郭穩(wěn)杰俞小牧童金茍

(1. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所, 武漢 430072; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

鳙Sox基因克隆及序列進(jìn)化分析

郭穩(wěn)杰1,2俞小牧1童金茍1

(1. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所, 武漢 430072; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

利用簡(jiǎn)并引物SoxN和Sox9在鳙基因組DNA中進(jìn)行PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物克隆測(cè)序, 并對(duì)序列進(jìn)行同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果表明本文鑒定出鳙15個(gè)Sox基因HMG盒序列, 分別屬于SoxB、SoxC和SoxE組, 依據(jù)斑馬魚(yú)同源基因?qū)⑵浞謩e命名為Sox1a、Sox1b、Sox2、Sox3、Sox4a、Sox4b、Sox9a、Sox9b、Sox10、Sox11b、Sox12、Sox14a、Sox14b、Sox19和Sox21a?；邝桶唏R魚(yú) Sox1、Sox4和Sox9 基因核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示這3個(gè)Sox基因的復(fù)制時(shí)間發(fā)生在鳙和斑馬魚(yú)的分化之前, 結(jié)果支持了魚(yú)類(lèi)特異的基因組復(fù)制假說(shuō)。以Sox1a、Sox1b和Sox4基因?yàn)榉肿隅姌?biāo)記構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)探討鳙和斑馬魚(yú)的分化時(shí)間, 結(jié)果顯示, 同屬于鯉科魚(yú)類(lèi)的鳙(鯉亞科)和斑馬魚(yú)(魚(yú)丹亞科)在原始的魚(yú)丹亞科魚(yú)類(lèi)中存在一個(gè)共同祖先, 大約出現(xiàn)在63.7百萬(wàn)年前。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究魚(yú)類(lèi)Sox基因復(fù)制和基因組進(jìn)化等問(wèn)題提供了重要參考資料。

鳙; Sox基因; 基因組加倍; 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù); 分化時(shí)間

Sox(Sry-related HMG-box)是一類(lèi)與哺乳動(dòng)物性別決定基因Sry (Sex determining region of Y chromosome)相關(guān)基因構(gòu)成的基因家族。該家族成員都含有一個(gè)保守的HMG (High mobility group) 盒, 其編碼產(chǎn)物能特異性地識(shí)別和結(jié)合 DNA序列, 使DNA發(fā)生彎曲, 是一類(lèi)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[1]。Sox基因廣泛參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、血細(xì)胞生成、晶狀體發(fā)育以及性別決定和分化等重要的生物學(xué)過(guò)程。例如, SOX9與SRY共同作用調(diào)控睪丸的發(fā)育[2]; Sox1、Sox2、Sox3、Sox4和Sox11等參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育調(diào)控[3—5]。目前, Bowles, et al.[6]根據(jù)HMG盒的相似性, 將Sox基因分成A-J 10個(gè)亞族。

由于在進(jìn)化過(guò)程中基因加倍等原因, 魚(yú)類(lèi)和哺乳動(dòng)物的Sox基因家族成員有所差別。例如, Sox1、Sox4、Sox6、Sox8、Sox9、Sox11、Sox14和 Sox21在人類(lèi)和小鼠基因組中只存在一個(gè)拷貝; 而在斑馬魚(yú)中, 這些基因被證實(shí)有兩個(gè)旁系同源基因[7](Paralogous genes)。關(guān)于魚(yú)類(lèi) Sox基因復(fù)制的原因尚無(wú)定論, 主要包括全基因組復(fù)制和基因片段復(fù)制兩種觀點(diǎn)[8]。目前許多研究都支持 Sox基因加倍是全基因組復(fù)制的結(jié)果[9,10]。

研究表明利用堿基同義突變速率和分子鐘模型構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù), 能夠估計(jì)物種間的大致分化時(shí)間[11,12]。由于Sox基因廣泛存在于脊椎動(dòng)物基因組中, 且易于克隆, 成為物種系統(tǒng)進(jìn)化研究非常重要的材料。鯉科魚(yú)類(lèi)(Cyprinidae)是現(xiàn)有魚(yú)類(lèi)中最大的一個(gè)科, 也是生物學(xué)家探索水生動(dòng)物進(jìn)化極好的代表群體[13]。目前, 已有些研究利用 Sox基因估算鯉科魚(yú)類(lèi)物種間分化時(shí)間[9,10]。鳙(Aristichthys nobilis)屬于鯉形目鯉科鰱亞科, 是新近形成的一個(gè)物種[14],對(duì)其Sox基因HMG盒進(jìn)行克隆和序列進(jìn)化分析, 可為探索魚(yú)類(lèi)Sox基因加倍機(jī)制和鯉科魚(yú)類(lèi)系統(tǒng)進(jìn)化研究提供很好的分子資料。

1 材料與方法

1.1 材料和DNA提取

實(shí)驗(yàn)樣本采自武漢漲渡湖漁場(chǎng), 剪取一尾鳙少量鰭條組織浸泡在 95%乙醇中, 然后置于 4℃下保存?zhèn)溆?。采用?jīng)典的酚氯仿法[15]提取基因組DNA。

1.2 基因擴(kuò)增、克隆和測(cè)序

針對(duì)脊椎動(dòng)物Sox基因HMG盒保守的氨基酸序列, 設(shè)計(jì)兩對(duì)簡(jiǎn)并引物 SoxN和 Sox9[16], 由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物對(duì)SoxN序列為5′-ATGAAYGCNTTYATGGTNTGG-3′和5′-GGNCGRTAYTTRTARTCNGG-3′, 引物對(duì)Sox9序列為 5′-ATGAAYGCSTTYATGGTITGG-3′和 5′-GTCIGGGTGRTCYTTCTTRTGYTG-3′。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為50 μL, 包括160—200 ng的基因組DNA,上下游引物(5 μmol/L)各 2 μL, 1.6 μL dNTP (2.5 mmol/L), 0.4 μL Taq DNA酶(5 U/μL)(Takara), 1.25 μL 10×Buffer, 最后補(bǔ)足滅菌雙蒸水至終體積。PCR反應(yīng)條件如下: 94℃預(yù)變性4min; 擴(kuò)增35個(gè)循環(huán), 每個(gè)循環(huán) 94℃變性 1min、53℃退火 1min、72℃延伸1min; 72℃終延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)后, 并用 Biospin膠回收試劑盒(BioFlux, China)純化回收擴(kuò)增產(chǎn)物。將回收產(chǎn)物連接到 pMD18-T克隆載體上(Takara, Japan), 再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α, PCR檢測(cè)陽(yáng)性克隆, 交由北京諾賽基因組研究中心有限公司測(cè)序。

1.3 序列進(jìn)化分析

本文分析中所用到的斑馬魚(yú)(Danio rerio)、紅鰭東方 鲀(Temmincket Schlegel)、海鱸(Dicentrarchus labrax)一些Sox基因序列的來(lái)源見(jiàn)表1。

Sox基因的鑒定 將引物序列從測(cè)得的基因序列中去除, 然后用 Clustalx 1.81[17]軟件進(jìn)行序列比對(duì), 根據(jù)比對(duì)結(jié)果選取有一定變異的一組核酸序列作基因鑒定分析。將篩選出的核酸序列用MEGA 4.0[18]軟件翻譯成氨基酸序列, 在 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性搜索, 鑒定Sox基因。

系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析 采用MEGA 4.0軟件, 用斑馬魚(yú)Sox基因和所有鑒定出的鳙Sox基因氨基酸序列一起進(jìn)行最小進(jìn)化法(Minimum-evolution method, ME)分析, 并以人的TCF7基因(MN_201632)為外類(lèi)群。

Sox基因復(fù)制時(shí)間的推算 由于密碼子具有兼并性, 通常氨基酸第 3個(gè)密碼子堿基置換不改變氨基酸序列, 其替換速率能全面地反映基因突變率,可用于編碼基因的進(jìn)化分析[11,19]。本研究以鳙和斑馬魚(yú)Sox1、Sox4和Sox9基因核苷酸序列為材料, 根據(jù)第3位密碼子堿基置換速率, 利用ME法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù), 推算Sox基因的復(fù)制時(shí)間。

表1 本研究用于序列分析的Sox基因Tab. 1 Sox genes used for sequence analysis in the study

鳙與斑馬魚(yú)分化時(shí)間估算 本研究以鳙、斑馬魚(yú)、紅鰭東方 鲀和海鱸Sox1a、Sox1b和Sox4基因數(shù)據(jù)集為分子鐘標(biāo)記, 根據(jù)第 3位密碼子堿基置換速率, 利用非加權(quán)組平均法(UPGMA method)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù), 估算鳙和斑馬魚(yú)的分化時(shí)間。

2 結(jié)果

2.1 基因擴(kuò)增、克隆與測(cè)序

在鳙基因組DNA中, SoxN引物擴(kuò)增出一條約為220 bp的條帶; Sox9引物擴(kuò)增出大小不等的4條帶, 分別為200、300、700和1200 bp左右。對(duì)這些擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆, 經(jīng)菌落PCR鑒定, 共挑選60個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

2.2 序列分析

鳙Sox基因命名及與斑馬魚(yú)蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析 經(jīng)Clustal序列比對(duì)和Blast同源性比較, 共鑒定出15個(gè)鳙Sox基因, 分別命名為: Sox1a、Sox1b、Sox2、Sox3、Sox4a、Sox4b、Sox9a、Sox9b、Sox10、Sox11b、Sox12、Sox14a、Sox14b、Sox19和 Sox21a (GenBank登錄號(hào)為: KC883624-KC883629, KC867495,KC867494, KC867496, KC883630-KC8836 35)。

以鳙 Sox基因氨基酸序列與斑馬魚(yú)相應(yīng)的 Sox蛋白以ME法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖1)。結(jié)果顯示, 本文所得到的15個(gè)鳙Sox基因歸屬于SoxB、SoxC和SoxE三個(gè)亞族, 其中引物 SoxN擴(kuò)增所得到的鳙Sox基因?qū)儆赟oxB和SoxC, 引物Sox9擴(kuò)增得到的鳙Sox基因?qū)儆赟oxB和SoxE組。

Sox基因復(fù)制時(shí)間的推算 為了推算Sox基因的復(fù)制時(shí)間, 以鳙和斑馬魚(yú) Sox1、Sox4和 Sox9基因的核苷酸序列第 3位密碼子堿基置換速率, 利用ME法構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖2)。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示, Sox1、Sox4和Sox9基因的復(fù)制時(shí)間發(fā)生在鳙和斑馬魚(yú)的分化之前。

鳙與斑馬魚(yú)的分化時(shí)間 利用鳙、斑馬魚(yú)、紅鰭東方 鲀和海鱸Sox1a、Sox1b和Sox4基因數(shù)據(jù)集第3位密碼子堿基置換速率, 采用UPGMA法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù), 以期根據(jù)這些基因的進(jìn)化推測(cè)物種間的分化時(shí)間。以斑馬魚(yú)與紅鰭東方 鲀的分化時(shí)間(290百萬(wàn)年前)為標(biāo)定點(diǎn)[20], 利用以 Sox1a、Sox1b及 Sox4基因?yàn)榉肿隅姌?biāo)記所構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖 3), 推測(cè)鳙(鯉形目, 鯉科, 鳙屬)與斑馬魚(yú)(鯉形目,鯉科, 魚(yú)丹屬)的分化發(fā)生在63.7百萬(wàn)年前。

圖2 利用鳙和斑馬魚(yú)Sox1、Sox9和Sox11基因第3位密碼子堿基替換速率構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 2 Phylogenetic tree of Sox1, Sox9 and Sox11 genes from bighead carp and zebrafish using third-codon position substitution rates

3 討論

3.1 鳙Sox基因HMG盒序列克隆用于Sox基因家族進(jìn)化的研究

Sox基因家族成員最顯著特征是含有一個(gè)保守的HMG盒, 可以根據(jù)HMG盒序列進(jìn)行Sox基因的鑒定及其家族進(jìn)化的研究。利用SoxN和Sox9兩對(duì)簡(jiǎn)并引物對(duì)鳙基因組 DNA進(jìn)行擴(kuò)增, 為了保證測(cè)序結(jié)果的可信度, 本文鑒定出的每個(gè) Sox基因序列至少是兩個(gè)不同克隆測(cè)序結(jié)果。測(cè)得的序列經(jīng)blast比對(duì)分析, 我們共鑒定出15個(gè)鳙Sox基因, 分屬于SoxB、SoxC和SoxE。有趣的是, 歸屬于SoxB亞族的Sox19基因, 在哺乳動(dòng)物中不存在其同源基因[21],而在斑馬魚(yú)[22]和 紅鰭東方 鲀[23]等真骨魚(yú)中則存在其同源基因。Sox19基因在哺乳動(dòng)物基因組中的缺失可能是在進(jìn)化過(guò)程中, 哺乳動(dòng)物丟失了該基因,也可能是真骨魚(yú)類(lèi)通過(guò)基因復(fù)制逐漸由某一基因的復(fù)制子演化成Sox19基因。Koopman, et al.[23]認(rèn)為Sox19基因很可能是由Sox3基因的一個(gè)復(fù)制子進(jìn)化而來(lái), 圖1中Sox3和Sox19的進(jìn)化關(guān)系可能是這種觀點(diǎn)的一個(gè)佐證。鳙這些Sox基因的鑒定將有助于硬骨魚(yú)類(lèi)Sox基因家族的進(jìn)化研究。

3.2 Sox基因的復(fù)制及其復(fù)制時(shí)間

在魚(yú)類(lèi)基因組研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)基因復(fù)制是非常常見(jiàn)的現(xiàn)象, 但重復(fù)基因在不同的物種中有不同的命運(yùn), 主要包括選擇性丟失或協(xié)同進(jìn)化產(chǎn)生新的功能[24,25]。Blast同源性比較和進(jìn)化樹(shù)分析表明, Sox1、Sox4、Sox9和Sox14在鳙基因組中發(fā)生了基因復(fù)制。其中Sox1、Sox4和Sox9的復(fù)制并沒(méi)有改變其氨基酸序列, 說(shuō)明這3個(gè)Sox基因在進(jìn)化過(guò)程中受到很大的選擇壓力, 可能在鳙個(gè)體發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。如果在輻鰭魚(yú)進(jìn)化歷程中魚(yú)類(lèi)特異的全基因組復(fù)制事件存立的話, 那么這次事件一定發(fā)生在鳙和斑馬魚(yú)分化之前。然而, 關(guān)于魚(yú)類(lèi)特異性的Sox基因復(fù)制, 是全基因組復(fù)制還是Sox基因片段復(fù)制的結(jié)果, 迄今還沒(méi)有定論。本文的Sox基因復(fù)制時(shí)間估算結(jié)果表明, Sox1、Sox4和Sox11基因的復(fù)制時(shí)間確實(shí)發(fā)生在鳙和斑馬魚(yú)的分化之前(圖 2), 這也在一定程度上支持了“魚(yú)類(lèi)特異性的基因組復(fù)制”學(xué)說(shuō)[26]。

圖3 利用鳙、斑馬魚(yú)、紅鰭東方 鲀和海鱸Sox1a、Sox1b和Sox4基因數(shù)據(jù)集第3位密碼子堿基替換速率構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 3 Phylogenetic tree of concatenated dataset of Sox1a, Sox1b and Sox4 genes from bighead carp, zebrafish, fugu and sea bass using third-codon position substitution rates

3.3 鳙和斑馬魚(yú)的分化時(shí)間

鳙是鯉科魚(yú)類(lèi)進(jìn)化過(guò)程中新近形成的一個(gè)物種,對(duì)其Sox基因HMG盒進(jìn)行克隆和序列分析, 可為研究魚(yú)類(lèi)Sox基因進(jìn)化歷程提供較好的分子信息。陳宜瑜等[14]?通過(guò)對(duì)現(xiàn)有魚(yú)類(lèi)化石資料的觀察和鑒定認(rèn)為這些化石大都屬于原始的 鲃亞科和魚(yú)丹亞科, 且都出現(xiàn)在距今65百萬(wàn)年至距今26百萬(wàn)年的老第三紀(jì)。由于地質(zhì)的一系列變化帶來(lái)溫暖地帶向南退縮,生活在熱帶和亞熱帶的原始魚(yú)丹亞科不適應(yīng)氣候變化在北方幾近滅絕, 從而派生出適應(yīng)寒冷氣候的雅羅魚(yú)亞科魚(yú)類(lèi)成為鯉科魚(yú)類(lèi)重要的組成成分。隨著青藏高原急劇隆升, 形成了長(zhǎng)江中下游河流縱橫交錯(cuò)的復(fù)合生態(tài)系統(tǒng), 由適應(yīng)較冷氣候環(huán)境的原始雅羅魚(yú)亞科, 逐步派生出 鲌亞科和鰱亞科。綜上所述,鳙、草魚(yú)和斑馬魚(yú)在原始魚(yú)丹亞科中存在一個(gè)共同的祖先。本研究以Sox1a、Sox1b及Sox4基因?yàn)榉肿隅姌?biāo)記, 推測(cè)鳙(鯉形目, 鯉科, 鰱亞科, 鳙屬)與斑馬魚(yú)(鯉形目, 鯉科, 魚(yú)丹亞科, 魚(yú)丹屬)共同的祖先大約存在于63.7百萬(wàn)年前, 正好處于老第三紀(jì)的古新世(Paleocene)(距今65百萬(wàn)年至53百萬(wàn)年)。本文的這個(gè)推算結(jié)果與Zhong, et al.[10]研究草魚(yú)(鯉形目, 鯉科, 雅羅魚(yú)亞科, 草魚(yú)屬)和斑馬魚(yú)的分化時(shí)間(63百萬(wàn)年前左右)一致, 從而從基因進(jìn)化的角度證實(shí)了陳宜瑜等[14]對(duì)鯉科魚(yú)類(lèi)物種進(jìn)化的推斷。

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CLONING AND SEQUENCE EVOLUTION ANALYSIS OF SOX GENES IN BIGHEAD CARP (ARISTICHTHYS NOBILIS)

GUO Wen-Jie1,2, YU Xiao-Mu1and TONG Jin-Gou1
(1. Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

To amplify Sox genes from bighead carp genome, two pairs of degenerate primers (SoxN and Sox9) were designed for PCR amplification that were utilized for sequencing and analysis of sequence homology and phylogenetic relationships. The results showed that 15 distinct Sox genes encoding the HMG domains were identified in bighead carp, which were assigned to group B, C and E. According to their homology to orthologs of zebrafish, 15 Sox genes were designated as Sox1a, Sox1b, Sox2, Sox3, Sox4a, Sox4b, Sox9a, Sox9b, Sox10, Sox11b, Sox12, Sox14a, Sox14b, Sox19 and Sox21a, respectively. Phylogenetic tree of Sox1, Sox4 and Sox9 nucleotide sequences indicated that the duplication of these three Sox genes occurred before the divergence of bighead carp and zebrafish, and this observation supported the“fish-specific whole-genome duplication” theory. Using Sox1a, Sox1b and Sox4 as molecular clock markers in phylogenetic analysis, the estimation of the divergence time between bighead carp and zebrafish demonstrated that in original Danioninae, a common ancestor appeared approximately 63.7 million years ago for bighead carp and zebrafish, both of which belong to Cyprinidae. This study would provide important information for further studies of Sox gene replication and genome evolution in fish.

Aristichthys nobilis; Sox gene; Genome duplication; Phylogenetic tree; Divergenc time

Q781

A

1000-3207(2014)04-0664-05

10.7541/2014.94

2013-04-23;

2014-01-09

公益性(農(nóng)業(yè))行業(yè)科研項(xiàng)目(200903045); 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31272647)資助

郭穩(wěn)杰(1985—), 男, 湖北黃梅縣人; 博士研究生; 主要從事魚(yú)類(lèi)遺傳與基因組學(xué)研究。E-mail: chaliangle12@163. com

童金茍, E-mail: jgtong@ihb.ac.cn