毛云濤甘小妮王緒禎

(1. 中國科學(xué)院水生生物研究所, 水生生物多樣性與保護(hù)重點(diǎn)實驗室, 武漢 430072; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

基于線粒體COⅠ基因的沙鰍亞科魚類DNA條形碼及其分子系統(tǒng)發(fā)育研究

毛云濤1,2甘小妮1王緒禎1

(1. 中國科學(xué)院水生生物研究所, 水生生物多樣性與保護(hù)重點(diǎn)實驗室, 武漢 430072; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

選擇線粒體 COⅠ基因作為分子標(biāo)記, 進(jìn)行沙鰍亞科魚類(Botiinae)DNA條形碼及其分子系統(tǒng)發(fā)育研究。研究獲得了沙鰍亞科7屬19種共131個個體的COⅠ基因序列, 利用MEGA5.0軟件分析了沙鰍亞科魚類COⅠ基因的序列特征, 計算了種內(nèi)及種間遺傳距離。沙鰍亞科魚類的分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的重建分別采用NJ法和Bayesian法。研究發(fā)現(xiàn), 沙鰍亞科COⅠ基因的堿基組成為: A 24.4%、T 29.5%、G 18.0%、C 28.1%。沙鰍亞科魚類種內(nèi)平均遺傳距離為0.002±0.000, 種間平均遺傳距離為0.148±0.008。DNA條形碼研究結(jié)果顯示, 所分析的19種沙鰍魚類各自分別聚成單系分支, 表明COⅠ基因在本研究中具有100%的物種鑒別率。同時, 系統(tǒng)發(fā)育分析支持各屬的單系性, 并且結(jié)果顯示沙鰍亞科魚類聚為兩個分支, 其中一支由薄鰍屬和副沙鰍屬構(gòu)成, 另一分支則包括: (沙鰍屬、色鰍屬)和 [中華沙鰍屬、(纓須鰍屬、安彥鰍屬)]。因此, COⅠ基因可以作為有效的分子標(biāo)記對沙鰍亞科進(jìn)行DNA條形碼研究以及分子系統(tǒng)發(fā)育研究。

DNA條形碼; COⅠ基因; 沙鰍亞科; 物種鑒定

沙鰍亞科(Botiinae)是鯉形目的一群中小型魚類,包括7個屬[1], 近60種。沙鰍亞科魚類分布范圍北至中國黑龍江和日本, 西至巴基斯坦, 南至印度尼西亞的爪哇島, 但集中分布于中國長江以南、泰國、緬甸、老撾及印度東北部等地區(qū)[2]。根據(jù)頰部有無鱗片和眼下刺是否分叉, 朱松泉[3]認(rèn)為沙鰍亞科由薄鰍屬、沙鰍屬和副沙鰍屬組成。Nalban, et al.[4]和Kottelat, et al.[5]將沙鰍亞科劃分為薄鰍族與沙鰍族,并對原有沙鰍屬進(jìn)行分類整理, 將其亞屬提升到屬的水平, 認(rèn)為沙鰍亞科包括7個屬。

隨著環(huán)境的污染, 生態(tài)系統(tǒng)的破壞, 魚類物種多樣性呈現(xiàn)喪失的現(xiàn)象[6]。因此, 對魚類物種的保護(hù)工作顯得格外重要, 而進(jìn)行魚類物種多樣性保護(hù)工作的前提是對物種進(jìn)行正確的鑒定和分類[7]?；谛螒B(tài)學(xué)特征的傳統(tǒng)分類研究對構(gòu)建沙鰍亞科的分類系統(tǒng)起到了重要的作用。然而, 在實踐過程中, 由于會遇到標(biāo)本的個體較小及保存不完整等現(xiàn)實問題,這些都給傳統(tǒng)的物種鑒定工作帶來了巨大困難。尤其對一些不具備分類學(xué)背景的研究者而言, 依據(jù)形態(tài)學(xué)特征鑒定物種將是一個重大的挑戰(zhàn)。隨著分子分類學(xué)的發(fā)展, 尋求分子生物學(xué)的輔助手段對沙鰍亞科魚類進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定, 已經(jīng)成為魚類學(xué)研究中的一個迫切需要解決的問題。

DNA條形碼(DNA barcode)作為對物種進(jìn)行識別和鑒定的一項新技術(shù), 正受到國內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注[8—11]。DNA條形碼是指生物體內(nèi)能夠代表該物種的、標(biāo)準(zhǔn)的、有足夠變異的、易擴(kuò)增且相對較短(約650 bp)的DNA片段[12,13]。在線粒體DNA中, COⅠ基因擁有長度適宜、進(jìn)化速率適中及富含系統(tǒng)發(fā)育信號等特點(diǎn)[14]。已有文獻(xiàn)證明, 在實驗中, 能夠較好地通過通用引物對大多數(shù)動物的 COⅠ基因進(jìn)行有效擴(kuò)增, 因此, 在動物界物種鑒定中, 通常選擇 COⅠ基因作為條形碼[15—17]。目前, 世界各地已經(jīng)開展了從湖泊[18]到海洋[19,20]多個地理區(qū)域的魚類DNA條形碼研究計劃, 在物種保護(hù)[2]和鑒定[22,23]方面做了諸多探索。

近年來, 研究者開始利用分子系統(tǒng)發(fā)育的理論和方法開展沙鰍亞科魚類的分類學(xué)研究, 通常選擇線粒體的細(xì)胞色素b (Cytb)和控制區(qū)(Control region)的 DNA 序列作為分子標(biāo)記[22,23]。本研究選擇了DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因——線粒體COⅠ基因作為標(biāo)記, 進(jìn)行沙鰍亞科魚類 DNA條形碼及其分子系統(tǒng)發(fā)育研究。本研究的目的就是通過沙鰍魚類COⅠ基因序列的比對和分析, 探討COⅠ基因作為DNA條形碼在沙鰍亞科魚類種類鑒定中的可行性, 通過重建沙鰍亞科魚類的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系來探討其內(nèi)部種級和屬級分類階元的演化關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究包含了沙鰍亞科魚類的 7屬 19種, 共131個個體, 其中從 GenBank下載 COⅠ基因序列44條。本研究所采集的標(biāo)本、物種的形態(tài)學(xué)特征鑒定主要依據(jù)《中國淡水魚類檢索》[3]和《薄鰍屬一新種——小眼薄鰍》[24]進(jìn)行。鯉形目包括鰍科、平鰭鰍科、鯉科、雙孔魚科和胭脂魚科, 基于鯉形目是單系類群這一普遍認(rèn)同觀點(diǎn)[25], 我們選擇了除鰍科和平鰭鰍科以外的6種鯉形目魚類作為外類群。它們分別來自鯉科中鰱(Hypophthalmichthys molitrix)、三角魴(Megalobrama terminalis)、鯉(Cyprinus carpio)、斑馬魚(Danio rerio); 雙孔魚科的雙孔魚(Gyrinocheilus aymonieri)和胭脂魚科中胭脂魚(Myxocyprinus asiaticus)。研究樣本和外類群的樣本信息見表1。采集標(biāo)本的鰭條或肌肉組織保存在95%的酒精中, 標(biāo)本收藏于中國科學(xué)院水生生物研究所。

1.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增和測序

在本研究中采用了略作改動的酚–氯仿抽提法[26]和高鹽濃度抽提法提取總DNA, 提取好的DNA置于–20℃冰箱保存。

使用特異性引物COⅠ-F1 (5′-TCAACCAACCA CAAAGACATTGGCAC-3′)和COⅠ-R1 (5′-TAGACT TCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3′)[16]擴(kuò)增線粒體COⅠ基因序列。PCR反應(yīng)體系為 30 μL, 其中含ddH2O 20.625 μL, 10×PCR buffer 3 μL(1 mol/L), dNTP 1.5 μL(2.5 mmol/L), Taq酶0.375 μL(5 U/μL),正反向引物各1.5 μL(10 pmol/L), 總的基因組DNA模板約為100 ng。PCR反應(yīng)條件為: 95℃預(yù)變性5min; 95℃變性30s, 50℃退火45s, 72℃延伸45s, 共31個循環(huán); 最后再72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送北京天一輝遠(yuǎn)測序公司進(jìn)行正反向測序。10×PCR buffer、dNTP和Taq酶均購自Takara公司。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用DNAstar軟件中SeqMan程序?qū)π蛄羞M(jìn)行拼接, 運(yùn)用 BioEdit軟件查看序列結(jié)果并輔助測序峰圖進(jìn)行人工校正, 排除可能引入的錯誤信息。序列比對使用的是Clustalw2 (Gap Open Penalty缺省值設(shè)置為10), 用MEGA5.0計算序列的堿基組成、序列間的堿基變異頻率和轉(zhuǎn)換顛換頻率及其比率, 基于Kimura’s 2-parameter[27]模型計算各物種的遺傳距離。

在本研究中, 分子系統(tǒng)樹的構(gòu)建采用鄰接法(Neighbor-joining, NJ)和貝葉斯法(Bayesian)。使用modeltest3.7軟件選擇最佳替代模型, 基于AIC標(biāo)準(zhǔn)選擇了TrN+I+G模型作為核苷酸的最佳模型, 用于鄰接法分析和貝葉斯分析。鄰接樹(NJ)的構(gòu)建基于MEGA5.0軟件, 并進(jìn)行 1000次自展分支檢驗檢驗分支樹的可靠性。貝葉斯分析運(yùn)用了 MrBayes3.1.2軟件, 運(yùn)算中馬爾科夫蒙特卡洛(MCMC)參數(shù)設(shè)置如下: ngen = 1000000, nchains = 4, samplefreq = 100, temp = 0.02, startingtree = random。運(yùn)用Trace 1.5軟件檢查MCMC結(jié)果的收斂性, 結(jié)果表明鏈?zhǔn)諗坑谇?00000代之內(nèi), 因此burnin設(shè)置為2000。

2 結(jié)果

2.1 COⅠ基因序列特征

本研究共獲得19種沙鰍亞科魚類131個個體的線粒體COⅠ基因的DNA片段, 長684 bp。沙鰍魚類COⅠ基因序列的堿基組成為: A 24.4%、T 29.5%、C 28.1%、G 18.0%。在648 bp排列位點(diǎn)中, 變異位點(diǎn)數(shù)目為237個, 轉(zhuǎn)換位點(diǎn)和顛換位點(diǎn)分別為58個和24個。在COⅠ基因的3個密碼子位點(diǎn)中, 第2密碼子位點(diǎn)沒有變異, 轉(zhuǎn)換位點(diǎn)和顛換位點(diǎn)均為 0;而第 3密碼子位點(diǎn)的轉(zhuǎn)換位點(diǎn)和顛換位點(diǎn)數(shù)最多,分別為51個和23個。沙鰍魚類COⅠ基因的轉(zhuǎn)換位點(diǎn)與顛換位點(diǎn)比值范圍為0.21—6.45。

沙鰍魚類的 COⅠ基因序列平均 G+C含量為42%—49.4%, 平均值為 46%。其中, 含量最低的是皇冠沙鰍(42%), 最高的是白氏薄鰍(49.4%)。這種差異主要是由第 3密碼子位點(diǎn) G+C含量的差異引起的。對于沙鰍魚類而言, 除白氏薄鰍外, 其余各物種的平均G+C含量在第1密碼子、第2密碼子、第3密碼子中依次遞減。第1 密碼子的 G+C含量貢獻(xiàn)值最大, 變化范圍為54%—60%; 第2密碼子位點(diǎn)的平均G+C含量變化范圍最小, 為43%—44%; 第3密碼子的G+C含量變化范圍為29%—45%。

表1 研究所用樣本名錄及相關(guān)信息Tab. 1 Sampling information and GenBank accession numbers of COⅠ genes

2.2 種內(nèi)及種間的遺傳距離

在本研究中, 沙鰍亞科魚類的種內(nèi)遺傳距離為0—0.009, 其中, 橙鰭沙鰍的種內(nèi)遺傳距離最大為0.009, 其余18種的種內(nèi)遺傳距離小于或等于0.003,種內(nèi)平均遺傳距離為0.002±0.000。沙鰍亞科魚類的種間遺傳距離為0.019—0.233(表2), 種間遺傳距離平均為0.148±0.008。

2.3 分子系統(tǒng)樹

貝葉斯法構(gòu)建的分子系統(tǒng)樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與 NJ法一致, 僅部分節(jié)點(diǎn)的支持率存在差異。采用NJ法構(gòu)建的沙鰍亞科分子系統(tǒng)樹如圖 1所示, 其中加入了貝葉斯法得到的節(jié)點(diǎn)支持率。在沙鰍亞科中, 每種魚類的不同個體均各自聚成單系類群, 且具有較高的節(jié)點(diǎn)支持率, 其中NJ樹中節(jié)點(diǎn)的自展支持率均為100%, 而Bayesian樹中, 除花斑副沙鰍 (Parabotia fasciata) 外, 其余節(jié)點(diǎn)的后驗概率均為1。另外, 我們的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果也支持沙鰍亞科的7個屬各自構(gòu)成單系。

3 討論

Saccone, et al.[28]對9種硬骨魚和3種軟骨魚的線粒體基因組全序列進(jìn)行分析, 結(jié)果表明硬骨魚類的平均G+C含量高于軟骨魚類。Ward, et al.[16]分析了207種澳大利亞魚類的COⅠ基因序列, 結(jié)果同樣支持硬骨魚類的平均G+C含量顯著高于軟骨魚類。本研究中沙鰍魚類的 COⅠ基因的平均 G+C含量(46.5%)高于Saccone, et al.和Ward, et al.得出的軟骨魚類的平均G+C含量, 與Saccone, et al.和Ward, et al.的研究結(jié)果一致。在DNA進(jìn)化過程中, 轉(zhuǎn)換發(fā)生的頻率要比顛換高, R值(si/sv)的大小標(biāo)志著物種親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近, 在沙鰍亞科中, 密碼子的 R值分別為2.45, 大于2.0, 表明基因序列的突變未達(dá)到飽和[29],適用于系統(tǒng)發(fā)育分析。

利用 DNA條形碼對物種進(jìn)行正確分類取決于種內(nèi)遺傳距離和種間遺傳距離之間的差異大小, 即條形碼缺口(barcoding gap)。Hebert, et al.[12,14]指出,有效利用 COⅠ基因序列鑒別物種的關(guān)鍵是種間遺傳距離必須大于種內(nèi)遺傳距離, 并且距離差異大約10倍。在本研究中, 沙鰍魚類的種間平均遺傳距離是 0.148±0.008, 種內(nèi)平均遺傳距離是 0.002±0.000,兩者相差74倍, 這表明COⅠ基因序列在沙鰍亞科魚類中的遺傳差異為有效區(qū)分該類群中的各個物種奠定了良好的基礎(chǔ)。薄鰍屬內(nèi)的種間遺傳距離相對較小, 其中, 松花江薄鰍(Parabotia mantschurica)與花斑副沙鰍(Parabotia fasciata)的種間遺傳距離為0.019。而松花江薄鰍分布于黑龍江水系, 花斑副沙鰍則采自于長江流域的湖北省咸寧市, 二者間較小的遺傳差異并不是由于種間雜交造成, 可能與譜系分化時間較短有關(guān)。總體而言, 本研究所分析的 19種沙鰍魚類每種各自聚成單系分支, 表明 COⅠ基因在沙鰍亞科物種中具有100%的物種鑒別率。因此,對沙鰍亞科而言, COⅠ基因可以作為一個有效的DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因。

本研究分子系統(tǒng)發(fā)育分析顯示, 沙鰍亞科魚類的不同個體在種與屬水平上均分別聚成單系分支,為形態(tài)學(xué)分類中屬的單系性提供了分子生物學(xué)證據(jù)。就屬級相互關(guān)系而言, 沙鰍亞科魚類聚為兩個分支, 其中一支由薄鰍屬和副沙鰍屬構(gòu)成, 二者互為姐妹群。薄鰍屬和副沙鰍屬主要分布于青藏高原以東的東亞地區(qū), 為我國特有屬。沙鰍亞科中另一分支包括沙鰍屬、色鰍屬、中華沙鰍屬、纓須鰍屬和安彥鰍屬。沙鰍屬與色鰍屬為姐妹群, 就地理分布而言, 這個姐妹群主要分布于青藏高原以南的南亞及東南亞的主要水系中。纓須鰍屬和安彥鰍屬主要分布于東南亞地區(qū)的湄公河流域, 其姐妹群關(guān)系與其地理分布上的密切聯(lián)系一致。纓須鰍屬和安彥鰍屬的姐妹類群中華沙鰍屬則主要分布于長江以南流域, 向南至湄公河流域的老撾和泰國等地?？傮w而言, 本文系統(tǒng)發(fā)育研究也揭示了沙鰍魚類的三個單系類群的譜系進(jìn)化關(guān)系與其地理分布之間的密切相關(guān)性。

圖1 利用COⅠ基因序列構(gòu)建的NJ樹(節(jié)點(diǎn)支持率中, 前者為自展支持率, 后者為后驗概率)Fig. 1 NJ tree based on the COⅠ gene sequences (Numbers among the Botiinae of the nodes represent bootstrap values, The former are based on NJ method while the latter are based on Bayesian method)

本研究系統(tǒng)發(fā)育分析還揭示了沙鰍亞科中屬級階元的單系性。唐瓊英等[1]基于細(xì)胞色素 b基因的沙鰍亞科分子系統(tǒng)發(fā)育研究支持除安彥鰍屬外的其余 6屬的單系性, 該研究認(rèn)為安彥鰍屬為復(fù)系類群, 其中黑線沙鰍(Yasuhikotakia nigrolineata)及小沙鰍(Yasuhikotakia sidthimunki)和安彥鰍屬其他物種沒有聚為一支。而黑線沙鰍和小沙鰍被認(rèn)為屬于Ambastaia屬[30], 這種分類訂正也進(jìn)一步明確了安彥鰍屬的單系性。因此, 本研究系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果在沙鰍亞科屬級階元的單系性及其相互關(guān)系上與以前的分子系統(tǒng)發(fā)育研究結(jié)果基本一致。線粒體 COⅠ基因可以作為沙鰍亞科分子系統(tǒng)發(fā)育研究中的有效的分子標(biāo)記。

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DNA BARCODES AND MOLECULAR PHYLOGENY OF BOTIINAE FISHES BASED ON THE MITOCHONDRIAL COⅠ GENE

MAO Yun-Tao1,2, GAN Xiao-Ni1and WANG Xu-Zhen1
(1. The Key Laboratory of Aquatic Biodiversity and Conservation of Chinese Academy, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China; 2.University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

To analyze the characteristics of the sequences and to calculate the genetic distance within and between species, the 648 bp mitochondrial COⅠ gene was used as DNA barcode to analyze phylogenetic relationships of Botiinae fishes in 131 sequences from 19 species representing 7 genera of Botiinae. MEGA5.0 software was used in the current study. Phylogenetic analyses were carried out using neighbor-joining and Bayesian methods. Our result revealed that the nucleotide compositions were 24.4% A, 29.5% T, 18.0% G, and 28.1% C. The mean inter- and intra-specific genetic distances were 0.148±0.008 and 0.002±0.000, respectively. Individuals of each species were clustered into monophyletic groups based on the molecular phylogenetic tree, indicating that the mitochondria COⅠ gene is suitable for species discrimination. Moreover, the phylogenetic analyses supported monophyly of genera within Botiinae. Two clades were recovered within the subfamily Botiinae: one clade includes the sister-group of Leptobotia and Parabotia and the other contains Botia + Chromobotia and Sinibotia + (Syncrossus, Yasuhikotakia). This study indicated that the mitochondria COⅠ gene is a potentially effective marker for DNA barcoding and phylogenetic studies of Botiinae fishes.

DNA barcoding; COⅠ gene; Botiinae; Species identification

Q949+.1

A

1000-3207(2014)04-0737-08

10.7541/2014.104

2013-05-28;

2013-11-23

國家自然科學(xué)基金項目(31272290)資助

毛云濤(1988—), 男, 湖北仙桃人; 碩士; 主要從事魚類學(xué)研究。E-mail: maoyuntao1988@163.com

王緒禎, E-mail: wangxzh@ihb.ac.cn