of S. chuatsi (n=6)

圖4 鱖魚PepT1在不同發(fā)育階段的前腸mRNA相對表達(dá)豐度Fig. 4 The abundance of PepT1 mRNA expression in different developmental stages of S. chuatsi (n=6)

圖5 鱖魚PepT1在不同組織中mRNA相對表達(dá)豐度Fig. 5 The abundance of PepT1 mRNA expression in different tissues of S. chuatsi (n=6)

我們將鱖魚不同發(fā)育階段按體重分為6個不同組。PepT1在5、10 g中表達(dá)量較高, 隨著體重的增加在50、100、250、500 g中反而下降且趨于穩(wěn)定, 其中在10 g時表達(dá)量最高且與其他組存在顯著性差異(P<0.05), 因此我們推測, 鱖魚幼魚在約 10 g左右時, 其吸收小肽能力比其他階段更強(qiáng), 有利于滿足其快速生長需要。我們針對250 g成魚中PepT1在不同組織的表達(dá)量發(fā)現(xiàn), 腸道的表達(dá)量顯著高于腦,而腦又高于其他組織, 在非腸道組織中的白肌、紅肌中均有轉(zhuǎn)錄表達(dá), 這為魚類 PepT1在肌肉組織中表達(dá)提供了證據(jù)。

本研究結(jié)果第一次報道了鱖魚PepTl 基因全長序列, 發(fā)現(xiàn)了 PepTl 基因在鱖魚成魚腸道的不同部位的表達(dá)規(guī)律, 以及鱖魚幼魚的成長 PepTl 基因的表達(dá)變化, 和其在氨基酸運(yùn)轉(zhuǎn)中潛在的生理學(xué)功能,為魚類營養(yǎng)生理學(xué)的研究提供有價值的參考資料。

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MOLECULAR CHARACTERIZATION AND EXPRESSION RESEARCH OF OLIGOPEPTIDE TRANSPORTER PEPT1 IN SINIPERCA CHUATSI

LIU Zhi-Xing1,2, ZHANG Jian-Dong3, LIU Xiao-Yan1, LI Hong-Hui2, WANG Kai-Zhuo2, CHEN Lin2, CHU Wu-Ying2and ZHANG Jian-She2

(1. College of Animal Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha, 410128, China; 2. Department of Bioengineering and Environmental Science, Changsha University, Changsha 410003, China; 3. Fisheries College of Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China)

Small peptide transporter (PepT1) is a transporter with low-affinity and high capacity peptide, which plays an important role in the peptide absorption. In order to reveal the molecular mechanism of the small peptide transporter PepT1-mediated protein digestion and absorption, the small peptide transporter PepT1 gene of the Siniperca chuatsi was cloned by using RT-PCR and RACE techniques. The full-length cDNA sequence of the PepT1 was 2480 bp, including 43 nucleotides at 5′UTR and 232 nucleotides at 3′UTR and 2205 nucleotides as an open reading frame encoding a 735-amino-acid peptide. The PepT1 amino acid sequence was determined and it shared a similarity to those of other mammalian homolog protein, which included 12 helix trans-membrane regions and existed a large outer-ring between 9th and 10th of the transmembrane region. Homologous analysis of the PepT1 showed that the amino acid of the PepT1 was highly homologous to those of other vertebrates and it showed high percentages of similarities at 89% with Epinephelus aeneus and Dicentrarchus labrax. In addition, the PepT1 amino acid sequence varied in similarity to other vertebrates from 46% to 56%. The encoded protein molecular weight was predicted at 64.8 kD with pI at 8.97. The quantitative RT-PCR analysis demonstrated that the foregut and midgut may be the key parts of intestinal absorption of small peptides as the PepT1 expression in the foregut and midgut was significantly higher than the hindgut (P<0.05). The PepT1 gene expression was detected in all post-embryonic developmental stages, and it showed a peak expression the growing to about 10g in weight, then the expression remained stable in late developmental stages. The significance of the work first reported the PepT1 cDNA structure and its expression pattern, furthermore, it provided a valuable reference for research on fish nutrition and physiology.

Siniperca chuatsi; Peptide transporter (PepT1); Clone; mRNA expression

Q344+.1

A

1000-3207(2014)03-0556-07

10.7541/2014.78

2013-11-05;

2014-02-15

國家自然科學(xué)基金重點項目(31230076)資助

劉知行(1989—), 男, 湖南婁底人; 碩士; 研究方向水生生物學(xué)。E-mail: 85335251@qq.com

張建社 (1956— ), 男, 湖南長沙人; 博士, 教授; 研究方向魚類發(fā)育分子生物學(xué)。E-mail: jzhang@ccsu.cn劉小燕(1965—), 女, 湖南益陽人; 博士, 教授; 研究方向魚類病害。E-mail: liuxy186@163.com