萬(wàn) 莉 邵路路 陸開(kāi)宏 朱津永 楊 文

(寧波大學(xué)海洋學(xué)院, 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 寧波 315211)

超聲波對(duì)銅綠微囊藻超微結(jié)構(gòu)和生理特性的影響

萬(wàn) 莉 邵路路 陸開(kāi)宏 朱津永 楊 文

(寧波大學(xué)海洋學(xué)院, 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 寧波 315211)

為了研究超聲波對(duì)藍(lán)藻細(xì)胞的影響, 利用超聲波(40W)處理200 mL銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)懸浮液20min, 之后繼續(xù)培養(yǎng)并于不同時(shí)間取樣檢測(cè)。檢測(cè)懸浮藻細(xì)胞生物量發(fā)現(xiàn)其3d降低了97.84%; 分別觀察1、3、5d時(shí)沉降藻細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化, 發(fā)現(xiàn)1—3d時(shí)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)顆粒和藻青素顆粒增多、類囊體片層斷裂、藻膽體脫落, 5d時(shí)擬核區(qū)萎縮消失、細(xì)胞基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)解體、胞質(zhì)出現(xiàn)空洞、胞內(nèi)結(jié)構(gòu)顆粒降解; 檢測(cè)藻細(xì)胞光合放氧速率、葉綠素a (Chl.a)、超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)活性、膜透性以及跨膜ATP酶活性, 發(fā)現(xiàn)光合放氧速率3d下降24.83%, Chl.a含量5d下降23.75%, 超聲組細(xì)胞SOD活性變化幅度比較大, 但總體上活性降低, 而CAT活性則表現(xiàn)為先增后減, 活性始終大于對(duì)照組, 同時(shí)胞內(nèi)有機(jī)物滲出量增大,三種跨膜ATP酶活性(Na+/K+-ATPase、Mg2+-ATPase 和Ca2+-ATPase)均先升后降, 并與膜透性變化相關(guān)。以上結(jié)果表明, 超聲波使銅綠微囊藻細(xì)胞沉降, 并對(duì)其造成了脅迫, 使部分藻細(xì)胞光合作用減弱, 光合色素遭到損傷, 細(xì)胞膜透性增大, 甚至引起藻細(xì)胞程序性死亡。SOD活力的快速降低表明超聲波使藻細(xì)胞內(nèi)超氧離子( O2??)過(guò)量累積, 從而對(duì)藻細(xì)胞造成氧化損傷, 除此之外, 超聲波使藻細(xì)胞基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)破壞、細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)顆粒降解、細(xì)胞膜透性增大, 這些都可能是致使部分銅綠微囊藻細(xì)胞死亡的重要原因。銅綠微囊藻細(xì)胞CAT以及跨膜 ATP酶活性增大, 表明藻細(xì)胞增強(qiáng)抗氧化酶活性以及離子調(diào)控和能量活動(dòng)以抵御超聲波的脅迫,而當(dāng)脅迫隨著時(shí)間減小后, 細(xì)胞開(kāi)始恢復(fù)生長(zhǎng)和代謝, 酶活力開(kāi)始降低。

超聲波; 銅綠微囊藻; 超微結(jié)構(gòu); 光合作用; 抗氧化酶; ATP酶

多年來(lái), 隨著水體富營(yíng)養(yǎng)化現(xiàn)象的日趨嚴(yán)重,頻繁暴發(fā)的藍(lán)藻水華已經(jīng)成為嚴(yán)重影響生態(tài)環(huán)境和人類健康的全球性社會(huì)經(jīng)濟(jì)問(wèn)題。盡管目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出多種治理藍(lán)藻水華的措施, 包括物理打撈、噴灑化學(xué)除藻劑、黏土絮凝以及生物操縱等。但是這些除藻方法在經(jīng)濟(jì)性、安全性和高效性等方面仍存在局限性, 甚至?xí)斐啥挝廴?。而超聲除藻由于其操作?jiǎn)便、能耗低, 無(wú)二次污染等特點(diǎn)被認(rèn)為是極具潛力的治藻技術(shù), 同時(shí)也是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)[1—4]。國(guó)內(nèi)外研究均證實(shí)一定時(shí)間的超聲處理可以有效抑制藻類繁殖, 且與其他除藻方式的有機(jī)結(jié)合能夠達(dá)到更理想的抑藻效果[5—8]。尤其對(duì)具有偽空泡的藍(lán)藻,如微囊藻、超聲對(duì)其的抑制作用更為明顯。研究顯示在超聲輻射后, 微囊藻的沉降率明顯高于其他藻類[9]。一般認(rèn)為主要是由于其內(nèi)部存在大量氣囊, 在超聲波的空化效應(yīng)下, 氣囊受到巨大的壓力而破裂,導(dǎo)致微囊藻喪失了浮力調(diào)節(jié)機(jī)能, 進(jìn)而下沉[10]。然而超聲波對(duì)微囊藻的抑制作用不僅只是簡(jiǎn)單的物理沉降過(guò)程, 而是一個(gè)復(fù)雜而緩慢的生理生化影響過(guò)程。近年來(lái), 關(guān)于超聲波對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞生理生化特性影響的研究只有零星報(bào)道, 研究認(rèn)為超聲波能夠有效破壞藻細(xì)胞吸收光能的天線復(fù)合物和葉綠素, 減慢光合作用, 從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)[11]; 并且誘導(dǎo)藻細(xì)胞發(fā)生脂膜過(guò)氧化反應(yīng), 增加膜透性[9]。但關(guān)于超聲波對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)以及酶活性影響的研究尚未見(jiàn)報(bào)道, 對(duì)微囊藻細(xì)胞抵御超聲波脅迫具體的響應(yīng)機(jī)制了解甚少, 一定程度阻礙了超聲波除藻技術(shù)的發(fā)展。為此, 本研究通過(guò)觀察超聲處理后銅綠微囊藻細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化, 并結(jié)合藻細(xì)胞光合作用、抗氧化酶以及ATP酶等理化特性的變化,旨在闡釋超聲波對(duì)藻細(xì)胞的影響以及藻細(xì)胞抗氧化酶體系和跨膜ATP酶的響應(yīng)機(jī)制, 為超聲波抑制微囊藻水華技術(shù)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)生物材料

銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa FACHB-905),屬于藍(lán)藻門(mén)(Cyanophyta)色球藻目(Chroococcales)微囊藻屬(Microcystis), 單細(xì)胞形態(tài), 購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所。單種培養(yǎng)于光照培養(yǎng)箱(GXZ-268D,寧波江南儀器廠), 溫度(25±0.5) , ℃ 光暗比 12L∶2D, 光照強(qiáng)度為2000 lx, 培養(yǎng)基為BG-11培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻細(xì)胞, 密度約為 2×107個(gè)/mL, 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)用 BG-11培養(yǎng)基將微囊藻懸浮液稀釋至起始濃度約為2.45×104個(gè)/ mL。

1.2 實(shí)驗(yàn)方案

實(shí)驗(yàn)用超聲波(40W)由超聲裝置(Poolsonic, Tomas Electronics BVBA, Belgium)通過(guò)一個(gè)圓柱形探頭發(fā)射出, 探頭半徑2.5 cm, 高15 cm。每組實(shí)驗(yàn), 200 mL藻液裝入500 mL燒杯中, 超聲探頭用酒精棉反復(fù)擦拭消毒后插入藻液液面下 1 cm輻射20min。在超聲輻射后, 將藻液裝入250 mL錐形瓶中, 并培養(yǎng)于光照培養(yǎng)箱, 以此作為超聲組(Ug)。以不做超聲處理的藻液作為對(duì)照組(Cg), 培養(yǎng)于相同條件下。實(shí)驗(yàn)所用玻璃器皿均高壓滅菌后烘干備用,并在無(wú)菌狀態(tài)下操作實(shí)驗(yàn)。

1.3 藻細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察

分別收集超聲組和對(duì)照組培養(yǎng)1、3、5d的藻細(xì)胞, 用4% 戊二醛及1% 鋨酸各固定2h, 之后再用各級(jí)濃度(30%、50%、70%、80%、90%、100%)丙酮脫水, 每級(jí)15min。脫水后的樣品用Epon815 樹(shù)脂在 60℃包埋 2h。包埋塊用超薄切片機(jī)(LKB-V, LKB, Sweden)切片, 切片經(jīng)醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙染色后, 用透射電鏡(JEM-1200EX, JEOL, Japan)觀察并拍照。

1.4 生理指標(biāo)測(cè)定方法

藻細(xì)胞超聲處理前即對(duì)相關(guān)理化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定作為0d檢測(cè)指標(biāo), 經(jīng)20min超聲處理后分別于0.25、0.5、1、3、5d離心取樣檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。懸浮藻細(xì)胞生物量采用紫外-分光光度計(jì)(WFZ UV-2000, 龍尼柯(上海)儀器有限公司)測(cè)量藻懸液在波長(zhǎng)560 nm處的光密度值, 即以O(shè)D560表示懸浮藻細(xì)胞生物量; 葉綠素a測(cè)定采用Hao, et al.的方法[10], 實(shí)驗(yàn)測(cè)定全部藻細(xì)胞葉綠素a含量; 光合放氧速率采用液相氧電極(Oxytherm, Hansatech Instrument Ltd., U.K.)測(cè)定;細(xì)胞膜透性的測(cè)定參照謝田和徐中際的紫外吸收法[12]并加以改進(jìn), 即取適量藻液, 用冷凍離心機(jī)(Biofuge Primo R, Thermo Scientific, Germany) 4 ℃, 3000 r/min低溫離心10min后取上清液于264 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值, 以O(shè)D264值表示細(xì)胞內(nèi)有機(jī)物滲出量測(cè)定細(xì)胞膜透性。

藻細(xì)胞酶提取液的制備: 4000 r/min離心收集藻細(xì)胞, 以0.05 mL/L磷酸鹽緩沖液作為懸浮液(其中ATP酶液的制備采用超純水做為懸浮液), 在–20℃和4℃下進(jìn)行反復(fù)凍融。在–20℃下分別冷凍1、2、3、6h后, 于4℃解融, 每組反復(fù)凍融6次, 將破碎得到的提取液離心(10000 r/min, 4 ℃ ) 20min 后, 收集上清液, –20℃保存待測(cè)。采用南京建成生物工程研究所酶試劑盒測(cè)定各種酶活力。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析在 SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件上進(jìn)行,不同處理之間差異采用獨(dú)立樣本 T檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析, P<0.05為差異顯著, P<0.01為差異極顯著。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次, 文中數(shù)據(jù)均為各次實(shí)驗(yàn)平均值。文中用 Origin 8.0進(jìn)行繪圖, 圖中誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。

2 結(jié)果

2.1 超聲波對(duì)懸浮銅綠微囊藻細(xì)胞生物量的影響

在超聲處理后, 懸浮銅綠微囊藻細(xì)胞生物量的變化如圖1所示。超聲組懸浮藻細(xì)胞生物量在超聲后 0.25d便顯著下降, 約為初始值的 15.55%, 至3d時(shí)降為最低, 僅為初始值的 2.16%, 而對(duì)照組藻細(xì)胞隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)不斷增加, 5d時(shí)藻細(xì)胞生物量增加了38.52%, 說(shuō)明超聲波能夠使銅綠微囊藻細(xì)胞沉降。此外, 超聲組懸浮藻細(xì)胞在5d 時(shí)又略微上升為初始值的 5.17%, 則說(shuō)明經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng), 部分藻細(xì)胞可能開(kāi)始恢復(fù)生長(zhǎng)。

圖1 超聲波對(duì)懸浮銅綠微囊藻細(xì)胞生物量的影響Fig. 1 The effect of ultrasound on biomass of suspension M. aeruginosa cells

2.2 超聲波對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

分別在1、3、5d取底部沉降的藻細(xì)胞進(jìn)行處理并運(yùn)用透射電鏡觀察。圖片顯示部分底部藻細(xì)胞出現(xiàn)了調(diào)亡現(xiàn)象, 銅綠微囊不同階段的凋亡特征如圖2。對(duì)照組藻細(xì)胞細(xì)胞壁完整, 外形規(guī)則; 類囊體光合片層結(jié)構(gòu)豐富并且排列整齊; 高電子密度的藻膽體均勻依附于類囊體周圍; 胞質(zhì)中分布著少量的多磷酸體、多面體以及脂質(zhì)顆粒等(圖2A1、A2)。與對(duì)照組相比, 超聲處理后的藻細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化明顯, 而且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)損傷加劇。1d后, 類囊體變得分散, 并有部分?jǐn)嗔? 依附于類囊體片層的藻膽體減少, 分散在胞質(zhì)中; 此外, 胞質(zhì)中脂質(zhì)顆粒增多, 并出現(xiàn)藻青素顆粒、間體等內(nèi)含物(圖2B1、B2); 3d后, 核質(zhì)開(kāi)始向四周擴(kuò)散, 類囊體和藻膽體進(jìn)一步減少(圖2C1、C2); 5d時(shí), 藻細(xì)胞萎縮變形, 出現(xiàn)了明顯的質(zhì)壁分離現(xiàn)象, 但細(xì)胞壁仍保持完整; 胞質(zhì)中的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)變得模糊甚至消失; 擬核區(qū)出現(xiàn)大片空洞; 藻青素、脂質(zhì)等顆粒物質(zhì)也開(kāi)始降解(圖2D1、D2)。

圖2 超聲波對(duì)沉降銅綠微囊藻細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響Fig. 2 The effect of ultrasound on ultrastructure of sedimentary M. aeruginosa cells

2.3 超聲波對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞光合作用的影響

光合放氧速率是衡量藻細(xì)胞光合作用狀況的重要指標(biāo), Chl.a是銅綠微囊藻光合作用最主要的色素,它們都對(duì)光合作用系統(tǒng)起著至關(guān)重要的影響。因此,為了闡明超聲波對(duì)藻細(xì)胞光合作用的影響, 檢測(cè)了銅綠微囊藻細(xì)胞光合放氧速率和 Chl.a含量的變化(圖3)。發(fā)現(xiàn)超聲組藻細(xì)胞的光合放氧速率隨著時(shí)間不斷降低, 3d時(shí)降至最低, 僅為初始值的75.17%, 5d時(shí)略有升高, 而對(duì)照組光合放氧速率不斷上升(圖3A)。超聲組Chl.a含量在處理后1d內(nèi)變化不明顯,甚至有小幅的波動(dòng), 3d時(shí)才明顯下降, 到5d時(shí)下降了 23.75%, 而對(duì)照組的 Chl.a含量則不斷增加(圖3B)。這表明超聲波減弱銅綠微囊藻的光合作用, 破壞光合作用色素。但光合放氧速率在5d后又略微上升, 則說(shuō)明藻細(xì)胞可能存在某些響應(yīng)機(jī)制抵御超聲脅迫進(jìn)而恢復(fù)代謝。

2.4 超聲波對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞抗氧化酶活性的影響

從圖4A可以看出, 超聲處理后的藻細(xì)胞SOD活性先升高, 之后迅速降低, 1d時(shí)SOD活性達(dá)到最低, 為 21.47 U/mg蛋白, 比同期對(duì)照組低 31.32% (P<0.05)。而第3天時(shí)SOD活性又迅速升高至29.32 U/mg 蛋白, 之后再持續(xù)下降, 5d時(shí)超聲組比對(duì)照組低26.15% (P<0.05)。CAT活性的變化則與SOD有所不同, 0—0.25d CAT活力顯著升高, 之后上升趨勢(shì)趨緩, 但在1d后又上升明顯, 至3d時(shí)最高, 為同期對(duì)照組的4.5倍(P<0.01)(圖4B)。綜觀以上結(jié)果,超聲組細(xì)胞SOD活性變化幅度比較大, 但總體上活性降低, 而 CAT活性則表現(xiàn)為先增后減, 活性始終大于對(duì)照組。

2.5 超聲波對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞膜透性和跨膜 ATP酶活力的影響

圖3 超聲波對(duì)銅綠微囊藻光合放氧速率(A)和Chla (B)的影響Fig. 3 The effect of ultrasound on photosynthetic oxygen evolution rate (A) and Chlorophyll a (B) of M. aeruginosa

圖4 超聲波對(duì)銅綠微囊藻SOD (A)和CAT (B)活性的影響Fig. 4 The effect of ultrasound on SOD (A) and CAT (B) activities of M. aeruginosa

在超聲處理之后, 檢測(cè)了培養(yǎng)液中有機(jī)質(zhì)的滲出量(圖5)。超聲20min后, 從0.5d開(kāi)始, 超聲組藻細(xì)胞有機(jī)物滲出量分別比對(duì)照組高 47.17%、64.81%、52.73%和30.52%, 1d時(shí)膜透性最大。而對(duì)照組的滲出量無(wú)明顯變化。說(shuō)明超聲波處理增大了藻細(xì)胞膜透性。

超聲波處理還明顯提高了銅綠微囊藻細(xì)胞膜上ATP酶活性(表 1), 1d時(shí)以上三種 ATP酶(Na+/K+-ATPase 、Mg2+-ATPase 和Ca2+-ATPase)活性均達(dá)到最高(分別是對(duì)照組的2.47、2.02、1.37倍), 之后緩慢降低, 但始終高于對(duì)照組和初始值。而對(duì)照組ATP酶活性無(wú)明顯變化。值得一提的是, 細(xì)胞膜透性和ATP酶活性變化趨勢(shì)相似。通過(guò)Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)膜透性與 Na+/K+-ATPase、Mg2+-ATPase和Ca2+-ATPase活性的相關(guān)系數(shù)分別為 0.94 (P<0.05)、0.945(P<0.05)、0.991(P<0.001), 這說(shuō)明細(xì)胞膜透性與ATP酶活性之間顯著性相關(guān), 特別與Ca2+-ATPase活性之間極顯著相關(guān)。

圖5 超聲波對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞膜透性的影響Fig. 5 The effect of ultrasound on cell membrane permeability of M. aeruginosa

3 討論

表1 超聲波對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞ATP酶活力的影響Tab. 1 The effect of ultrasound on ATPase activity of M. aeruginosa

3.1 超聲波對(duì)銅綠微囊藻超微結(jié)構(gòu)和光合作用的影響

在實(shí)驗(yàn)條件下, 超聲波在短時(shí)間內(nèi)迅速沉降了水體中懸浮銅綠微囊藻細(xì)胞, 僅 0.25d生物量就下降了85% (圖1)。懸浮藻細(xì)胞迅速沉降水底的最主要原因是超聲波的空穴效應(yīng)破壞了藻細(xì)胞內(nèi)的氣囊結(jié)構(gòu), 使其不能懸浮, 進(jìn)而下沉[10]。為了更深入了解超聲波對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響, 研究了底部沉降的藻細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化, 發(fā)現(xiàn)部分藻細(xì)胞受到明顯損傷。在藻細(xì)胞遭遇環(huán)境脅迫時(shí), 胞內(nèi)通常會(huì)出現(xiàn)一些特殊的內(nèi)含物顆粒, 最典型的就是藻青素顆粒和脂質(zhì)顆粒等[13,14]。在本研究中, 超聲波處理后的底部藻細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)顆粒增多(圖2), 出現(xiàn)藻青素顆粒, 這表明銅綠微囊藻細(xì)胞遭到了超聲波的脅迫。不僅如此, 藻細(xì)胞的類囊體片層也逐漸斷裂(圖2), 而類囊體是銅綠微囊藻細(xì)胞光合作用的主要場(chǎng)所, 全部或幾乎所有的 Chl.a及許多類胡蘿卜素都在類囊體片層內(nèi)[15]。藻膽體附著在類囊體片層表面, 是吸收光能的天線復(fù)合物, 并將吸收的光能傳遞給 Chl.a, 是光合作用能量吸收和傳遞的功能單位[16]。在超聲波處理后, 部分藻細(xì)胞的藻膽體脫離類囊體, 分散在胞質(zhì)中, 導(dǎo)致光合作用電子傳遞鏈遭到破壞, 勢(shì)必會(huì)減弱光合作用。因此這也是本試驗(yàn)中的藻細(xì)胞光合放氧速率降低的重要原因之一(圖3A)。Zhang, et al.[11]用25 kHz, 0.32 W/mL超聲波處理銅綠微囊藻5min, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)光合放氧速率降低了 40.5%, 而且還發(fā)現(xiàn)藻膽體中的藻藍(lán)蛋白活性和Chl.a含量分別降低了44.8%和21.3%。Lee, et al.[2]用28 kHz, 120 W超聲波處理藻細(xì)胞30 s, 也發(fā)現(xiàn)Chl.a含量下降20%。而在本研究中, Chl.a含量也減少了 23.75% (圖3B), 這說(shuō)明超聲波不僅破壞電子傳遞鏈, 還會(huì)損壞光合色素, 進(jìn)一步抑制光合作用。此外, Chl.a在培養(yǎng)3d后才明顯減少, 出現(xiàn)上述現(xiàn)象的原因可能是 Chl.a位于類囊體片層內(nèi), 類囊體膜對(duì)其起到了一定的保護(hù)作用, 隨著類囊體逐漸斷裂, Chl.a才逐步受到損傷。

另外, 超聲處理后受損傷的銅綠微囊藻細(xì)胞亦出現(xiàn)擬核區(qū)逐漸萎縮消失、胞內(nèi)基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)解體, 胞質(zhì)空洞化、細(xì)胞膜損傷、質(zhì)壁分離等現(xiàn)象, 而且到5d時(shí), 胞內(nèi)的藻青素、脂質(zhì)顆粒等也開(kāi)始降解(圖2)。Hong, et al.[17]研究蘆竹堿對(duì)銅綠微囊藻的抑制作用, 發(fā)現(xiàn)藻細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化, 如類囊體斷裂, 藻膽色素減少, 脂質(zhì)小球和藻青素顆粒先變多之后再被溶解, DNA斷裂成碎片等, 并認(rèn)為蘆竹堿導(dǎo)致銅綠微囊藻出現(xiàn)細(xì)胞程序性死亡。郭莎莎等[18]研究銅綠微囊藻細(xì)胞死亡過(guò)程中形態(tài)和生理變化, 在黑暗限氣條件下, 發(fā)現(xiàn)類囊體等細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)解體、藻細(xì)胞出現(xiàn)空泡、胞質(zhì)固縮形成結(jié)構(gòu)顆粒,但細(xì)胞壁完整等與真核細(xì)胞程序性死亡類似的特征,并據(jù)此推測(cè)原核藻細(xì)胞與真核細(xì)胞一樣具有程序性死亡機(jī)制。而在后生動(dòng)物細(xì)胞程序性死亡過(guò)程中,也可以觀察到染色質(zhì)濃縮, 隨后斷裂成小片段; 核膜及細(xì)胞膜內(nèi)陷, 細(xì)胞支架斷裂, 形成凋亡小體等形態(tài)學(xué)特征變化[19]。因此, 有研究者用“類凋亡”(Apoptosis-like)來(lái)描述藻類的這種類似細(xì)胞死亡方式[20]。據(jù)本研究中超微結(jié)構(gòu)形態(tài)變化推斷, 超聲波脅迫可能導(dǎo)致部分銅綠微囊藻細(xì)胞程序性死亡或是“類凋亡”。在本試驗(yàn)中, 超聲波沉降了 90%以上的懸浮藻細(xì)胞, 而光合放氧速率和 Chl.a含量只降低了 20%—30%, 而且觀察沉降藻細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)時(shí),也發(fā)現(xiàn)只有部分藻細(xì)胞凋亡。推測(cè)原因可能是藻細(xì)胞具有某些防御體系抵御超聲波的脅迫, 致使只有部分藻細(xì)胞的光合作用系統(tǒng)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到損傷。而未受損傷的藻細(xì)胞, 會(huì)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng), 逐漸恢復(fù)生長(zhǎng)和代謝(圖1、圖3A)。Lee, et al.[21]就曾發(fā)現(xiàn)在光照條件下, 藍(lán)藻細(xì)胞在超聲波處理 1—3d內(nèi)能重新生成氣囊, 恢復(fù)浮力。這也從另一方面印證了以上推測(cè)。

3.2 超聲波對(duì)銅綠微囊藻抗氧化酶的影響

超聲波作為一種物理刺激, 具有多種生物效應(yīng), 最明顯的便是破裂介質(zhì)中的氣泡形成空穴作用, 氣泡中的能量釋放從而產(chǎn)生超氧離子(?)、羥基離子(OH–)以及過(guò)氧化氫(H2O2)等活性氧(ROS)分子[22—24]。ROS水平升高會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷或死亡。為了抵御氧化脅迫, 藻細(xì)胞在進(jìn)化過(guò)程中形成了一系列復(fù)雜的抗氧化防御體系。SOD和 CAT是抗氧化酶體系中兩種重要的酶, 對(duì)氧化脅迫造成的細(xì)胞損傷具有很強(qiáng)的防御和保護(hù)功能。SOD是細(xì)胞對(duì)抗ROS的第一道防線[25], 主要將細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的?歧化為 H2O2和 H2O。在本研究中, 超聲之后的藻細(xì)胞 SOD活性變化幅度較大, 但總體上活性降低。一般認(rèn)為, 當(dāng)細(xì)胞內(nèi)自由基含量增加時(shí), 抗氧化酶活力也會(huì)升高; 但過(guò)量的自由基則會(huì)破壞抗氧化酶體系, 使其活性降低[26]。這意味著超聲波致使藻細(xì)胞內(nèi)?過(guò)量累積, SOD不能及時(shí)清除導(dǎo)致其活性降低, 使藻細(xì)胞造成氧化損傷。這也可能是超聲波致使銅綠微囊藻細(xì)胞凋亡的重要原因之一。值得一提的是, 在本研究中, 超聲波脅迫后的藻細(xì)胞, SOD活性在第 3 天時(shí)有明顯的恢復(fù)現(xiàn)象(圖4A)。Chen, et al.[22]研究了免疫金定位 紫 球 藻(Porphyridium cruentum), 即超聲輻射60s后, 藻細(xì)胞SOD活力增加了49.8%。Al-Hamdani, et al.[24]用20 kHz, (16—18)W 的超聲波輻射極大螺旋藻(Spirulina maxima) 5s, 發(fā)現(xiàn)藻細(xì)胞SOD活性下降?？梢园l(fā)現(xiàn), 本試驗(yàn)結(jié)果與以上研究有差異, 出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因之一可能是不同種類藻細(xì)胞 SOD對(duì)超聲波的響應(yīng)機(jī)制不同。此外, 超聲波的頻率、功率以及作用時(shí)間不同也是影響因素之一。另外, 不同離子結(jié)合形態(tài)的SOD酶對(duì)ROS的響應(yīng)機(jī)制也有所不同。Bridges 和 Salin[27]就曾發(fā)現(xiàn) H2O2對(duì) Cu-Zn SOD和Fe-SOD有抑制作用, 而對(duì)Mn-SOD則無(wú)明顯的作用。這說(shuō)明SOD對(duì)超聲波的響應(yīng)可能具有藻細(xì)胞種群特異性以及酶形態(tài)特異性。

藻細(xì)胞中CAT主要將H2O2歧化為H2O和O2,防止過(guò)量的H2O2破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。在本研究中, 超聲處理后的藻細(xì)胞CAT活力逐漸增大, 表明胞內(nèi)H2O2含量增加, 這與Chen, et al.[21]的研究結(jié)果類似。在細(xì)胞內(nèi), 除了SOD歧化?生成H2O2外, 其他如胺氧化酶、過(guò)氧化物酶、草酸氧化酶也能歧化產(chǎn)生H2O2[28]。由于在本試驗(yàn)中 SOD活性降低, 1d后的H2O2可能來(lái)源于以上酶反應(yīng)。Hong, et al.[29]研究顯示, 1 mg/L濃度的2-甲基乙酰乙酸乙酯(EMA)增強(qiáng)銅綠微囊藻細(xì)胞CAT活性, 但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),CAT活力開(kāi)始下降。同樣的變化亦發(fā)生在 Cu2+和Zn2+脅迫下的巴夫藻(Pavlova viridis)細(xì)胞中, 并認(rèn)為細(xì)胞增強(qiáng)抗氧化酶活性以抵御金屬離子引起的氧化脅迫[30]。在本研究中, 銅綠微囊藻CAT活性也出現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì)變化, 表明超聲波脅迫激活了藻細(xì)胞抗氧化防御機(jī)制, 以降低H2O2對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的氧化傷害。然而, 隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng), 部分未受損傷的藻細(xì)胞開(kāi)始恢復(fù)生長(zhǎng)與代謝(圖1、圖3A), 表明氧化脅迫減小, 因此, CAT活性也開(kāi)始下降恢復(fù)至正常水平。

3.3 超聲波對(duì)銅綠微囊藻膜透性和ATP酶的影響

一般認(rèn)為, ROS能破壞細(xì)胞內(nèi)的某些成分和功能結(jié)構(gòu), 最明顯的就是誘導(dǎo)細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)。此外, 超聲波空穴效應(yīng)也能生成高強(qiáng)度的液體剪切力撕裂細(xì)胞膜[31]。以上兩個(gè)因素均會(huì)導(dǎo)致超聲波增大藻細(xì)胞膜透性。在本研究中,超聲處理后的銅綠微囊藻細(xì)胞有機(jī)物滲出量增大,表明細(xì)胞膜透性增大。同時(shí), Tang, et al.[9]和Chen, et al.[22]研究超聲波對(duì)銅綠微囊藻細(xì)胞膜透性的影響, 也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果。

ATP酶是細(xì)胞膜上依賴于ATP的離子調(diào)控蛋白酶, 對(duì)維持細(xì)胞膜電位以及細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境滲透壓的平衡有著重要作用。那么, ATP酶活性與細(xì)胞膜透性之間是否有聯(lián)系？研究顯示, 超聲波處理人參細(xì)胞[23]或纖維細(xì)胞[32]后, 出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度增加, K+外流等現(xiàn)象。Honda, et al.[33]利用1MHz, 4.9 W/cm2的超聲波輻射人骨髓單核淋巴瘤細(xì)胞, 也發(fā)現(xiàn)了相似的現(xiàn)象并認(rèn)為Ca2+增加是由于非特異性的細(xì)胞外涌入。而Kumon, et al.[34]則推測(cè)認(rèn)為超聲波造成細(xì)胞膜上出現(xiàn)非特異性小孔是引起 Ca2+增加的部分原因。據(jù)此推測(cè)超聲波在增大細(xì)胞膜透性的同時(shí)亦會(huì)增加膜內(nèi)外離子流動(dòng)性。在本研究中, ATP酶活性與細(xì)胞膜透性的顯著相關(guān)性也印證了以上觀點(diǎn)。膜內(nèi)外離子流動(dòng)會(huì)破壞細(xì)胞滲透壓平衡, 另外, 細(xì)胞內(nèi)過(guò)多的 Ca2+累積亦會(huì)引起細(xì)胞中毒, 甚至調(diào)亡[32]。因此, 為了維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡以及抵御 Ca2+脅迫, 跨膜ATP酶活性增強(qiáng)。Liu, et al.[35]研究顯示, 20 kHz、(2—10)W的低強(qiáng)度超聲波作用于蘆薈愈傷組織細(xì)胞(2—10)s, Ca2+-ATP酶活性增大。Chen, et al.[22]對(duì)紫球藻的研究顯示, Na+/K+-ATPase和Ca2+/Mg2+-ATPase活性分別增加了67.7%和69.3%。在本研究中, 超聲組銅綠微囊藻細(xì)胞的 3種 ATP酶(Na+/K+-ATPase、Mg2+-ATPase 和 Ca2+-ATPase)活性均表現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì), 總體水平始終高于對(duì)照組(表 1),這說(shuō)明銅綠微囊藻細(xì)胞增強(qiáng)離子調(diào)控和能量活動(dòng)以抵御超聲波所引起的脅迫, 而隨著脅迫的逐漸減小, ATP酶活性亦開(kāi)始降低。

綜上所述, 超聲波不僅使銅綠微囊藻沉降, 并對(duì)藻細(xì)胞造成了脅迫, 使部分藻細(xì)胞光合作用減弱,光合色素遭到損傷, 并增大細(xì)胞膜透性, 甚至引起藻細(xì)胞程序性死亡。SOD活力的快速降低表明超聲波使藻細(xì)胞內(nèi)2O??過(guò)量累積, 從而對(duì)藻細(xì)胞造成氧化損傷。除此之外, 超聲波使藻細(xì)胞基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)破壞、細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)顆粒降解、細(xì)胞膜透性增大, 這些都可能是導(dǎo)致部分銅綠微囊藻細(xì)胞死亡的重要原因。銅綠微囊藻細(xì)胞CAT以及跨膜ATP酶活性增大, 表明藻細(xì)胞增強(qiáng)抗氧化酶活性以及離子調(diào)控和能量活動(dòng)以抵御超聲波的脅迫, 而當(dāng)脅迫隨著時(shí)間減小后,細(xì)胞開(kāi)始恢復(fù)生長(zhǎng)和代謝, 酶活力開(kāi)始降低。

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EFFECTS OF ULTRASOND WAVE ON THE ULTRASTRUCTURE AND PHYSIOLOGICAL CHARACTERISTICS OF BLUE-GREEN ALGAE (MICROCYSTIS AERUGINOSA)

WAN Li, SHAO Lu-Lu, LU Kai-Hong, ZHU Jin-Yong and YANG Wen
(Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology, Ministry of Education, School of Marine Science, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

To study the effects of ultrasound wave on the blue-green algae (Microcystis aeruginosa), blue-green algae were exposed to ultrasound waves (40W) for 20 minutes, and then cultured for 1, 3, and 5 days. The results indicated that the biomass of suspended algae cells reduced by 97.84% at Day 3. From Day 1 to Day 3, lipid bodies and cyanophycin granules were accumulated, and thylakoid layers were cracked, and phycobilisomes attached to thylakoid dropped off in the cells. At Day 5, the nucleoid area gradually shrinked or disappeared, the cell infrastructure disintegrated, and voids appeared in cytoplasm and intracellular granules were degraded. Moreover, the photosynthetic oxygen evolution rate decreased by 24.83% on Day 3. Chl.a content reduced by 23.75% on Day 5. SOD activity and CAT activity were induced by ultrasound, although both of the activities diminished from Day1 to Day 5. The amount of intracellular organic exudation increased after treatment. The activities of three ATPases (Na+/K+-ATPase, Mg2+-ATPase and Ca2+-ATPase) increased firstly and then decreased, which was related to the change of membrane permeability. These results suggested that ultrasound wave may reduce algae photosynthesis, damage photosynthetic pigments and increase the membrane permeability, which can cause oxidative damage and induce death of M. aeruginosa. The dynamic CAT and ATPases activities suggested that M. aeruginosa may enhance antioxidant enzymes activity as well as ion regulation and energy activity to resist the ultrasound stress, and that the growth and metabolism of algae cells began to recover over time while the enzyme activities began to decline.

Ultrasound; Microcystis aeruginosa; Ultrastructure; Photosynthesis; Antioxidant enzyme; ATPase

Q938.8

A

1000-3207(2014)03-0516-09

10.7541/2014.73

2013-05-16;

2013-12-10

國(guó)家教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(20123305110001); 國(guó)家自然科學(xué)基金(30771658); 寧波市重大科技攻關(guān)項(xiàng)目(2008C50017); 寧波大學(xué)研究生科研創(chuàng)新基金(G12JA029); 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31302192); 浙江省教育廳科研項(xiàng)目(Y201327177); 寧波市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2013A610171)資助

萬(wàn)莉(1989—), 女, 重慶萬(wàn)州人; 碩士研究生; 主要從事水域生態(tài)研究。E-mail: whkjdxwanli@163.com

陸開(kāi)宏, E-mail: lukaihong@nbu.edu.cn