尹 飛龔頎楊施兆鴻孫 鵬彭士明高權(quán)新但學(xué)明李安興

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)部東海與遠(yuǎn)洋漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200090; 2. 中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 水產(chǎn)品安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/生物防治國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510275; 3. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院, 廣州 510642)

尹 飛1龔頎楊2施兆鴻1孫 鵬1彭士明1高權(quán)新1但學(xué)明3李安興2

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)部東海與遠(yuǎn)洋漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200090; 2. 中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 水產(chǎn)品安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/生物防治國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510275; 3. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院, 廣州 510642)

為探明刺激隱核蟲感染對(duì)褐菖生理機(jī)能的影響, 研究分別用2500、5000、7500和10000幼蟲/魚的刺激隱核蟲感染褐菖, 并分別檢測(cè)感染后24h、48h、72h 和96h各時(shí)間點(diǎn)血清中皮質(zhì)醇(COR)、血糖(GLU)、總蛋白(TP)含量; 肝臟中丙二醛(MDA)和維生素 C(VC)含量, 超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活力; 鰓和皮膚中溶菌酶(LZM)活力。結(jié)果顯示, 隨著感染濃度的增加, 血液中COR和GLU含量均出現(xiàn)不同程度的升高, 其中2500、 5000和7500幼蟲/魚組COR含量的最高值均出現(xiàn)在感染后第3天; 而TP含量總體呈現(xiàn)逐步下降的趨勢(shì), 尤其當(dāng)感染濃度達(dá)到5000幼蟲/魚后, TP含量的下降程度明顯增加; 肝臟中MDA含量呈先降后升的變化趨勢(shì), 其中24h、48h和72h 各點(diǎn)MDA含量的最大值均出現(xiàn)在10000幼蟲/魚組, 最小值則集中出現(xiàn)于在2500和5000幼蟲/魚組; 而VC含量則與MDA含量的趨勢(shì)相反; SOD和CAT活力均出現(xiàn)不同程度的升高; 鰓和皮膚 LZM活力總體呈先上升后回落的變化趨勢(shì)。綜上可知, 刺激隱核蟲感染會(huì)對(duì)魚體造成氧化脅迫和脂質(zhì)過氧化反應(yīng), 其嚴(yán)重程度與感染的蟲細(xì)胞濃度相關(guān)。低濃度感染組的魚所受脅迫較輕, 在滋養(yǎng)體脫落后仍具有一定的自我修復(fù)能力; 而高濃度感染組魚免疫因子的釋放受到抑制或出現(xiàn)紊亂,即便在蟲體脫落后, 其體質(zhì)也很難恢復(fù)。

刺激隱核蟲; 褐菖; 皮質(zhì)醇; 抗氧化酶; 溶菌酶

1 材料與方法

1.1 刺激隱核蟲

實(shí)驗(yàn)所用的刺激隱核蟲蟲株為中山大學(xué)病害實(shí)驗(yàn)室建立的刺激隱核蟲GD1株。該蟲株源自自然感染的卵形鯧[(500±50) g], 并繼續(xù)以卵形鯧作為動(dòng)物模型, 建立起GD1株傳代系統(tǒng)。在傳代第5次時(shí),收集足量幼蟲用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)魚

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

參照Dan, et al.[15]的方法, 在18:00—21:00, 收集脫包囊孵化 1h 內(nèi)的活躍幼蟲于潔凈燒杯中。隨機(jī)吸取已知體積且均勻的蟲液數(shù)滴, 分別滴于載玻片上。用甲醛殺死幼蟲后于顯微鏡下計(jì)數(shù), 并計(jì)算出蟲液濃度。分別按Ⅰ︰2500幼蟲/魚 、Ⅱ ︰5000幼蟲/魚 、Ⅲ ︰7500幼蟲/魚 和Ⅳ ︰10000幼蟲/魚的濃度感染4組實(shí)驗(yàn)魚, 另外以未感染組 (0幼蟲/魚) 作為對(duì)照, 每組設(shè)3個(gè)平行。感染在容積為252 L 的水族缸中進(jìn)行, 每尾魚用水5 L, 每缸含水共計(jì)100 L。在黑暗條件下, 將所需數(shù)量的蟲液倒入實(shí)驗(yàn)缸中, 感染2h 后放入干凈海水正常飼養(yǎng)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中,水質(zhì)理化條件與暫養(yǎng)期間相同。

1.4 樣品采集和檢測(cè)

分別于24h、48h、72h和96h從各濃度感染組和對(duì)照組取樣。每次從各水族缸中隨機(jī)取出3尾, 用0.15 mL/L丁香油將試驗(yàn)魚麻醉后, 用1 mL無菌注射器尾靜脈采血, 置于無菌離心管中, 室溫靜置1h后, 于4℃靜置過夜, 3500 r/min 離心10min, 取上層血清置于?20℃冰箱保存?zhèn)溆?。隨后將魚置于冰盤上解剖, 取出肝臟、鰓和皮膚后, 用預(yù)冷生理鹽水快速?zèng)_洗, 并用吸水紙小心吸干。測(cè)定前先在冰盤內(nèi)將樣品剪碎, 向各組樣品中分別加入9倍體積(w/v)預(yù)冷勻漿介質(zhì)(試劑盒), 將勻漿液置于TGL-16G型冷凍離心機(jī)(3500 r/min、4℃)離心10min。根據(jù)需要, 將上清液稀釋后進(jìn)行酶活力及總蛋白測(cè)定。

血清COR的測(cè)定采用酶聯(lián)免疫法, 試劑盒為美國R&D公司的海水魚皮質(zhì)醇ELISA試劑盒。血清GLU和TP含量用邁瑞MINDRAY-BS200全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。MDA和VC分別按照說明書在532 nm波長下測(cè)定。

酶活力測(cè)定均采用試劑盒 (南京建成) 檢測(cè),相應(yīng)操作參照說明書進(jìn)行。其中, SOD 活力按黃嘌呤氧化酶法, 活力單位定義為1 mg組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD 抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為1個(gè)SOD活力單位 (U)。CAT活力采用比色法, 活力單位定義為每分鐘分解1 μmol的過氧化氫即為1個(gè)酶活力單位 (U)。血清中LZM活力通過濁度比色法測(cè)定。反應(yīng)底物為用磷酸緩沖溶液 (0.05 mol/L pH 6.1) 配制的0.2 mg/mL微壁溶球菌 (Micrococcus lysoleikticus) 懸液。100 μL血清與1900 μL菌懸液混合, 在530 nm波長下, 分別在0.5min和4.5min測(cè)定吸光值(OD)?；盍挝欢x為LZM每分鐘使含菌酶液吸光值減少0.001所需的能力即為1個(gè)酶活力單位(U)。

各組織總TP測(cè)定按照考馬斯亮藍(lán)法[16], 以牛血清白蛋白 (BSA) 作為標(biāo)準(zhǔn), 采用試劑盒 (南京建成) 進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以一元方差分析 (One-way analysis of variance, ANOVA) 和Duncan法進(jìn)行多重比較。以上統(tǒng)計(jì)分析在SPSS 11.5環(huán)境下進(jìn)行。數(shù)據(jù)結(jié)果為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 (mean±SD)。P＜0.05為差異顯著。采用Sigmaplot作圖。

2 結(jié)果

圖1 刺激隱核蟲感染對(duì)褐菖血清生化指標(biāo)的影響Fig. 1 Serum biochemical parameters of Sebastiscus marmoratus to the acute Cryptocaryon irritans infection

多重比較表明, 隨著感染濃度的增加, 肝臟中MDA含量呈先降后升的變化趨勢(shì) (P＜0.05)。其中24h、48h和72h 各點(diǎn)MDA含量的最大值均出現(xiàn)在10000幼蟲/魚組(P＜0.05), 且96h時(shí)的最大值也出現(xiàn)在相對(duì)高的感染濃度組 (7500幼蟲/魚)(P＜0.05)。而24h、48h和96h各點(diǎn)MDA含量的最小值則出現(xiàn)在5000幼蟲/魚組 (P＜0.05); 72h時(shí)則出現(xiàn)在2500幼蟲/魚組 (P＜0.05)。而VC含量則隨著感染濃度的增加呈先升后降的變化趨勢(shì) (P＜0.05)。其中, 7500幼蟲/魚組在第96h和10000幼蟲/魚三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的VC含量均顯著低于其他各組的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的所測(cè)得的結(jié)果 (P＜0.05)。

與對(duì)照組相比, 各感染組的SOD活力均出現(xiàn)不同程度的升高 (P＜0.05)。其中, 隨著感染濃度的增加, 除5000幼蟲/魚(P＞0.05) 和7500幼蟲/魚(P＜0.05)兩組SOD活力在第96h出現(xiàn)小幅回落外, 其余各組各時(shí)間點(diǎn) SOD活力均隨著感染后時(shí)間的推移表現(xiàn)出升高的趨勢(shì)。除對(duì)照和 2500幼蟲/魚組各時(shí)間點(diǎn)間CAT活力差異不顯著外 (P＞0.05), 其余三組CAT活力隨著感染后時(shí)間的推移總體呈升高的趨勢(shì)(P＜0.05)。與對(duì)照組相比, 5000幼蟲/魚和7500幼蟲/魚兩組的CAT活力在第72h之后出現(xiàn)顯著升高 (P＜0.05), 而10000幼蟲/魚則從第24h開始其CAT活力就顯著高于對(duì)照組 (P＜0.05)。

圖2 刺激隱核蟲感染對(duì)褐菖肝臟脂質(zhì)過氧化和抗氧化力的影響Fig. 2 Lipid peroxidation and antioxidant activities of Sebastiscus marmoratus to the acute Cryptocaryon irritans infection

3 討論

COR是魚體中一種與應(yīng)激有關(guān)的重要激素。在受到脅迫時(shí), 血液中COR濃度升高, 這往往會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降, 長此以往, 會(huì)引起生長變緩。寄生蟲感染會(huì)對(duì)魚體造成脅迫[17]。Bowers, et al.的研究顯示, 大西洋鮭 (Salmo salar L.) 感染了鮭瘡痂魚虱 (Lepeophtheirus salmonis) 后, 血清 COR含量顯著升高[10]。在本研究中, 褐菖血清中COR含量隨著感染濃度的升高而上升。其中2500幼蟲/魚、5000幼蟲/魚和7500幼蟲/魚3個(gè)感染組褐菖血清COR含量的最高值均出現(xiàn)在感染后3d, 而此時(shí)也正是滋養(yǎng)體發(fā)育成熟, 魚體表“白點(diǎn)”最明顯的時(shí)候。此時(shí)患病嚴(yán)重的魚攝食量逐步減弱乃至停止, 呼吸速度加快, 并出現(xiàn)不同程度死亡[13]。上述結(jié)果說明, 感染后3d魚體的應(yīng)激反應(yīng)最為強(qiáng)烈。因此建議在實(shí)際生產(chǎn)中, 此時(shí)應(yīng)盡量減少對(duì)魚的干擾, 否則會(huì)增加魚體應(yīng)激。2500幼蟲/魚和5000幼蟲/魚組魚在感染后4d,即蟲體大量脫落后, 血清COR含量出現(xiàn)顯著回落。這說明相對(duì)低感染濃度組的魚所受脅迫較輕, 仍具有一定的自我調(diào)節(jié)力。而高濃度感染組的魚, 即便在蟲體脫落后, 體質(zhì)也很難恢復(fù), 隨后相繼死亡。

圖3 刺激隱核蟲感染對(duì)褐菖鰓(A)和皮膚(B)溶菌酶活性的影響Fig. 3 Branchial (A) and cutaneous (B) LZM activity of Sebastiscus marmoratus to the acute Cryptocaryon irritans infection

此外, GLU和電解質(zhì)也被認(rèn)為是應(yīng)對(duì)脅迫的響應(yīng)因子[18]。在急性脅迫情況下, GLU濃度往往隨著COR和腎上腺素含量的升高而上升。如在寄生蟲感染中, 在鮭瘡痂魚虱感染大西洋鮭第21天時(shí), GLU和COR含量均顯著升高[10]。這是因?yàn)镃OR可以促進(jìn)肝內(nèi)糖原異生, 增加糖原儲(chǔ)存, 促使GLU升高。在本研究中, 各感染組褐菖GLU含量均顯著高于對(duì)照組, 且與COR含量的升高情況相似。另外, 5000幼蟲/魚和7500幼蟲/魚組血清Na+、Cl–離子濃度和Na+/K+-ATP酶活力隨著感染時(shí)間的增加, 在96h內(nèi)出現(xiàn)先升后降的趨勢(shì); 而10000幼蟲/魚組的上述指標(biāo), 在感染48h后均顯著升高, 并維持在較高水平[13]。這說明魚體嚴(yán)重感染刺激隱核蟲時(shí), 鰓部的泌氯細(xì)胞遭到破壞, 這極大的干擾了離子的排出, 并造成血清滲透壓失衡[19]。研究認(rèn)為, 脅迫嚴(yán)重時(shí)應(yīng)激激素 (COR和兒茶酚胺) 可以起到調(diào)控ATP酶活性的作用, 并以此來彌補(bǔ)由于泌氯細(xì)胞受損而減弱的離子泵功能。除此之外, 血清蛋白含量和血細(xì)胞容積也被認(rèn)為是評(píng)價(jià)組織損傷的指標(biāo)。在魚體感染瘡痂魚虱后, 隨著Cl–離子濃度的升高, 血清蛋白含量和血細(xì)胞容積則顯著降低[17], 這與本研究中蛋白含量的變化情況相似。因此也進(jìn)一步說明患“白點(diǎn)病”的褐菖魚體滲透調(diào)節(jié)出現(xiàn)了異常。

MDA 是機(jī)體脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物之一,對(duì)其含量的測(cè)定可以間接反應(yīng)細(xì)胞的損傷[20]。在寄生蟲感染中, MDA也被當(dāng)作評(píng)價(jià)組織受寄生蟲傷害程度的生物學(xué)指標(biāo)。Gismondi, et al.的研究顯示, 當(dāng)鉤蝦 (Gammarus roeseli) 感染了棘頭蟲(Polymorphus minutes) 后, 降低的MDA含量說明機(jī)體具備了較強(qiáng)的自我保護(hù)力, 其細(xì)胞所受的損傷也有所減輕[21]。在本研究中, 2500幼蟲/魚和5000幼蟲/魚感染組魚肝臟中MDA含量與對(duì)照組相比顯著降低。這可能由于寄生蟲為了能依附宿主生存, 通過抑制脂質(zhì)的過氧化或消除脂質(zhì)過氧化物進(jìn)而對(duì)宿主進(jìn)行了一定程度的保護(hù)。而高濃度刺激隱核蟲感染組, 魚體肝臟MDA含量卻隨感染時(shí)間的延長而顯著升高。這說明寄生蟲感染后, 機(jī)體中脂質(zhì)過氧化反應(yīng)明顯加強(qiáng)[22]。但要想詳細(xì)了解肝細(xì)胞在刺激隱核蟲寄生后的損傷程度, 還需要最直接的組織病理學(xué)觀察結(jié)果來說明。

SOD和CAT是清除活性氧自由基的重要酶蛋白,對(duì)機(jī)體細(xì)胞損傷后的氧化過程和吞噬作用具有很強(qiáng)的防御功能。通常認(rèn)為, SOD在清除活性氧的過程中最早發(fā)揮作用, 它首先促使O2–歧化為H2O2和O2, 隨后CAT再將H2O2催化為H2O和O2, 從而達(dá)到為機(jī)體解毒的目的。Morga, et al.的研究顯示, 包拉米蟲(Bonamia ostreae) 感染歐洲牡蠣 (Ostrea edulis) 后,血細(xì)胞中SOD基因過表達(dá), 起到了抑制活性氧分子(ROS)過量產(chǎn)生的作用[23,24]。在本研究中, SOD、CAT含量隨著感染濃度的升高, 分別于感染后(1—3)d開始不斷升高。這說明刺激隱核蟲感染致使褐菖肝臟中的自由基大量積累, 而SOD和CAT活力升高則有望降低肝臟所受到的傷害。此外, 有研究顯示雖然扁彎口吸蟲 (Clinostomum detruncatum) 感染克林雷士鯰魚 (Rhamdia quelen) 后, 肌肉中SOD和CAT活性與對(duì)照組相比未發(fā)生顯著改變。但通過檢測(cè)“叔丁基過氧化氫引發(fā)的化合光”的升高情況, 該作者認(rèn)為鯰魚肌肉中非酶系統(tǒng)的抗氧化防御力有所減弱[25]。并據(jù)此推測(cè), 上述情況導(dǎo)致了機(jī)體的氧化脅迫和隨之而來的肌肉脂質(zhì)過氧化損傷[25]。在本研究中, 非酶系中的VC含量在高濃度感染組顯著降低的現(xiàn)象也進(jìn)一步證明, 褐菖肝臟受到了嚴(yán)重氧化脅迫和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的不利影響。

LZM是白細(xì)胞中的一類先天免疫防御成分, 它通過水解細(xì)胞壁中的肽聚糖來殺滅細(xì)菌。研究顯示, LZM在抗寄生蟲的免疫防御中發(fā)揮作用[26]。Dan, et al.研究認(rèn)為, 用刺激隱核蟲滋養(yǎng)體細(xì)胞制備疫苗,并通過腹腔注射給點(diǎn)帶石斑魚后, 血液中LZM活力顯著升高, 并在第4周達(dá)到最大值[11]。此外, 在理化和生物因子異常引起的急性脅迫情況下, LZM活性也可以作為魚類應(yīng)激程度的指示信號(hào)[27]。Zhou, et al.研究顯示, 當(dāng)水體中懸浮物過多時(shí), 半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis) 肝臟中LZM活力在5d內(nèi)顯著升高[28]。Hua, et al.研究了嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)感染后的史氏鱘(Aclpenser Schrenckii)血清及各組織中LZM活力的變化, 結(jié)果顯示血清、肝臟和黏液中LZM活力與對(duì)照組相比出現(xiàn)不同程度升高; 而腸道、胃和鰓等組織中LZM活力低于或僅僅接近于對(duì)照組[29]。在本研究中, 鰓和皮膚是刺激隱核蟲寄生的部位, 也是受到直接損害最嚴(yán)重的組織。刺激隱核蟲寄生后, 鰓部和皮膚LZM活力在5000幼蟲/魚和7500幼蟲/魚這兩組中出現(xiàn)大幅度升高; 而在10000幼蟲/魚組時(shí)卻有所降低。這說明在中度感染后, LZM活力升高是機(jī)體受到脅迫的指示; 而在高度感染后, 由于組織損傷或病理變化程度較重造成LZM分泌出現(xiàn)紊亂或被抑制。此外值得注意的是, 2500幼蟲/魚這一低濃度感染組LZM活力分別在鰓或皮膚中的第72h或48h出現(xiàn)了短暫的升高后又有所降低。這可能由于寄生蟲要依附宿主才能生存, 因此物種經(jīng)過長期進(jìn)化后形成了某種共存機(jī)制[21], 比如在較低感染濃度下, 寄生蟲誘使魚體LZM等免疫因子含量在短期內(nèi)升高, 以控制寄生的蟲體數(shù)量和活力, 從而達(dá)到某種平衡, 以減輕對(duì)魚體的傷害。但詳細(xì)情況仍需更多研究加以證明。

綜上可知, 刺激隱核蟲感染會(huì)對(duì)魚體造成氧化脅迫和脂質(zhì)過氧化反應(yīng), 其嚴(yán)重程度與感染的蟲細(xì)胞濃度相關(guān)。低濃度感染組的魚所受脅迫較輕, 在滋養(yǎng)體脫落后仍具有一定的自我修復(fù)能力; 而高濃度感染組魚的免疫因子釋放受到抑制或出現(xiàn)紊亂,即便在蟲體脫落后, 其體質(zhì)也很難恢復(fù)。

[1] Matthews R A, Burgess P J. Cryptocaryon irritans (ciliophora): Primary infection in thick-lipped mullet, Chelon labrosus (risso) [J]. Journal of Fish Diseases, 1995, 18(4): 329—335

[2] Cheung P J, Nigrelli R F, Ruggieri G D. Studies on Cryptocaryoniasis in marine fish: Effect of temperature and salinity on the reproductive cycle of Cryptocaryon irritans brown, 1951 [J]. Journal of Fish Diseases, 1979, 2(2): 93—97

[3] Colorni A. Burgess P. Cryptocaryon irritans brown 1951, the cause of ‘white spot disease’ in marine fish: An update [J]. Aquarium Sciences and Conservation, 1997, 1(4): 217—238

[4] Colorni A. Aspects of the biology of Cryptocaryon irritans, and hyposalinity as a control measure in cultured gilt-head sea bream Sparus aurata [J]. Diseases of Aquatic Organisms, 1985, 1: 19—22

[5] Li Y W, Dan X M, Zhang T W, et al. Immune-related genes expression profile in orange-spotted grouper during exposure to Cryptocaryon irritans [J]. Parasite Immunology, 2011, 33(12): 679—987

[6] Yan M C, Shao X B, Shan L Z, et al. Study on prevention and treatment of Cryptocaryon irritans with formalin for brown croaker, Miichthys miiuy [J]. Modern Fisheries Information, 2008, 23(11): 16—19 [閆茂倉, 邵鑫斌, 單樂州, 等. 福爾馬林防治魚 Miichthys miiuy (Basilewsky)刺激隱核蟲(Cryptocaryon irritans) 的研究. 現(xiàn)代漁業(yè)信息, 2008, 23(11): 16—19]

[7] Qiao W, Li Y W, Li A X. Molecular cloning and characterization of a TLR3 from Epinephelus coioides infected with Cryptocaryon irritans [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2012, 36(3): 385—392 [喬瑋, 李言偉, 李安興. 斜帶石斑魚 TLR3 基因的克隆及其在刺激隱核蟲感染時(shí)的表達(dá)分析. 水生生物學(xué)報(bào), 2012, 36(3): 385—392]

[8] Li R J, Liu F, Wang F H, et al. Skin mucus of rabbitfish (Siganus oramin) is lethal to Cryptocaryon irritans and someother pathogenic organisms [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2013, 37(2): 243—251 [黎睿君, 劉芳, 王方華, 等. 黃斑藍(lán)子魚皮膚黏液對(duì)刺激隱核蟲及一些病原菌的抑殺作用.水生生物學(xué)報(bào), 2013, 37(2): 243—251]

[9] Huang X, Sun Z, Guo G, et al. Cloning and characterization of a surface antigen cisa-32.6 from Cryptocaryon irritans [J]. Experimental Parasitology, 2012, 130(3): 189—194

[10] Bowers J M, Mustafa A, Speare D J, et al. The physiological response of Atlantic salmon, Salmo salar L., to a single experimental challenge with sea lice, Lepeophtheirus salmonis [J]. Journal of Fish Diseases, 2000, 23(3): 165—172

[11] Dan X M, Zhang T W, Li Y W, et al. Immune responses and immune-related gene expression profile in orange-spotted grouper after immunization with Cryptocaryon irritans vaccine [J]. Fish & Shellfish Immunology, 2013, 34(3): 885—891

[12] Sun Z Y, Zheng C F, Wu X Y, et al. The strain and life-cycle of Cryptocaryon irritans isolated from Pseudosciaena crocea cultured in Xiapu Fujian [J]. Journal of Fujian Normal University (Natural Science Edition), 2011, 27(2): 101—108 [孫志宇, 鄭昌峰, 武曉燕, 等. 福建霞浦海區(qū)刺激隱核蟲蟲株鑒定及生活史觀察. 福建師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2011, 27(2): 101—108]

[13] Yin F, Gong Q Y, Li Y W, et al. Effects of Cryptocaryon irritans infection on the survival, feeding, respiratory rate, and ionic regulation of the marbled rockfish Sebastiscus marmoratus [J]. Parasitology, 2014, 141(2): 279—286

[14] Bai J S, Xie M Q, Zhu X Q, et al. Comparative studies on the immunogenicity of theronts, tomonts and trophonts of Cryptocaryon irritans in grouper [J]. Parasitology Research, 2008, 102(2): 307—313

[15] Dan X M, Li A X, Lin X T, et al. A standardized method to propagate Cryptocaryon irritans on a susceptible host pompano Trachinotus ovatus [J]. Aquaculture, 2006, 258(1—4): 127—133

[16] Bradford M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding [J]. Analytical Biochemistry, 1976, 72(1—2): 248—254

[17] Grimnes A, Jakobsen P J. The physiological effects of salmon lice infection on post-smolt of Atlantic salmon [J]. Journal of Fish Biology, 1996, 48(6): 1179—1194

[18] Wedemeyer G A, Barton B A, McLeay D J. Stress and acclimation. In: Schreck C B, Moyle P B (Eds.), Methods for Fish Biology [M]. American Fisheries Society, Bethesda, MD. 1990, 451—489

[19] Misumi I. The ciliated protozoan parasite, Cryptocaryon irritans, and protective immunity in marine fish. Hawai’i [D]. Ph.D. thesis, The University of Hawai’i, Hawai’i. 2009

[20] Janero D R. Malondialdehyde and thiobarbituric acidreactivity as diagnostic indices of lipid peroxidation and peroxidative tissue injury [J]. Free Radical Biology and Medicine, 1990, 9(6): 515—540

[21] Gismondi E, Cossu-leguille C, Bbisel J N. Does the acanthocephalan parasite Polymorphus minutus modify the energy reserves and antitoxic defences of its intermediate host Gammarus roeseli [J]? Parasitology, 2012, 139(8): 1054—1061

[22] Belló A, Fortes E, Belló-Klein A, et al. Lipid peroxidation induced by clinostomum detruncatum in muscle of the freshwater fish Rhamdia quelen [J]. Diseases of Aquatic Organisms, 2000, 42(3): 233—236

[23] Morga B, Arzul I, Chollet B, et al. Infection with the protozoan parasite Bonamia ostreae modifies in vitro haemocyte activities of flat oyster Ostrea edulis [J]. Fish & Shellfish Immunologyol, 2009, 26(6): 836—842

[24] Morga B, Arzul I, Faury N, et al. Molecular responses of Ostrea edulis haemocytes to an in vitro infection with Bonamia ostreae [J]. Developmental and Comparative Immunology, 2011, 35(3): 323—333

[25] Gonzalez Flecha B, Llesuy S, Boveris A. Hydroperoxideinitiated chemiluminescence: An assay for oxidative stress in biopsies of heart, liver, and muscle [J]. Free Radical Biology and Medicine, 1991, 10(2): 93—100

[26] Alishahi M, Buchmann K. Temperature-dependent protection against Ichthyophthirius multifiliis following immunisation of rainbow trout using live theronts [J]. Diseases of Aquatic Organisms, 2006, 72(3): 269—273

[27] Fevolden S E, Refstie T, Gjerde B. Genetic and phenotypic parameters for cortisol and glucose stress response in Atlantic salmon and rainbow trout [J]. Aquaculture, 1993, 118(3-4): 205—216

[28] Zhou Y, Ma Z S, Qu K M, et al. Effects of suspended substance concentration on activities of lysozyme, superoxide dismutase, and Na+-K+-ATPase in juvenile Cynoglossus semilaevis [J]. Oceanologia et Limnologia Sinica, 2009, 40(3): 367—372 [周勇, 馬紹賽, 曲克明, 等.懸浮物對(duì)半滑舌鰨 (Cynoglossus semilaevis)幼魚肝臟溶菌酶、超氧化物歧化酶和鰓絲Na+-K+-ATPase活力的影響.海洋與湖沼, 2009, 40(3): 367—372]

[29] Hua Y P, Liu H B, Zhang Y. Lysozyme levels in serum and different tissues of Amur sturgeon at different temperatures in normal and pathological status [J]. Journal of Northeast Forestry University, 2005, 33(3): 63—66 [華育平, 劉紅柏, 張穎. 溫度、疾病感染對(duì)史氏鱘血清和各組織中溶菌酶水平的影響. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2005, 33(3): 63—66]

STRESS AND IMMUNE RESPONSES OF THE MARBLED ROCKFISH SEBASTISCUS MARMORATUS INFECTED WITH CRYPTOCARYON IRRITANS

YIN Fei1, GONG Qi-Yang2, SHI Zhao-Hong1, SUN Peng1, PENG Shi-Ming1, GAO Quan-Xin1,
DAN Xue-Ming3and LI An-Xing2
(1. Key Laboratory of East China Sea and Oceanic Fishery Resources Exploitation, Ministry of Agriculture, East China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Shanghai 200090, China; 2. Key Laboratory for Aquatic Products Safety of Ministry of Education, State Key Laboratory of Biocontrol, The School of Life Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China; 3. College of Animal Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

To investigate the effects of a Cryptocaryon irritans infection on the biochemical functions and immune responses of the marbled rockfish Sebastiscus marmoratus, this study utilized C. at concentrations of 2,500, 5,000, 7,500, and 10,000 theronts/fish to infect marbled rockfish weighing (45±3) g. Within 96 hours after the infection we measured a variety of parameters at different time points, including (in the serum) cortisol (COR), glucose (GLU), total protein (TP) contens, (in the liver) the malondialdehyde (MDA) and vitamin C (VC) contents, the superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) activities, and (in the gill and skin) the lysozyme (LZM) activities of the marbled rockfish. The results showed that the serum COR and GLU contents of the marbled rockfish gradually increased along with the infection concentration and the lapse of time after the infection. However, the TP content decreased while infection concentration increased. Compared to the control, MDA contents in the liver decreased significantly in the 5 000 theronts/fish infection group, then increased significantly and reached the maximum in the 10000 theronts/fish infection group. VC contents in the liver initially rose and then dropped. Compared to the control group, the SOD and CAT activities of the fish were significantly elevated. The LZM activities in the gill and skin initially increased and then decreased. In conclusion, C. irritans infection may result in adverse effects on the rockfish, probably through oxidative stress and lipid peroxidation. The physiological functions of the fish infected with low concentrations of C. irritans theronts could be effectively restored after the removal of trophont from the host; however the infection with high concentrations irreversibly impaired the release of immune factors.

Cryptocaryon irritans; Sebastiscus marmoratus; Cortisol; Antioxidant enzyme; Lysozyme

Q175; Q18

A

1000-3207(2014)04-0681-08

2013-05-17;

2013-12-28

國家自然科學(xué)基金 (NSFC 31101932; 31272681; 31172443)資助

尹飛(1980—), 男, 內(nèi)蒙古包頭人; 博士, 副研究員; 從事水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原學(xué)研究。E-mail: feige895@gmail.com

李安興, E-mail: lianxing@mail.sysu.edu.cn和0[13]。本研究使用不同濃度的刺激隱核蟲幼體感染褐菖, 通過比較感染后不同時(shí)間點(diǎn)褐菖血清中皮質(zhì)醇 (COR)、血糖 (GLU)、總蛋白 (TP)含量; 肝臟中丙二醛 (MDA)和維生素C (VC) 含量, 超氧化物歧化酶 (SOD) 和過氧化氫酶 (CAT) 活力; 鰓和皮膚溶菌酶(LZM)活力的變化特征, 深入探討魚體的病理變化和生理響應(yīng)機(jī)制。

10.7541/2014.97

刺激隱核蟲 (Cryptocaryon irritans) 俗稱“海水小瓜蟲”, 是一種可以寄生在大多數(shù)海水硬骨魚類的纖毛蟲[1]。魚在感染刺激隱核蟲后, 病灶處形成邊緣明顯的白點(diǎn), 故該寄生蟲病也稱海水魚“白點(diǎn)病”[2,3]。多年來, 隨著海水魚類人工養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展, 由于養(yǎng)殖密度的增加及養(yǎng)殖管理方面的失誤等問題, “白點(diǎn)病”在海水魚養(yǎng)殖區(qū)常有發(fā)生, 造成大量養(yǎng)殖魚死亡, 給養(yǎng)殖從業(yè)者帶來了極大的經(jīng)濟(jì)損失[4]。

為了探明刺激隱核蟲對(duì)魚體的致病機(jī)理并找到有效的防治方法, 學(xué)者們分別從魚體組織病理學(xué)[5]、行為活動(dòng)、藥物殺蟲[6]、魚體免疫響應(yīng)機(jī)制[7]、抗蟲蛋白效力[8]和保護(hù)性抗原篩選[9]等方面進(jìn)行了大量研究。使用生化指標(biāo)評(píng)定魚體的受損傷程度也是魚類病理、免疫學(xué)研究的重要手段[10]。Dan, et al. 向點(diǎn)帶石斑魚(Epinephelus coioides)腹腔注射刺激隱核蟲細(xì)胞疫苗并比較了血液中溶菌酶活力的變化規(guī)律[11]。而在刺激隱核蟲感染后, 魚體中應(yīng)激激素含量和免疫酶活力的變化情況仍未見報(bào)道。