姚仕彬葉元土蔡春芳姚林杰許 凡劉 猛張寶彤蕭培珍王麗宏

(1. 蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院, 江蘇省水產(chǎn)動物營養(yǎng)重點試驗室, 蘇州 215123; 2. 北京市營養(yǎng)源研究所, 系統(tǒng)營養(yǎng)工程技術(shù)研究中心, 北京100069)

氧化豆油水溶物對離體草魚腸道黏膜細胞的損傷作用

姚仕彬1葉元土1蔡春芳1姚林杰1許 凡1劉 猛1張寶彤2蕭培珍2王麗宏2

(1. 蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院, 江蘇省水產(chǎn)動物營養(yǎng)重點試驗室, 蘇州 215123; 2. 北京市營養(yǎng)源研究所, 系統(tǒng)營養(yǎng)工程技術(shù)研究中心, 北京100069)

以氧化豆油水溶物為試驗材料, 在草魚腸道黏膜細胞培養(yǎng)液中加入不同濃度氧化豆油水溶物, 研究不同劑量氧化豆油水溶物在不同作用時間下對腸道黏膜細胞生長、細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果顯示: 添加111.06—888.48 g/L氧化豆油的水溶物作用6h顯著降低細胞活性(P＜0.05), 細胞集落面積減小、細胞形態(tài)改變, 其中在 444.24 g/L氧化豆油的水溶物作用下培養(yǎng)細胞空泡變性, 且脂肪滴沉積, 線粒體腫脹。在222.12—888.48 g/L氧化豆油的水溶物作用下, 3—9h內(nèi)培養(yǎng)液中LDH活力顯著增高(P＜0.05); 各時間點培養(yǎng)液中GSH-PX、SOD、T-AOC均有顯著變化。結(jié)果表明, 在培養(yǎng)液中添加111.06—888.48 g/L氧化豆油的水溶物作用 12h內(nèi), 對草魚腸道黏膜細胞產(chǎn)生了損傷, 表現(xiàn)為抑制細胞生長, 改變細胞形態(tài)、結(jié)構(gòu), 可能引起細胞膜脂質(zhì)過氧化, 導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)破壞, 且作用程度與添加濃度、作用時間相關(guān)。研究認為氧化豆油水溶物對草魚腸道黏膜細胞具有顯著性的損傷作用。

草魚; 腸道黏膜細胞; 氧化豆油; 細胞生長

飼料中油脂能為魚類提供能量和必需脂肪酸,以維持其正常的生命活動和細胞膜正常結(jié)構(gòu)與功能[1—3]。然而, 飼料中油脂在高溫、有氧等條件下容易氧化酸敗, 產(chǎn)生多種初級與次級氧化物[4—7],當(dāng)這些氧化產(chǎn)物被魚類攝食后, 會破壞魚類的正常生理生化功能, 如降低生物膜流動性[8]、破壞膜結(jié)構(gòu)完整性[9,10]、影響機體抗氧化酶及輔酶活性[11,12],導(dǎo)致魚類生長緩慢[13—15]。腸道是營養(yǎng)吸收的主要器官及抵御細胞與毒素的屏障[16—18], 氧化油脂能造成動物腸道損傷[19,20]。然而, 目前關(guān)于氧化油脂對魚類腸道損傷機理尚不清楚, 利用離體細胞研究氧化油脂或油脂氧化產(chǎn)物對腸道黏膜細胞(Intestinal epithelial cells, IECs)的損傷作用未見報道。氧化油脂需要經(jīng)過乳化后才能加入到細胞培養(yǎng)液中, 而如何避免乳化劑對培養(yǎng)細胞所產(chǎn)生的損傷作用還需要研究。氧化油脂水洗后所得水溶物包含了油脂氧化后的水溶性產(chǎn)物, 這類水溶性物質(zhì)則可以順利加入到細胞培養(yǎng)液中進行試驗研究。因此, 本試驗利用分離、培養(yǎng)的草魚腸道黏膜細胞為實驗對象, 在細胞培養(yǎng)液中添加不同劑量的氧化豆油水溶物, 觀察其對細胞的生長、形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能的影響, 探索氧化豆油水溶物對腸道黏膜細胞的損傷機制, 為研究氧化油脂對魚類腸道的損傷機制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗草魚與腸道黏膜細胞分離、培養(yǎng)

草魚 獲取腸道黏膜原代細胞的試驗草魚(Ctenopharyngodon idella)平均重量為(22.0±5.0) g,購自蘇州相城新時代養(yǎng)殖場。飼養(yǎng)于蘇州大學(xué)魚類循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中, 使用自制的強化飼料(中國發(fā)明專利“一種強化魚類腸道黏膜和肝胰臟細胞生理功能的配合飼料”, 專利號ZL 201010585756.9)強化飼養(yǎng)2周后用于腸道黏膜細胞的采集。養(yǎng)殖期間投喂的配合飼料含蛋白質(zhì)28%、油脂4%。每天投喂飼料2次, 水溫為(24±4.0)℃、溶解氧＞6 mg/L。

腸道黏膜原代細胞的獲取與培養(yǎng)方法 草魚腸道黏膜細胞(細胞團)獲取及其培養(yǎng)方法參照本實驗室建立的方法(中國發(fā)明專利“一種魚類腸道黏膜細胞分離與原代培養(yǎng)方法”, 專利號 ZL 20101 0620104.4)進行。主要方法為: 試驗草魚用超純水沖洗體表 2次, 搗碎腦部處死, 迅速置 75%乙醇中浸5—10 s。超凈工作臺上解剖魚體, 取出腸道中段,去除腸系膜脂肪, 用注射器(10 mL)吸取D-Hanks清洗液沖洗腸段內(nèi)腔3—4次; 采用機械刮取獲得腸道黏膜組織, 加入膠原酶Ⅰ、Ⅳ聯(lián)合消化液(為: 含有膠原酶Ⅰ、Ⅳ各0.1 mg/mL的D-Hanks液, 0.22 μm過濾, –20℃貯存), 28℃震蕩消化30min后, 立即加入終止液(按 消化液 ︰胎牛血清=19︰1的比例配制而成)終止消化, 玻璃吸管反復(fù)吹打 5min后, 靜止1min, 吸取上層細胞懸液為原代黏膜細胞(細胞團)液。原代黏膜細胞(細胞團)液經(jīng)過 400 r/min離心7min, 加入完全培養(yǎng)液(為: 使用前添加 15% 胎牛血清的 M199液)懸浮沉淀, 重復(fù)離心(400 r/min、7min) 2次, 取細胞(細胞團)懸浮液接種于96孔細胞培養(yǎng)板(鼠尾膠原Ⅰ型包被)。

細胞(細胞團)接種數(shù)量保持在2×103(個/孔); 使用添加 15%胎牛血清的 M199為培養(yǎng)液; 在 27℃, 6% CO2條件下培養(yǎng)36h后加入氧化豆油的水溶物進行相關(guān)試驗。

1.2 氧化豆油和氧化豆油水溶物

氧化豆油的制備 豆油購自東海糧油工業(yè)(張家港)有限公司, 普通浸出工藝, 未添加抗氧化劑。采用殷永風(fēng)等[21]方法進行油脂氧化, 制備氧化豆油, 具體條件為: 氧化溫度(80±2)℃, 充入泵充入空氣進行氧化, 氧化時間為30d。氧化豆油氧化指標:碘價Ⅳ(GB/T5532-1995)(48.89±4.28) g(I2)/kg、酸價AV(GB/T5530-2005)(7.68±0.14) mg(KOH)/g、過氧化值POV(GB/T5538-2005)(532.35±22.03) meq/kg、丙二醛MDA(GB/T5009-2003)(325.58±4.15) μmol/L。

氧化豆油水溶物的制備 稱取264.32 g氧化豆油, 加入1000 mL雙蒸水充分混合后, 轉(zhuǎn)入分液漏斗中, 靜置 15min, 收集下層水溶液, –80℃過夜冷凍, 于真空干燥器中冷凍干燥 5d, 獲得氧化豆油水溶物固體結(jié)晶。為了對氧化豆油水溶物進行定量,使用雙蒸水將經(jīng)過冷凍干燥氧化豆油水溶物固體結(jié)晶溶解并定容至 35 mL, 在超凈臺中 0.2 μm過濾,制備得到無菌氧化豆油的水溶物, –80℃冷凍保存?zhèn)溆谩２捎迷噭┖?南京建成生物工程研究所生產(chǎn))測得其中含有 MDA (84.24±1.57) μmol/L、H2O2(1864.63±142.14) μmol/L。

氧化豆油水溶物的表示方法 在細胞培養(yǎng)液中加入定量(mL)的氧化豆油水溶物, 以“每個實驗處理中添加的氧化豆油所含有的水溶物的量”表示添加的水溶物量, 計算公式為: 對應(yīng)氧化豆油量(g/L)=(m氧化豆油/v氧化豆油水溶物定容)×(v添加氧化豆油水溶物量/v培養(yǎng)液最終體積) ×1000, 其中 m為用于制備水溶物的氧化豆油質(zhì)量,單位為g, v氧化豆油水溶物定容為m質(zhì)量的氧化豆油得到的水溶物定容體積, v添加氧化豆油水溶物量為每個實驗處理中所添加的水溶物體積, v培養(yǎng)液最終體積為對應(yīng)的細胞培養(yǎng)液體積, 單位均為mL。

1.3 試驗方案

采用單因子試驗設(shè)計, 設(shè)對照組及 4個氧化豆油水溶物處理組, 各組均為128個重復(fù)(孔), 此外另增設(shè)處理組3及對照組96個重復(fù), 用于電鏡取樣。

當(dāng)細胞生長 36h時, 分別添加含不同濃度氧化豆油水溶物的完全培養(yǎng)液至原代草魚IECs中, 計算每升培養(yǎng)液中添加對應(yīng)的氧化豆油量, 4個處理組添加對應(yīng)氧化豆油量分別為 111.06、222.12、444.24和888.48 g/L, 見表1。同時計算得到每個實驗處理對應(yīng)的丙二醛和H2O2的量。

1.4 主要試驗方法

細胞觀察 分別在實驗開始后3h、6h、9h、12h時取出培養(yǎng)板進行觀察。培養(yǎng)的活體細胞直接用IX70熒光倒置顯微鏡(奧林巴斯公司)進行觀察和照相, 或經(jīng)過Giemsa染色[22], 觀察細胞集落的生長狀態(tài)。而細胞形態(tài)、內(nèi)部結(jié)構(gòu)的觀察則是經(jīng)過常規(guī)制片、染色后用透射電子顯微鏡(Hitachi H600)觀察。操作方法為實驗開始后3、6h時于對照組與處理組3選取 48孔, 進行電鏡取樣, 常規(guī)電鏡方法制樣,醋酸鈾–檸檬酸鉛雙染色, 透射電鏡觀察。

活細胞數(shù)量測定 隨機選取8個培養(yǎng)孔培養(yǎng)的細胞, 測定細胞活性[23], 計算細胞抑制率, 公式為: 細胞抑制率(%)=(A對照組–A處理組)/A對照組。MTT (Sigmaaldrich產(chǎn)品)濃度5 mg/mL, 0.22 μm過濾, –20℃貯存。

培養(yǎng)液中主要生化指標的測定 在不同培養(yǎng)時間, 每個處理組隨機選取32個孔培養(yǎng)細胞, 吸取培養(yǎng)液保存于5只1.5 mL EP管中, 選取其中4支在–80℃冷凍保存, 用于測定培養(yǎng)液中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)活力、微量丙二醛(MDA)含量, 剩下1支2000 r/min離心5min, 取上清液10000 r/min離心5min, 留取上清液, –80℃冷凍保存, 用于測定堿性磷酸酶(AKP)、乳酸脫氫酶(LDH)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)活力。均使用試劑盒(南京建成生物工程研究所生產(chǎn))并按照試劑盒方法測定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均值±標準差(Mean ± SD)表示, 結(jié)果用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析, 用Duncan 氏法進行多重比較, 差異顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 對培養(yǎng)細胞生長與抑制率的影響

分離的草魚腸道黏膜細胞經(jīng)過36h培養(yǎng)后, 加入氧化豆油水溶物進行培養(yǎng), 分別于3h、6h、9h、 12h時, 采用MTT方法對培養(yǎng)的黏膜細胞進行細胞活性測定。結(jié)果見表2。與對照組相較, 在加入氧化豆油水溶物后12h內(nèi), 添加444.24—888.48 g/L氧化豆油的水溶物均顯著降低細胞活性(P＜0.05), 222.12 g/L 濃度組在添加后3h、6h、12h較對照組顯著降低(P＜0.05), 111.06 g/L 濃度組在添加后6h、12h較對照組顯著降低(P＜0.05), 其余差異不顯著(P＞0.05)。計算氧化豆油水溶物對培養(yǎng)的腸道黏膜細胞活性抑制率(圖1), 在添加氧化豆油的水溶物后,細胞抑制率在12h為最高, 其次為6h時, 細胞抑制率與氧化豆油水溶物的添加量呈正相關(guān)。

表1 試驗設(shè)計Tab. 1 The experimental design

表2 細胞活性變化(MTT OD值)Tab. 2 Changes of activity of cells (MTT OD value)

上述結(jié)果顯示, 加入氧化豆油水溶物后, 草魚腸道黏膜細胞活性下降; 細胞活性降低程度、抑制率與氧化豆油水溶物的添加量、作用時間相關(guān)。

2.2 對細胞生長狀態(tài)、細胞形態(tài)及其內(nèi)部結(jié)構(gòu)的影響

在加入不同濃度的氧化豆油水溶物后的不同時間里, 通過熒光倒置顯微鏡、Giemsa染色后顯微鏡觀察培養(yǎng)的實驗細胞的生長狀態(tài), 并用電子顯微鏡觀察實驗細胞的形態(tài)及內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化過程。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 對照組細胞生長分化正常, 胞質(zhì)豐富(圖版Ⅰ-a);3h時, 處理組出現(xiàn)游離細胞及折光性較差的圓球狀細胞, 其中以處理組4較為明顯(圖版Ⅰ-b、c); 至12h時,處理組中細胞脫落, 貼壁細胞數(shù)量減少(圖版Ⅰ-d、e)。

圖1 不同時間點處理組細胞抑制率變化Fig. 1 Cell inhibitory rate of treatment groups in different time

培養(yǎng)細胞經(jīng)Giemsa染色后可知, 對照組細胞集落面積較大, 細胞生長分化正常, 細胞界限與細胞核清晰(圖版Ⅰ-f、g); 3h時, 處理組中細胞核清晰度下降, 細胞界限模糊, 其中以處理組3、4較為明顯(圖版Ⅰ-h、i); 12h時, 各處理組中細胞集落面積減小,局部僅呈現(xiàn)細胞脫落后殘留的細胞團(圖版Ⅰ-j、k)。

從對照組與處理組3電鏡觀察結(jié)果可知, 對照組細胞線粒體正常, 內(nèi)嵴清晰,黏膜細胞緊密連接清晰(圖版Ⅰ-l), 添加氧化豆油水溶物3h時, 細胞核膜皺折程度嚴重, 線粒體腫脹, 部分黏膜細胞的細胞膜破裂(圖版Ⅰ-m、n); 6h時, 氧化豆油水溶物導(dǎo)致細胞空泡變性嚴重, 細胞內(nèi)脂肪滴沉積, 線粒體腫脹

(圖版Ⅰ-o)。

上述結(jié)果顯示細胞死亡或凋亡程度隨著氧化豆油水溶物的添加濃度及作用時間增加而加強, 氧化豆油水溶物作用細胞后細胞折光性減弱, 細胞呈圓球狀, 染色后發(fā)現(xiàn)細胞輪廓不清晰, 細胞界限模糊。添加對應(yīng)888.48 g/L氧化豆油的水溶物在3h內(nèi)即對細胞形態(tài)造成影響, 添加對應(yīng)111.06 g/L和222.12 g/L氧化豆油水溶物在6h開始損傷細胞, 其損傷程度較444.24 g/L和888.48 g/L濃度下輕。此外, 電鏡結(jié)果顯示添加對應(yīng)444.24 g/L氧化豆油的水溶物對細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)有明顯影響。

2.3 對培養(yǎng)細胞的細胞膜通透性的影響

LDH和GPT是細胞內(nèi)酶, 只有在細胞膜損傷導(dǎo)致細胞膜通透性增加的情況下才會在培養(yǎng)液中大量檢出, 因此可作為培養(yǎng)細胞細胞膜損傷程度判定的指標之一。在加入氧化豆油水溶物不同時間后, 測定培養(yǎng)液中的LDH和GPT活力(表3)。相較于對照組,3—9 h添加222.12—888.48 g/L氧化豆油的水溶物顯著增加培養(yǎng)液中LDH活力(P＜0.05), 其余差異不顯著(P＞0.05)。3—12 h時添加444.24—888.48 g/L氧化豆油的水溶物顯著增高培養(yǎng)液中 GPT活力(P＜0.05), 添加 222.12 g/L氧化豆油的水溶物在6—12 h顯著增高(P＜0.05), 添加111.06 g/L氧化豆油的水溶物在6、12 h顯著增高(P＜0.05), 其余差異不顯著(P＞0.05)。

因此, 添加 444.24—888.48 g/L氧化豆油的水溶物培養(yǎng)細胞 3—9 h能顯著增大細胞膜的通透性,導(dǎo)致細胞內(nèi)酶逸出。

表3 培養(yǎng)液中LDH和GPT活力變化Tab. 3 Changes of LDH and GPT activity in culture medium (U/L)

2.4 培養(yǎng)液中AKP酶活力變化

AKP是腸道黏膜細胞的標志酶, 代表了細胞的成熟分化程度[24]; AKP活力上升, 表明細胞分化程度越高, 細胞的消化、吸收和防御能力越強[25]。由表4知, 與對照組比較, 6—12h, 各處理組顯著降低培養(yǎng)液中AKP活力(P＜0.05), 3h時處理組2—4培養(yǎng)液中 AKP活力均顯著升高(P＜0.05), 其余差異不顯著(P＞0.05)。

上述結(jié)果表明, 添加 111.06—888.48 g/L氧化豆油的水溶物在6—12h能顯著抑制細胞的分化成熟。

2.5 培養(yǎng)液MDA含量變化

從表 5可知, 培養(yǎng)液中添加不同含量氧化豆油的水溶物后, 3h時處理組培養(yǎng)液MDA含量隨著氧化豆油的水溶物添加量的增高而增大; 與對照組相較, 隨著時間的延長, 處理組中培養(yǎng)液MDA含量呈逐漸降低的趨勢, 其中相較于 3h, 6h時添加222.12—888.48 g/L氧化豆油的水溶物組培養(yǎng)液中MDA含量下降幅度均大于 46.95%; 12h時, 添加111.06—222.12 g/L氧化豆油的水溶物培養(yǎng)液MDA含量與對照組差異不顯著(P＞0.05)。

2.6 培養(yǎng)液中GSH-PX、SOD、T-AOC變化

從表6可知, 相較于對照組, 各處理組氧化豆油的水溶物僅在3—6 h對培養(yǎng)液中GSH-PX活力顯著降低(P＜0.05), 其余差異不顯著(P＞0.05); 添加111.06—444.24 g/L氧化豆油的水溶物在9—12 h培養(yǎng)液中SOD活力極顯著降低(P＜0.05), 888.48 g/L氧化豆油水溶物組在3—9 h培養(yǎng)液中SOD活力極顯著降低(P＜0.05); 添加888.48 g/L氧化豆油的水溶物其培養(yǎng)液中T-AOC能力在12h內(nèi)均顯著降低(P＜0.05), 444.24 g/L濃度組僅在6 h—12 h顯著降低(P＜0.05)。

3 討論

表4 培養(yǎng)液中AKP活力變化(U/L)Tab. 4 Changes of AKP activity in culture medium (U/L)

表5 培養(yǎng)液中MDA含量變化Tab. 5 Changes of concentration of MDA in culture medium (μmol/L)

氧化油脂對養(yǎng)殖動物的生理健康有嚴重的不良影響, 而油脂氧化產(chǎn)物的組成非常復(fù)雜, 且隨著油脂種類不同、氧化條件不同所得的氧化產(chǎn)物也有很大的差異, 這是研究氧化油脂對養(yǎng)殖動物生理健康影響的最大難點。從溶解性來區(qū)分, 可以將油脂氧化產(chǎn)物分為水溶性和脂溶性二大類物質(zhì)。利用水洗氧化豆油所得的水溶物中, 主要為豆油氧化所產(chǎn)生的低碳鏈數(shù)的游離脂肪酸、丙二醛、酮等水溶性物質(zhì)。因此, 本文的研究結(jié)果反映了豆油氧化后所產(chǎn)生的水溶性物質(zhì)作為一個整體對草魚腸道黏膜細胞生長、細胞結(jié)構(gòu)的影響, 從一個側(cè)面反應(yīng)了豆油氧化產(chǎn)物對離體細胞的損傷作用, 但不能全面反應(yīng)氧化豆油對離體草魚腸道黏膜細胞所產(chǎn)生的損傷作用。

3.1 氧化豆油水溶物抑制黏膜細胞生長、破壞黏膜細胞正常形態(tài)和結(jié)構(gòu)

細胞活性測定是基于線粒體內(nèi)含有琥珀酸脫氫酶, 其能將MTT從黃色轉(zhuǎn)化為藍色, 廣泛用于細胞增殖及線粒體活力指標, 亦能間接反映細胞代謝程度, 通過其值的大小, 間接表示添加物質(zhì)對細胞生長的促進與抑制作用[23,26]。在本試驗結(jié)果中, 添加111.06—888.48 g/L氧化豆油的水溶物后, 12h細胞活性均極顯著降低(P＜0.01), 說明此濃度范圍及作用時間下氧化豆油水溶物中存在的有害物質(zhì)對細胞生長有較強抑制作用。

表6 培養(yǎng)液中GSH-PX和SOD活力與T-AOC的變化(U/mL)Tab. 6 Changes of GSH-PX, SOD activity and total anti-oxidative capacity in culture medium (U/mL)

通過對細胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)的觀察可以發(fā)現(xiàn), 氧化豆油水溶物能導(dǎo)致細胞集落邊緣不斷產(chǎn)生游離細胞,集落面積減小, 最終僅殘留活力較低的細胞團, 可能原因是氧化豆油水溶物中的有害氧化產(chǎn)物降低了細胞膜的流動性或是影響了細胞黏附因子的表達,導(dǎo)致細胞貼壁能力與遷移受阻, 從而使得細胞集落面積減小。添加444.24 g/L氧化豆油的水溶物后細胞核皺折程度較嚴重, 細胞空泡變性, 細胞內(nèi)脂肪滴沉積, 可能是氧化豆油水溶物中有害氧化產(chǎn)物致使細胞生物膜脂質(zhì)過氧化, 同時破壞線粒體的正常功能, 造成細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化。

綜上所述, 添加111.06—888.48 g/L氧化豆油的水溶物均能不同程度的降低細胞活性, 抑制黏膜細胞的生長; 氧化豆油水溶物對培養(yǎng)的黏膜細胞形態(tài)、細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)造成損傷; 氧化豆油水溶物對黏膜細胞的損傷作用表現(xiàn)為全面性的損傷。

3.2 氧化豆油水溶物損傷細胞膜完整性

細胞通透性變化是細胞損傷的標志之一, 損傷引起胞漿酶釋放, 酶活力的變化反映細胞損傷程度的變化。胞漿酶釋放量可以反映出細胞膜的完整性和胞漿酶的滲漏性[27—29]。細胞具有正常結(jié)構(gòu)是其具有正常生理功能的前提, LDH、GPT存在于胞漿內(nèi),若其正常結(jié)構(gòu)受到破壞, 胞內(nèi)酶則逸出膜外, 在培養(yǎng)液中被檢測出來。研究發(fā)現(xiàn), 在低濃度H2O2(50—200 μmol/L)的作用下, 細胞線粒體功能未見明顯改變, 在高濃度(400 μmol/L)時可導(dǎo)致線粒體功能不可逆的進行性下降, 致使線粒體內(nèi)嵴減少、腫脹, 同時線粒體參與了 H2O2誘導(dǎo)腸上皮細胞的早期程序性死亡及隨后的細胞死亡[30], 同時MDA能與細胞膜上蛋白質(zhì)交聯(lián), 形成 MDA-蛋白質(zhì)的加合產(chǎn)物,導(dǎo)致細胞膜發(fā)生改變[20]。本試驗處理組添加氧化豆油的水溶物后, 處理組培養(yǎng)液中H2O2與MDA含量分別為達到27.42—219.37 μmol/L、1.24—9.91 μmol/L,且對細胞活性、膜結(jié)構(gòu)、細胞通透性產(chǎn)生了顯著影響, 可能是氧化豆油中H2O2及MDA分別對細胞線粒體及細胞膜的影響促進細胞凋亡, 致使細胞內(nèi)酶的漏出; 此外, 本試驗中添加氧化豆油水溶物后,處理組培養(yǎng)液丙二醛各時間點含量相應(yīng)較高, 但隨著時間的延長, 培養(yǎng)液丙二醛含量逐漸降低, 可能是培養(yǎng)液中的丙二醛與細胞膜蛋白結(jié)合后, 導(dǎo)致培養(yǎng)液丙二醛含量下降。根據(jù)本試驗結(jié)果, 推測氧化豆油水溶物對細胞產(chǎn)生損傷的有害物質(zhì)中除 H2O2外, MDA可能為對細胞產(chǎn)生損傷的重要物質(zhì)之一。

3.3 氧化豆油水溶物對黏膜細胞正?？寡趸δ?、分化程度具有重大影響

氧化豆油水溶物對細胞造成了不同程度的損傷,引起細胞產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化, 導(dǎo)致細胞結(jié)構(gòu)破壞。谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)是廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶, 主要分解 H2O2, 專一作用超氧陰離子(O2?-)的 SOD能夠清除多余的活性氧物種,維持機體氧化-抗氧化平衡[31—33]; T-AOC是用來衡量機體抗氧化系統(tǒng)功能狀況的綜合指標。本試驗中,氧化豆油水溶物作用草魚 IECs細胞后培養(yǎng)液中GSH-PX、SOD活力及T-AOC均降低, 說明細胞抗氧化能力已經(jīng)受到損傷。從3種抗氧化酶活力降低程度看, 氧化豆油水溶物損傷細胞時對 GSH-PX、SOD 影響較大, 說明了氧化豆油水溶物中大量的H2O2、自由基等直接攻擊細胞后使細胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng), 導(dǎo)致細胞產(chǎn)生大量氧自由基等活性物質(zhì), 促使細胞抗氧化酶活力的降低, 導(dǎo)致細胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生脂質(zhì)過氧化作用。從時間進程看, 各實驗組在 3—6 h內(nèi) GSH-PX活力下降, 顯示出氧化豆油水溶物對腸道黏膜細胞的直接損傷作用; 9h后, 各實驗組GSH-PX活力增加, 基本達到對照組的水平, 應(yīng)該是培養(yǎng)細胞受到氧化豆油水溶物損傷后, 刺激了細胞分泌GSH-PX或激活GSH-PX活力, 同時細胞功能也得到一定程度恢復(fù), 是培養(yǎng)細胞中清除H2O2的GSH-PX抗應(yīng)激能力特異性強化的結(jié)果; 3h與6h氧化豆油水溶物濃度增加 GSH-PX先下降后上升, 也呈現(xiàn)出此種情況。

本試驗在測定AKP活力之前, 樣品均離心, 以有效消除細胞 AKP活力的影響。本試驗中測定的AKP活力代表了培養(yǎng)細胞外溢到細胞外的 AKP活力, 在添加氧化豆油水溶物后3h內(nèi), AKP活力顯著升高, 是否是氧化豆油水溶物對細胞膜的直接損傷作用, 導(dǎo)致細胞通透性增加, 細胞外溢的AKP酶含量增加的結(jié)果還值得研究。而在6—12h, AKP活力呈降低趨勢, 表明氧化豆油的水溶物抑制了細胞的分化成熟, 產(chǎn)生明顯抑制濃度為222.12—888.48 g/L, 作用時間點主要集中在添加后6—12h。

4 結(jié)論

在本試驗條件下, 對應(yīng)氧化豆油 111.06—888.48 g/L氧化豆油的水溶物在作用12h內(nèi)對原代草魚IECs細胞生長、細胞形態(tài)及細胞分化成熟產(chǎn)生了抑制, 其作用程度與添加濃度和作用時間相關(guān)。氧化豆油水溶物能引起原代草魚 IECs損傷的作用位點可能在細胞膜結(jié)構(gòu), 作用途徑可能是直接導(dǎo)致細胞膜脂質(zhì)過氧化或是細胞抗氧化能力下降間接導(dǎo)致細胞膜脂質(zhì)過氧化。

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THE WATER SOLUBLE MATTER FROM OXIDIZED SOYBEAN OIL DAMAGES DISSOCIATED INTESTINAL EPITHELIAL CELLS OF GRASS CARP (CTENOPHARYNGODON IDELLA)

YAO Shi-Bin1, YE Yuan-Tu1, CAI Chun-Fang1, YAO Lin-Jie1, XU Fan1, LIU Meng1, ZHANG Bao-Tong2,
XIAO Pei-Zhen2and WANG Li-Hong2
(1. Key Laboratory of Aquatic Nutrition of Jiangsu Province, Suzhou University, Suzhou 215123, China; 2. Open Laboratory for Aquatic Animal Nutrition, Beijing Nutrition Resources Institute, Beijing 100069, China)

The present study investigated the effects of water soluble matter from oxidized soybean oil on the growth, morphology and structure of intestinal epithelial cells (in vitro) from Ctenopharyngodon idella. The water soluble matter was applied at different concentrations for various periods of time. The activity and survival of cells were significant reduced after 6h incubation with culture medium supplemented with water soluble matter in the concentration range of 111.06—888.48 g/L. Furthermore there was an associated decrease in the size of cell colonies as well as a change in cell morphology. When the water soluble matter from oxidized soybean oil reached the concentration of 444.24 g/L, the formation of fat droplets and vesicles in cells could be observed under transmission electron microscope, as well as swelling mitochondria in cells. During 3—9h incubation, LDH activity significantly increased; there was also significant change in GSH-PX, SOD activity and T-AOC. In conclusion, during 12 hours the dissociated IECs from Ctenopharyngodon idella could be damaged by the water soluble matter from oxidized soybean oil in the concentration range of 111.06—888.48 g/L. The damage occurs primarily in the manifestation of altered growth-inhibitory, morphology, and cell structure, probably involving the lipid peroxidation in cell membrane and the subsequent destruction in cell structure. The extent of damage is correlated with the concentration and incubation time. Overall, there was significant damage of water soluble matter from oxidized soybean oil on IECs in vitro.

Ctenopharyngodon idella; Intestinal epithelial cells; Oxidized soybean oil; Cellular growth

S963.7

A

1000-3207(2014)04-0689-10

圖版Ⅰ 氧化豆油水溶物對草魚腸道黏膜細胞生長、形態(tài)、結(jié)構(gòu)的影響
PlateⅠ Effect of water soluble matter of oxidized soybean oil on growth, morphology and structure of IECs

a.對照組, 3h, 細胞集落(↑); b. 處理組3, 3h, 游離細胞(↑); c. 處理組4, 3h, 折光性差的細胞(↑); d.處理組2, 12h, 大部分細胞脫落; e.處理組3, 12h; f. 對照組, 3h, 細胞集落(↑); g. 對照組, 12h, 分化成熟的細胞(↑); h.處理組3, 3h, 細胞界限模糊(↑); i.處理組4, 3h, 細胞界限模糊(↑); j. 處理組2, 12h, 細胞脫落嚴重(↑); k.處理組3, 12h, 細胞脫落后殘留的貼壁細胞團(↑); l.對照組, 9h, 細胞生長正常, 可見細胞間緊密連接(↑); m.處理組3, 3h, 核膜皺折程度嚴重(↑A), 線粒體腫脹(↑B); n.處理組3, 3h, 部分細胞裂解死亡, 線粒體腫脹(↑); o.處理組3, 6h, 胞漿空泡變性嚴重(↑A), 線粒體腫脹(↑B), 脂肪滴沉積(↑C)
a. Control group, 3h, cell colonies (↑); b. Treatment group 3, 3h, inadherent cell (↑); c. Treatment group 4, 3h, weak refraction cells (↑); d. Treatment group 2, 12h, anoikis of most cells; e. Treatment group 3, 12h; f. Control group, 3h, cell colonies (↑); g. Control group, 12h, differentiation and maturation of cells (↑); h. Treatment group 3, 3h, cell boundaries were not clearly defined (↑); i. Treatment group 4, 3h, cell boundaries were not clearly defined (↑); j. Treatment group 2, 12h, serious anoikis of most cells (↑); k. Treatment group 3, 12h, adherent blastocyte after anoikis of cells (↑); l. Control group, 9h, normal cell growth, cell tight junction observed (↑); m. Treatment group 3, 3h, the nuclear membrane folded seriously (↑A), swelling mitochondrial (↑B); n. Treatment group 3, 3h, pyrolysis of apoptosis in some cells, swelling mitochondrial (↑); o. Treatment group 3, 6h, the formation of fat droplets (↑C) and vesicles (↑A) in cells, swelling mitochondrial (↑B)
a—e: 倒置熒光顯微鏡觀察, ×200; f—k: Giemsa染色觀察, ×200; l—o: 透射電鏡觀察, ×6000
a—e In flulrescence microscope, ×200; f—k Staining a monolayer cell sulture with Giemsa,×200 ; l—o In transmission electron microscope, ×6000

10.7541/2014.98

2013-05-22;

2013-11-20

國家自然科學(xué)基金項目(31172417); 蘇州市應(yīng)用基礎(chǔ)(農(nóng)業(yè))項目(N313401210)資助

姚仕彬(1986—), 男, 碩士; 研究方向為水產(chǎn)動物營養(yǎng)與飼料。E-mail: yaoshibin2006@163.com

葉元土, 教授; Tel: 0512-65880179; E-mail: yeyt@suda.edu.cn