葛雅楠李圓圓張銀鳳樓欽欽趙亞嫻秦占芬

(1. 中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心, 北京 100085; 2. 福建農林大學, 福州 350002)

黑斑蛙變態(tài)過程中甲狀腺發(fā)育及甲狀腺激素分泌

葛雅楠1,2李圓圓1張銀鳳1樓欽欽1趙亞嫻1秦占芬1

(1. 中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心, 北京 100085; 2. 福建農林大學, 福州 350002)

系統(tǒng)研究了我國本土兩棲動物種黑斑蛙(Rana nigromaculata)變態(tài)發(fā)育過程中甲狀腺組織學和甲狀腺激素水平的變化, 為甲狀腺生物學和甲狀腺干擾研究提供基礎數(shù)據(jù)。黑斑蛙蝌蚪發(fā)育的形態(tài)變化: 第26—40階段, 后腿芽生長并逐漸分化出五趾結構; 42階段, 開始進入變態(tài)高峰期, 前肢展開, 尾吸收, 蝌蚪身體發(fā)生巨大形變; 46階段, 蝌蚪完全變態(tài)成小蛙。隨著形態(tài)學的變化, 甲狀腺的組織結構也發(fā)生明顯的變化: 26—37階段, 甲狀腺體積較小, 增長緩慢; 38階段甲狀腺體積迅速膨大, 進入高峰期, 甲狀腺的發(fā)育達到頂峰; 隨著變態(tài)完成, 甲狀腺又逐漸縮小。甲狀腺組織學變化的同時, 甲狀腺激素水平也相應發(fā)生變化: 在變態(tài)前期, 下頜中3,3’,5-三碘代-L-甲腺原氨酸(T3)水平增長緩慢, 進入變態(tài)期后, T3含量迅速升高, 在變態(tài)高峰期達到峰值, 隨后下降。以上結果表明, 黑斑蛙發(fā)育過程中甲狀腺組織學的變化與甲狀腺激素水平的波動相吻合。對黑斑蛙甲狀腺系統(tǒng)的研究, 可為日后使用黑斑蛙開展甲狀腺干擾作用的研究提供基礎。

黑斑蛙; 蝌蚪; 甲狀腺; 甲狀腺激素; 發(fā)育

兩棲動物的變態(tài)發(fā)育過程受甲狀腺激素調控,因此兩棲動物一直被認為是研究甲狀腺激素功能和信號通路的模式生物[1,2]。隨著人們對環(huán)境污染物甲狀腺干擾作用的日趨關注[3,4], 許多兩棲動物種被用于甲狀腺干擾的研究[5—8], 如國際通用種非洲爪蟾[9,10]、加拿大的牛蛙和豹蛙[11,12]、歐洲的林蛙[13,14]、日本的粗皮蛙[15,16]等。鑒于目前從國外進口非洲爪蟾存在一些問題, 開展我國本土兩棲動物種的研究意義重大, 以期為甲狀腺干擾及其他領域的研究提供更多基礎數(shù)據(jù)。

黑斑蛙(Rana nigromaculata)是我國常見的一個兩棲動物種, 部分學者對黑斑蛙的生物學[17—20]和毒理學[21,22]有過一定研究。然而目前還沒有關于黑斑蛙變態(tài)發(fā)育過程中甲狀腺發(fā)育和甲狀腺激素分泌的報道, 也沒有黑斑蛙變態(tài)發(fā)育過程中形態(tài)的描述。這些信息是開展黑斑蛙甲狀腺干擾研究的生物學基礎。本文系統(tǒng)研究了黑斑蛙變態(tài)發(fā)育過程中整體形態(tài)、甲狀腺組織學以及甲狀腺激素水平的變化,以推進黑斑蛙在甲狀腺干擾研究中的應用。

1 材料與方法

1.1 黑斑蛙和蝌蚪的飼養(yǎng)

黑斑蛙成蛙飼養(yǎng)在動物房水陸兩棲的玻璃缸中,每天清洗, 水溫(23±2) , ℃ 明暗光周期為12h 12h∶ 。成蛙每天喂食添加胡蘿卜的面包蟲1次。成年雌蛙雄蛙各注射15 μg 促黃體素釋放激素A3(LHRH-A3)和人絨毛膜促性腺激素[雌蛙 300國際單位(IU), 雄蛙 200 IU], 兩種激素均用質量分數(shù)為 0.6%的生理鹽水配制, 放入兩棲動物誘導繁育設備中, 誘導其抱對產卵。

受精卵放入去氯水中孵化, 4d后孵化成蝌蚪。將蝌蚪轉移至蝌蚪缸中(100 cm×60 cm×30 cm) 飼養(yǎng), 水深15 cm, 每天喂食飼料(購自香港)兩次。每缸的蝌蚪密度每升水中不多于 5只蝌蚪(Gosner 30階段[23]之前), 30階段之后每升水不多于1.5只蝌蚪。蝌蚪飼養(yǎng)缸每周換水兩次, 水的條件控制如下: 無氯, pH 6.5—7.0, 溶解氧大于 5 mg/L, 硬度(CaCO3)約150 mg/L。在兩棲動物房中, 溫度 (23±2)℃、明暗光周期為 12h 12h∶ (蝌蚪缸水面光強在 600—1000 μmol/(m2·s), 成蛙缸光強在100—300 μmol/(m2·s),待蝌蚪發(fā)育至Gosner 26—46階段[23]取樣。

1.2 形態(tài)學觀察和階段識別

按照Gosner[23]對無尾目蝌蚪的階段劃分系統(tǒng)對黑斑蛙蝌蚪發(fā)育階段進行劃分。取26—46各階段蝌蚪麻醉后固定于固定液[固定液配方為苦味酸︰甲醛︰冰醋酸(體積比)=75︰25︰5]中, 直接肉眼觀察其形態(tài), 其四肢置于體式顯微鏡下觀察(放大倍數(shù)為 1—4倍)。每個階段蝌蚪進行照相,并重點觀察腿部變化。根據(jù)蝌蚪階段, 對其形態(tài)學特征加以觀察描述。

1.3 甲狀腺組織學檢查

將 26—46各階段蝌蚪麻醉后, 取下頜放入固定液中,每個階段至少取三只下頜。將組織從固定液內取出后, 沖水24h; 經過70%、80%、95%及100%酒精濃度梯度脫水后,放入85%、95%及100%二甲苯中透明。經過浸蠟、包埋后進行切片。切片厚度5 μm, 然后經過脫蠟、HE染色、封片后,在光學顯微鏡下觀察、拍照,放大倍數(shù)為 10×目鏡, 10×物鏡。對最大截面進行分析, 觀察濾泡、濾泡細胞及膠質形態(tài)、顏色、大小等。

1.4 甲狀腺激素提取及測定

將黑斑蛙32/33—46各段蝌蚪下頜取出后, 放入1.5 mL無水乙醇內, 剪碎后加入1顆氧化鋯珠子。在勻漿儀中研磨2min。置于超聲儀中超聲30s,然后離心15min, 吸取上清液。在沉淀中加入 0.3 mL冰無水乙醇, 超聲30s后, 離心5min,合并上清。將兩次上清液在37℃水浴中蒸干, 加入0.5 mL PBS緩沖液, 充分溶解后, 用全自動化學發(fā)光免疫分析法(CLIA)測定T3含量。

圖 1 黑斑蛙蝌蚪各階段形態(tài)學特征Fig. 1 Morphological features of tadpoles at stage 26—46

2 結果

2.1 黑斑蛙蝌蚪各階段形態(tài)學變化

黑斑蛙蝌蚪 26—46各階段的形態(tài)學變化如下(圖1): 26—30階段主要特征為后肢的生長, 稱為后肢芽發(fā)育期: 26階段為后肢芽剛剛出現(xiàn), 長度不足寬度的一半; 27階段的后腿芽長度超過寬度的一半但小于寬度; 28階段時后腿芽長度略超過寬度; 29/30階段, 后肢芽長度可達寬度的 1.5—2倍。31—36階段, 為趾分化期: 31階段時, 后肢芽呈槳狀; 32/33階段, 后肢出現(xiàn)兩個缺凹; 34、35階段, 缺凹增加為三個和四個; 到達36階段時, 前三個缺凹加深, 分化出三趾; 37階段時四個缺凹都加深, 分化出明顯的五趾。38—40階段出現(xiàn)蹼突和關節(jié)下瘤, 38階段, 第一趾基出現(xiàn)蹼突; 到了40階段, 五趾腹面均出現(xiàn)關節(jié)下瘤。40階段后蝌蚪發(fā)育進入變態(tài)期,更加劇烈的形變開始。41階段, 穿于前肢外的皮膚變透明, 泄殖腔褶消失或幾近消失; 42階段, 前肢展開, 從這一階段開始, 口角開始逐漸變寬。43階段口裂加深, 從側面看口角超過鼻孔, 但未達到眼,同時鰓和尾開始吸收。44階段口裂進一步加深, 口角達到眼中部水平, 鰓完全吸收。45階段口角達到眼后水平, 尾萎縮吸收而趨于消失, 只余一個小突起。46階段尾完全吸收, 四肢發(fā)達, 基本具備與成體相似的色斑, 意味著整個變態(tài)過程完成。

圖 2 黑斑蛙26—46階段甲狀腺組織學切片F(xiàn)ig. 2 Histological features of thyroid gland at stage 26—46

2.2 黑斑蛙蝌蚪各階段甲狀腺組織學變化

如圖2所示, 在蝌蚪的第一個階段(26階段), 甲狀腺體積很小, 但已經有濾泡存在, 在最大截面處可以看到由單層上皮細胞組成的 1—2個濾泡結構,中間有膠質存在。在隨后的變態(tài)發(fā)育過程中, 在27—37階段時, 甲狀腺體積緩慢增大, 濾泡個數(shù)逐漸增多, 濾泡體積也在不斷增大, 與此同時, 濾泡內膠質含量也在緩慢增加。到38階段, 甲狀腺體積突然膨大, 濾泡數(shù)目也迅速增大, 濾泡內的膠質明顯增多, 膠質面積相應增加。接下來的39—41階段,甲狀腺體積、濾泡數(shù)目、膠質面積繼續(xù)增加。42階段甲狀腺體積、濾泡數(shù)目、膠質面積急劇增加, 至43階段甲狀腺發(fā)育達到頂峰, 表現(xiàn)為甲狀腺體積最大、濾泡數(shù)目最多、膠質面積最大。之后的44—46階段, 甲狀腺逐漸縮小, 濾泡數(shù)目減少、膠質面積減少, 濾泡形狀變得不規(guī)則。

圖3 32—46階段黑斑蛙蝌蚪下頜中T3含量Fig. 3 T3 content in each lower jaw at stage of 32—46

2.3 黑斑蛙發(fā)育過程中T3激素水平變化

黑斑蛙發(fā)育過程下頜中T3的水平如圖3所示,整體變化趨勢是: 在變態(tài)前的發(fā)育階段中, T3含量增長緩慢, 進入變態(tài)期后, T3含量迅速升高, 在變態(tài)高峰期達到峰值, 隨后慢慢下降。具體而言, 在32/33階段, 黑斑蛙的下頜中已經可以檢測出 T3,每個下頜中含量大約是34 pg。在34—41階段, 下頜中T3含量增長緩慢, 每只下頜中T3含量從34 pg增加到45 pg左右。從42階段開始, 下頜中T3含量迅速上升, 每只下頜中T3含量超過110 pg。在43階段, T3含量達到最高峰, 每只下頜中T3的峰值水平在130 pg左右。44階段甲狀腺激素合成開始減少,使甲狀腺內T3激素水平逐漸回落。變態(tài)完成后(46階段), 下頜中T3含量維持在一定水平。

3 討論

Gosner建立的胚胎和蝌蚪發(fā)育階段的劃分系統(tǒng)被廣泛用于無尾目動物發(fā)育階段的識別。本文按照Gosner的系統(tǒng), 對黑斑蛙發(fā)育過程中的形態(tài)變化進行了系統(tǒng)描述。整體來看, 黑斑蛙的形態(tài)變化與Gosner系統(tǒng)中的形態(tài)描述基本一致, 除了兩處細微不同: Gosner將后腿芽長度為寬度的1.5倍至2倍定義為 29階段; 當長度達到寬度的 2倍, 定義為 30階段; 后腿芽出現(xiàn)槳狀足, 定義為31階段。但是我們觀察黑斑蛙發(fā)現(xiàn), 后腿芽的長一般到不了寬的 2倍時就會出現(xiàn)槳狀足, 也就是30階段不明顯, 所以我們將黑斑蛙的29/30階段合并。另外, Gosner定義32和33階段分別為槳狀足上出現(xiàn)1個和2個缺凹;而黑斑蛙中 2個缺凹幾乎同時出現(xiàn), 所以我們也將32/33合并。

兩棲動物的變態(tài)發(fā)育主要依賴于甲狀腺分泌的甲狀腺激素。本文研究了黑斑蛙從蝌蚪第一個階段到最后一個階段期間甲狀腺的發(fā)育。結果發(fā)現(xiàn), 黑斑蛙在蝌蚪的第一個階段即 26階段就出現(xiàn)包含膠質的甲狀腺濾泡。之前的文獻顯示, 非洲爪蟾的甲狀腺濾泡在Nieuwkoop and Faber (NF)階段劃分系統(tǒng)的49—50階段才開始出現(xiàn), 到51階段時包含膠質的濾泡真正形成[24]。由此看來, 黑斑蛙的甲狀腺濾泡出現(xiàn)時間比非洲爪蟾要早。從激素分泌的時間來看, 我們在32/33階段的黑斑蛙下頜中檢出了T3的存在。而早期文獻認為, 非洲爪蟾在NF 54階段時甲狀腺才開始合成分泌甲狀腺激素[24]。但近期的研究認為, 早期非洲爪蟾蝌蚪的甲狀腺也具有合成甲狀腺激素的功能, 作者分析早期研究之所以報道非洲爪蟾甲狀腺在 NF54才開始分泌激素, 可能是因為當時的檢測方法不夠靈敏所致[25]。與非洲爪蟾NF54階段對應的黑斑蛙階段為 34階段, 但是這個階段 T3水平與前一個階段相比沒有明顯的升高趨勢, 雖然34階段的甲狀腺明顯比32/33階段的甲狀腺大, 甲狀腺組織學結構也明顯發(fā)達。到38階段時黑斑蛙的甲狀腺組織學結構又有一次較為明顯的發(fā)育, 表現(xiàn)為體積增加和濾泡數(shù)目增加, 相應甲狀腺組織的發(fā)育, T3的水平也呈現(xiàn)緩慢上升趨勢。對應甲狀腺的進一步發(fā)育, T3水平在40階段和41階段明顯上升。42階段時甲狀腺濾泡迅速增至 20個左右, T3水平隨之劇烈升高。到43階段T3水平達到頂峰, 此時的甲狀腺組織結構最為發(fā)達, 濾泡數(shù)目多達 30個以上。44階段時甲狀腺開始退化, 相應T3水平回落。之后45階段和46階段, 甲狀腺繼續(xù)退化, 相應T3水平迅速回落。從整個發(fā)育過程來看,黑斑蛙甲狀腺激素水平的變化與甲狀腺組織學的變化是一致的。

根據(jù)甲狀腺激素的開始分泌、水平升高、回落以及對應的形態(tài)學變化, 一般將兩棲動物的變態(tài)分為三個時期: 甲狀腺激素不分泌或極少量分泌的預變態(tài)期(Pre-metamorphosis), 對應腿芽的發(fā)生和生長; 甲狀腺激素分泌但仍保持一個低水平狀態(tài)的前變態(tài)期(Pro-metamorphosis), 對應趾的分化和腿的快速發(fā)育; 甲狀腺激素水平升高直至變態(tài)完成的變態(tài)高峰期(Metamorphic climax), 對應鰓和尾的吸收、腸的重塑等劇烈的變化。從激素水平的研究數(shù)據(jù)來看, 黑斑蛙發(fā)育過程中并沒有一個T3從無到有的階段, 在34階段附近也沒有一個甲狀腺明顯上升的拐點, 所以我們不能根據(jù)甲狀腺激素的變化來確定預變態(tài)期和前變態(tài)期的界限。但為了研究過程中可與其他兩棲物種尤其與非洲爪蟾比較, 我們參考非洲爪蟾54階段作為前變態(tài)期的第一個階段, 將與后腿發(fā)育與之對應的黑斑蛙的 34階段作為前變態(tài)期的第一個階段。在42階段, 黑斑蛙的T3水平急劇升高, 相應的形態(tài)發(fā)生劇烈的變化, 如前腿展開、口角變寬、鰓開始吸收等, 可視作變態(tài)高峰期的開始。因此, 黑斑蛙變態(tài)的三個時期可作如下劃分: 預變態(tài)期為26—33階段, 前變態(tài)期為34—41階段, 變態(tài)高峰期為42—46階段。

綜合以上工作, 本文較為系統(tǒng)地研究了黑斑蛙變態(tài)發(fā)育過程中整體形態(tài)變化, 繪制了甲狀腺組織學發(fā)育圖譜, 描述了甲狀腺激素水平的變化, 為今后黑斑蛙甲狀腺激素功能和甲狀腺干擾研究奠定基礎。

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THE DEVELOPMENT AND HORMONE LEVELS OF THYROID GLAND DURING RANA NIGROMACULATA METAMORPHOSIS

GE Ya-Nan1,2, LI Yuan-Yuan1, ZHANG Yin-Feng1, LOU Qin-Qin1, ZHAO Ya-Xian1and QIN Zhan-Fen1
(1. Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China; 2. Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China)

The metamorphosis of amphibians is considered as a good model to study thyroid hormone (TH) disruption. In the present study, we used Rana nigromaculata, a domestic species, to investigate thyroid development and the changes in TH levels during metamorphosis.We first described the morphological change during the tadpole development (stage 26—46) that the hind limbs appeared and finally formed five toes from stage 26 to 40. At the climax of metamorphosis, the dramatic changes include the protruded forelimbs and start-to-resorb tail. Tail resorption completed at stage 46, indicating the completion of metamorphosis. Corresponding to the morphological changes, histological features of thyroid gland changed significantly. From stage 26 to 37, the thyroid gland was small and developed slowly. At stage 38, the thyroid gland enlarged dramatically. The climax of thyroid gland development happened at the climax of metamorphosis. The thyroid gland began to shrink at the completion of metamorphosis. The thyroid hormone (T3) levels were associated with thyroid gland development. T3 content in per lower jaw was very low before metamorphosis, while increased dramatically during metamorphosis; it reached the peak level at the climax of metamorphosis and then decreased. During Rana nigromaculata metamorphosis, thyroid hormone levels were correlated with thyroid gland histological features. The current study creates the foundation for the research of thyroid hormone disruption.

Rana nigromaculata; Tadpoles; Thyroid gland; Thyroid hormone; Development

Q959.5

A

1000-3207(2014)04-0714-06

10.7541/2014.101

2013-10-24;

2014-02-26

國家 “863”計劃課題(2012AA06A302); 環(huán)保公益性行業(yè)科研專項(201109048)資助

葛雅楠(1985—), 女, 河北保定人; 碩士; 研究方向為毒理學。E-mail: nannan.smart@163.com

秦占芬, E-mail: qinzhanfen@rcees.ac.cn