吳旭東肖 偉連總強侯玉霞

(1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 蘭州 730070; 2. 寧夏回族自治區(qū)水產(chǎn)研究所, 銀川 750001; 3. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院, 北京 100193)

WU Xu-Dong1,2, XIAO Wei2, LIAN Zong-Qiang1,2and HOU Yu-Xia3

(1. College of Animal Science and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China; 2. Ningxia Fisheries Research Institute, Yinchuan 750001, China; 3. College of Science, China Agricultural University, Beijing 100193, China)

蘭州鲇線粒體Cytb基因的克隆與序列分析

吳旭東1,2肖 偉2連總強1,2侯玉霞3

(1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 蘭州 730070; 2. 寧夏回族自治區(qū)水產(chǎn)研究所, 銀川 750001; 3. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院, 北京 100193)

為克隆蘭州鲇(Silurus lanzhouensis)線粒體Cytb基因全序列, 根據(jù)歐洲鲇(Silurus glanis)線粒體基因全序列設(shè)計特異引物進(jìn)行蘭州鲇線粒體Cytb基因的PCR擴(kuò)增, 得到1138 bp蘭州鲇線粒體Cytb基因序列。對蘭州鲇和其他13種魚的線粒體Cytb基因核苷酸和氨基酸序列之間進(jìn)行同源性比較, 結(jié)果顯示具有較高的同源性, 核苷酸同源性介于61.38%—91.12%, 氨基酸同源性介于76.62%—95.52%。對蘭州鲇、歐洲鲇、大口鲇(Silurus meridionalis)、鲇(Silurus asotus)、越南鲇(Silurus cochinchinensis)的Cytb基因之間進(jìn)行堿基替代分析, 結(jié)果顯示蘭州鲇Cytb基因與鲇之間替換率最低, 值為8.87%, 轉(zhuǎn)換/顛換值為3.21; 與越南鲇之間替換率最高, 值為14.41%, 轉(zhuǎn)換/顛換值為1.83。對本文克隆的蘭州鲇Cytb基因與王慶容等測定的蘭州鲇線粒體Cytb序列進(jìn)行序列差異分析, 結(jié)果顯示兩者之間替換率為 11.16%, 存在 127個變異位點, 轉(zhuǎn)換/顛換比為4.08, 遺傳距離為0.1230。由NJ法基于蘭州鲇和其他13種魚的Cytb基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹, 結(jié)果顯示與傳統(tǒng)的分類地位基本吻合。

蘭州鲇; 線粒體Cytb; 序列分析

蘭州鲇(Silurus lanzhouensis)又名黃河鲇, 隸屬于鲇形目(Siluriformes)鲇科(Siluridea)鲇屬(Silurus),是黃河中上游特有的大型經(jīng)濟(jì)魚類。但近年來, 由于過度捕撈, 水域環(huán)境惡化及繁殖場所破壞, 蘭州鲇種群數(shù)量急劇下降, 已被列為《中國物種紅色名錄》(第二卷)中的瀕危物種[1]。目前, 有關(guān)蘭州鲇的研究主要集中在蘭州鲇分類學(xué)、形態(tài)學(xué)、營養(yǎng)學(xué)、繁殖學(xué)和遺傳結(jié)構(gòu)等方面。陳湘遴首次定名鲇屬新種蘭州鲇[2]; 吳旭東等于黃河寧夏段首次發(fā)現(xiàn)了寧夏鲇屬一新記錄種—蘭州鲇, 對其形態(tài)學(xué)進(jìn)行了較詳細(xì)的研究, 隨后對蘭州鲇毒理學(xué)、繁殖學(xué)、育種學(xué)和遺傳結(jié)構(gòu)等方面進(jìn)行了系統(tǒng)研究[3—6]; 邱小琮等對蘭州鲇肌肉營養(yǎng)成分、消化酶活性和飼料學(xué)等方面進(jìn)行了研究[7,8]; 王慶容等應(yīng)用 PCR直接測序法測定了蘭州鲇線粒體基因全序列[9]。

線粒體(Mitochondria)是真核細(xì)胞中小分子量的復(fù)制單位, 由于其具有拷貝數(shù)多、分子量小、編碼效率高、母系遺傳和進(jìn)化速度較核基因組快等特點[10], 近年來越來越多的被作為分子標(biāo)記, 廣泛應(yīng)用到動物進(jìn)化遺傳學(xué)、分子生態(tài)學(xué)、遺傳多樣性、物種及品系鑒定等方面[11]。線粒體細(xì)胞色素b(Mitochondria Cytochrome b)位于線粒體內(nèi)膜磷脂雙分子層中, 是參與氧化磷酸化合成ATP過程電子傳遞鏈中的重要物質(zhì), 也是線粒體自身編碼的為數(shù)不多的蛋白質(zhì)之一[12]。Meyer的研究表明, 對于初步進(jìn)行某些物種分子系統(tǒng)發(fā)育研究是可以首先采用線粒體細(xì)胞色素b基因, 不僅它是13個蛋白質(zhì)編碼基因中了解的最為清楚的基因, 也被認(rèn)為是最可信的分子標(biāo)記之一[13], 同時用保守引物擴(kuò)增線粒體Cytb基因較其他線粒體基因要容易的多, 因此研究較為廣泛[14]。已有研究表明線粒體Cytb基因在研究親緣關(guān)系較近的物種分類階元系統(tǒng)關(guān)系和種系地理學(xué)方面非常有用[15]。本研究對蘭州鲇線粒體 Cytb基因全序列進(jìn)行克隆和序列分析, 并與GenBank中多個目的魚類Cytb基因進(jìn)行同源性比較分析, 旨在為蘭州鲇種質(zhì)資源保護(hù)、研究和利用提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

60尾蘭州鲇樣本[體長為(10±1.5) cm, 體重(120±8) g]采集于寧夏回族自治區(qū)水產(chǎn)研究所國家級蘭州鲇原種場建設(shè)基地。EcoRⅠ、SalⅠ限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶等購自大連寶生物公司; IPTG、X-gal、氨芐青霉素等生化試劑購自 Sigma公司; 大腸桿菌(Escherichia Coli)JM109,為本實驗室保存; pMD18-T載體購自Promga公司。

1.2 蘭州鲇基因組DNA的提取

取蘭州鲇尾鰭0.5 g, 提取方法參考吳旭東等[16]的方法。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性后用Spectrophotometer測定DNA濃度及純度, 按照測定的濃度值加適量超純水將終濃度調(diào)整為50 ng/μL左右。

1.3 蘭州鲇線粒體Cytb基因的克隆與篩選

引物設(shè)計 根據(jù)歐洲鲇線粒體全序列(GenBank登錄號: AM398435.2)設(shè)計可擴(kuò)增出蘭州鲇線粒體Cytb基因全序列的擴(kuò)增引物: HD: 5′-CCA AAGCGGCAAAATAAG-3′; LD: 5′-GGAGTTAGGG GCGGGAGT-3′

PCR反應(yīng)體系及條件 PCR反應(yīng)體系總體積為25 μL, 其中10×buffer(含Mg2+)3 μL, dNTP 2 μL,引物0.5 μL, Taq酶0.5 μL(2.5 U/μL), 加ddH2O至25 μL。PCR擴(kuò)增程序為: 94℃預(yù)變性5min; 94℃變性30s, 54℃退火30s, 72℃延伸30s, 30個循環(huán); 72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物上樣至1%瓊脂糖凝膠電泳, 用紫外凝膠成像系統(tǒng)檢測產(chǎn)物片段大小。

擴(kuò)增產(chǎn)物的回收及陽性克隆的篩選 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化回收后, 與 pMD18-T載體在 16℃下連接反應(yīng)過夜, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌 JM109感受態(tài)細(xì)胞, 在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板上37℃培養(yǎng)16h左右后,進(jìn)行藍(lán)白斑篩選, 挑取陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取[17]。

1.4 序列測定和系統(tǒng)發(fā)育分析

用Sal I酶和EcoR I酶對質(zhì)粒做酶切鑒定插入片段的大小后, 選取鑒定正確的每個樣品對應(yīng)的菌液(2份)送至北京諾賽基因公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果用 DNAClub軟件、Clustal x軟件進(jìn)行處理; 用Mega4.0[18]軟件將蘭州鲇線粒體Cytb基因翻譯成氨基酸序列, 同時對蘭州鲇線粒體Cytb核苷酸和氨基酸序列與其他魚類進(jìn)行同源性比較, 以及核苷酸替代率、顛換/轉(zhuǎn)換計算; 用 Mega4.0中 Kimura’s 2—Parameter模型計算遺傳距離, 由NJ法構(gòu)建基于線粒體Cytb基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 蘭州鲇線粒體Cytb基因全序列PCR擴(kuò)增和酶切結(jié)果

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示有一條清晰明亮的區(qū)帶, 分子大小約在1100 bp左右(圖1A)。此擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化回收后與 T載體連接, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞, 經(jīng)質(zhì)粒重組、篩選、酶切鑒定, 結(jié)果顯示除大于2000 bp的載體外, 還有一條約1100 bp左右的基因片段(圖1B)。上述結(jié)果證明,所挑選的質(zhì)粒有目的片段的插入。

圖1 蘭州鲇線粒體Cytb基因全序列PCR擴(kuò)增和酶切結(jié)果Fig. 1 The whole mitochondria Cytb PCR amplification product and enzyme digestion of S. lanzhouensis

2.2 蘭州鲇線粒體Cytb全序列

測序結(jié)果用DNAClub軟件打開, 剪切掉載體后,經(jīng)過Clustal x軟件處理后, 得到1138 bp基因序列,用Mega4.0軟件將蘭州鲇線粒體Cytb基因翻譯成氨基酸序列。結(jié)果顯示, 蘭州鲇線粒體Cytb基因全序列由 1138個堿基組成, 共編碼 379個氨基酸, 以ATG為起始密碼子, T為不完全終止子。本文所克隆的基因序列已經(jīng)錄入 GenBank數(shù)據(jù)庫, 序列號為HQ890503。

2.3 蘭州鲇與13種魚類Cytb基因的同源性比較

硬骨魚亞綱 13種魚類線粒體 Cytb基因由1137—1141個堿基組成, 編碼 378—380個氨基酸(表 1), 其中除形目和鰻鱺目以 TAA為終止密碼子外, 其余都以 T為不完全終止子, 這種現(xiàn)象與Perdices, et al.對中美洲Rhamdia屬斑馬鴨嘴魚的進(jìn)化史研究中的結(jié)果相符合[19]。魚類Cytb基因堿基置換多數(shù)是沉默的, 很大程度上傾向于轉(zhuǎn)換或顛換,密碼子第三位點進(jìn)化最快, 第二位點最保守, 且在一定的進(jìn)化尺度內(nèi)不受飽和效應(yīng)的影響, 所以線粒體 Cytb基因顯示的遺傳變異信息和遺傳分化水平在不同的科、屬、種顯示了良好的系統(tǒng)關(guān)系, 用線粒體 Cytb基因進(jìn)行蘭州鲇及其他硬骨魚類的進(jìn)化分析是適宜的[20]。

表1 蘭州鲇與其他13種魚類線粒體Cytb基因堿基組成及密碼子比較Tab. 1 Comparison of base composition and codons of mitochondria Cytb genes between S. lanzhouensis and other 13 species

運用Mega4.0軟件將蘭州鲇線粒體Cytb的序列及其氨基酸序列, 與其他13種魚的線粒體Cytb基因核苷酸序列和氨基酸序列進(jìn)行同源性比較(表 2),結(jié)果顯示具有較高的同源性, 其中蘭州鲇與鲇的線粒體Cytb基因同源性最高, 核苷酸和氨基酸同源性分別為91.12%和95.52%。

應(yīng)用Mega4.0中Kimura’s 2—Parameter模型計算遺傳距離, 基于NJ法構(gòu)建蘭州鲇等5種鲇形目魚類與其他九種魚類線粒體Cytb的系統(tǒng)進(jìn)化樹, 枝上的數(shù)值為bootstrap1000次后的置信值 (圖2)。

2.4 蘭州鲇與幾種鲇屬魚類 Cytb基因的堿基替代分析

運用Mega4.0軟件對本文克隆的蘭州鲇線粒體Cytb基因, 與歐洲鲇、鲇、大口鲇、越南鲇的線粒體 Cytb基因之間進(jìn)行堿基替代分析(表 3), 結(jié)果顯示本文克隆的蘭州鲇線粒體 Cytb基因與鲇之間替換率最低, 值為 8.87%, 轉(zhuǎn)換/顛換值為 3.21; 與越南鲇之間替換率最高, 值為14.41%, 轉(zhuǎn)換/顛換值為1.83。

2.5 蘭州鲇線粒體 Cytb不同測序結(jié)果之間的差異分析

王慶容等通過PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序和引物行走法, 測定了蘭州鲇的線粒體基因全序列[9](Gen-Bank序列號: JF895472)。運用Mega4.0軟件對王慶容等測定的線粒體Cytb基因, 與歐洲鲇、鲇、大口鲇、越南鲇以及本文克隆的蘭州鲇線粒體Cytb基因之間進(jìn)行堿基替代分析(表4)。結(jié)果顯示王慶容等測定的線粒體Cytb基因與歐洲鲇之間替換率最低, 值為 2.63%, 轉(zhuǎn)換/顛換值為 4.00; 與越南鲇之間替換率最高為18.45%, 轉(zhuǎn)換/顛換值為2.00; 與本文克隆的蘭州鲇線粒體Cytb基因之間替換率為11.16%, 存在127個變異位點, 其中102個轉(zhuǎn)換位點, 25個顛換位點, 轉(zhuǎn)換/顛換值為4.08。

表2 蘭州鲇與其他13種魚類線粒體Cytb基因序列和氨基酸序列同源性比較Tab. 2 Comparoson of homology of nucleotide and amino acid of mitochondria Cytb between S. lanzhouensis and other 13 species

圖2 用鄰接法根據(jù)蘭州鲇與其他13種魚線粒體Cytb基因序列構(gòu)建的分子系統(tǒng)樹Fig. 2 Phylogenetic trees derived from mitochondria Cytb nucleotide sequences of S. lanzhouensis and other thirteen species of fishes based on Neighbor-Joining method

運用 Mega4.0軟件基于 Kimura’s 2-Parameter模型計算本文克隆的蘭州鲇線粒體Cytb基因與王慶容等測定的線粒體Cytb基因序列(在表5和圖3中簡稱“W-fishes”)以及歐洲鲇、鲇、大口鲇、越南鲇這幾種鲇屬類Cytb基因之間的遺傳距離(表 5)。結(jié)果顯示本文克隆的蘭州鲇線粒體Cytb基因與鲇之間的遺傳距離最小, 與越南鲇之間的遺傳距離最大; 而王慶容等測定的線粒體Cytb基因與歐洲鲇之間的遺傳距離最小, 與越南鲇之間的遺傳距離最大;本文克隆得到的蘭州鲇線粒體Cytb基因與王慶容等測定的線粒體Cytb基因之間的遺傳距離為0.1230。

基于表5中得到的遺傳距離運用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3), 枝上的數(shù)值是bootstrap1000次后的置信值。從圖中可以看出王慶容等的實驗樣本與歐洲鲇以 100%的置信值先聚為一支, 然后與南方鲇聚在一起, 越南鲇為單獨的一支, 表明王慶容等采集的實驗樣本與歐洲鲇親緣關(guān)系很近。

表3 蘭州鲇與四種鲇屬魚類線粒體Cytb基因的堿基替換分析Tab. 3 Number and frequencies of nucleotides substitution of mitochondria Cytb genes between S. lanzhouensis and other four Silurus species

表4 王慶容等測定的線粒體Cytb基因與五種鲇屬魚類線粒體Cytb基因之間的堿基替代分析Tab. 4 Number and frequencies of nucleotides substitution of mitochondria Cytb genes between which was measured by Wang Qing-Rong and other five Silurus species

表5 蘭州鲇等幾種鲇形目魚類基于線粒體Cytb基因的遺傳距離Tab. 5 Genetic distance of S. lanzhouensis and other Siluriformes species based on mitochondria Cytb

3 討論

造成種內(nèi)同一基因差異的原因有很多, 隔離、漂變、雜交等都可能造成種內(nèi)同一基因的變異。Avise認(rèn)為同種的個體間同一基因存在0.1%—5%的差異[21], 而對于其他一些動物的Cytb基因序列的研究分析表明, 種內(nèi)個體間的序列差異一般在 0—4.06%, 差異超過 6%的個體間已有明顯的亞種和種的分化[22,23]。Robert, et al.等指出, 基于 Kimura’s 2-Parameter模型的同種內(nèi)平均遺傳距離為0.0039[24]; Kartavtsev, et al.等認(rèn)為線粒體Cytb基因平均遺傳距離在同種群間為(1.55±0.56)%, 同屬之間為(5.52± 1.34)%, 在同科不同屬之間為(10.69±1.34)%[25]。本文克隆的蘭州鲇線粒體 Cytb全序列與王慶容測定的 Cytb全序列之間核苷酸差異率為 11.66%, 基于Kimura’s 2-Parameter模型的遺傳距離為0.1230, 按照Avise和Kartavtsev的理論, 兩者已經(jīng)達(dá)到種間差異的水平。王慶容等測定的線粒體Cytb序列與歐洲鲇的序列差異為2.63%, 基于Kimura’s 2-Parameter模型的遺傳距離為 0.0269, 表明王慶容等所采集的實驗樣本與歐洲鲇之間親緣關(guān)系非常近。本文中蘭州鲇采集于寧夏回族自治區(qū)水產(chǎn)研究所蘭州鲇原種場, 該場是 2013年農(nóng)業(yè)部命名的第一批“全國現(xiàn)代漁業(yè)種業(yè)示范場”, 養(yǎng)殖的蘭州鲇種質(zhì)純正; 而王慶容等的實驗樣本采集于北京西門農(nóng)貿(mào)市場(來源于山東養(yǎng)殖場)[9]。

褚新洛等在中國動物志?硬骨魚綱?鲇形目的分類中關(guān)于蘭州鲇的種級分布位于華西區(qū)隴西亞區(qū),主要分布于黃河水系中上游, 具體分布位于黃河水系的蘭州至內(nèi)蒙古托克托縣和巴彥淖爾盟四分灘[26];其次, 本文克隆的蘭州鲇線粒體Cytb全序列與王慶容等測定的線粒體 Cytb基因全序列之間核苷酸差異率和遺傳距離很大,已經(jīng)達(dá)到不同種的水平; 王慶容等測定的線粒體 Cytb基因與歐洲鲇線粒體Cytb基因差異率很小, 親緣關(guān)系很近, 推斷王慶容等采集的樣本應(yīng)該不是蘭州鲇, 而是歐洲鲇或其近緣種。

圖3 基于鄰接法根據(jù)本文克隆的蘭州鲇線粒體 Cytb序列、王慶容等測定蘭州鲇線粒體的Cytb序列及其他四種屬魚類的線粒體Cytb基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 3 Phylogenetic trees derived from mitochondria Cytb gene of S. lanzhouensis cloned by this paper and measured by Wang Qing-Rong et al. and other four species of Silurus based on Neighbor-Joining method

從圖2可以看出五種鲇屬魚類聚在一起, 其中蘭州鲇和鲇先聚為一支,再與大口鲇聚在一起; 構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹將除軟骨魚亞綱角鯊目外的硬骨魚亞綱九個目分成兩組: 鱘形目和鰻鱺目聚為一組; 鲇形目、鯉形目、鮭形目、鯡形目、鰈形目、形目、鱸形目這 7個目為另一組; 其中后一組中鲇形目、鯉形目聚為一組, 鮭形目、鯡形目、鰈形目、形目和鱸形目聚為另一組。由此可見根據(jù)線粒體Cytb序列獲得的分類結(jié)果, 與孟慶聞等采用Nelson的系統(tǒng)[27]提出的分類系統(tǒng)結(jié)果、系統(tǒng)發(fā)育演化基本吻合。

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THE CLONING AND SEQUENCE ANALYSIS OF THE MITOCHONDRIAL CYTOCHROME b GENE OF SILURUS LANZHOUENSIS

To clone the sequence of the mitochondrial cytochrome b (Cytb) gene of Silurus lanzhouensis, we designed a specific pair of primers from the mitochondrial genome of S. glanis. The 1138 bp S. lanzhouensis Cytb gene was obtained after PCR. Then we compared the homology of the mitochondrial Cytb gene between S. lanzhouensis and 13 other species. The results showed that these species have high homology in Cytb gene. The homology value of the nucleotides was between 61.38% and 91.12%, and the value of the amino acids was between 76.62% and 95.52%. We also analyzed the nucleotides substitution of the mitochondrial Cytb gene among S. lanzhouensis, S. glanis, S. meridionalis, S. asotus, and S. cochinchinensis, and found that the lowest frequency of nucleotides substitution occurred between S. lanzhouensis and S. asotus with the value of 8.87%, and TS/TV was 3.21. The highest frequency was between S. lanzhouensis and S. cochinchinensis with the value of 14.41%, and TS/TV was 1.83. Qing-Rong Wang, et al. previously reported the sequence of the mitochondrial Cytb gene of S. lanzhouensis. Here we conducted the sequence difference analysis between our results and theirs. The results showed that the frequency of nucleotides substitution was 11.16%, there were 127 variable sites, TS/TV was 4.08, genetic distance was 0.1230. The phylogenetic tree of S. lanzhouensis and 13 other species constructed by NJ method was consistent with the traditional taxonomic results.

Silurus lanzhouensis; Mitochondria Cytochrome b; Sequence analysis

WU Xu-Dong1,2, XIAO Wei2, LIAN Zong-Qiang1,2and HOU Yu-Xia3

(1. College of Animal Science and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China; 2. Ningxia Fisheries Research Institute, Yinchuan 750001, China; 3. College of Science, China Agricultural University, Beijing 100193, China)

S917

A

1000-3207(2014)04-0772-08

10.7541/2014.108

2013-07-05;

2014-02-13

國家自然科學(xué)基金項目(30760191)資助

吳旭東(1967—), 男, 博士, 研究員; 研究方向為水生動物分子生物學(xué)及種質(zhì)資源保護(hù)與增養(yǎng)殖。E-mail: amy95@163.com