范 啟何舜平

(1. 中國科學(xué)院水生生物研究所, 水生生物多樣性與保護重點實驗室, 武漢 430072; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

范 啟1,2何舜平1

(1. 中國科學(xué)院水生生物研究所, 水生生物多樣性與保護重點實驗室, 武漢 430072; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

魚類群體遺傳學(xué)研究主要集中在經(jīng)濟魚類或瀕危物種, 然而一些經(jīng)濟價值較低的物種的遺傳結(jié)構(gòu)卻甚少關(guān)注。因此, 研究選擇了經(jīng)濟價值較低的(Hemiculter leucisculus), 共計323尾個體分別來自13個長江流域及其附屬湖泊的自然群體。通過擴增線粒體DNA Cytb基因序列片段(1100 bp), 以探討種群遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性。遺傳多樣性分析呈現(xiàn)出高單倍型多樣性和高核苷酸多樣性的模式, 表明該種群在長江流域較為穩(wěn)定。另外, 基于線粒體細胞色素b基因的系統(tǒng)發(fā)育分析, 顯示有5個線粒體譜系(譜系A(chǔ)-F)組成。中性檢驗和核苷酸錯配分布分析均顯示譜系A(chǔ)、B、E、F曾經(jīng)歷過種群擴張, 并且呈現(xiàn)從上游向中游擴張的規(guī)律。譜系間較高且顯著的遺傳分化指數(shù)和顯著的系統(tǒng)進化關(guān)系, 均表明譜系 A-F之間存在明顯的遺傳分化,暗示長江流域可能至少存在4個不同線粒體DNA水平上的種。種群的遺傳結(jié)構(gòu)和多樣性可能受到了長江流域特定格局的影響。

; 遺傳結(jié)構(gòu); 細胞色素b基因; 遺傳多樣性; 長江流域

1 材料與方法

1.1 樣本鑒定與收集

1.2 DNA提取、擴增和測序

DNA提取的方法是, 取其左側(cè)偶鰭或者背側(cè)肌肉, 置于95%酒精中, 保存于4℃冰箱中備用。采用標(biāo)準(zhǔn)的酚-氯仿法提取基因組DNA。Cyt b基因擴增的通用引物序列: L14724 (5′-GACTTGAAAAA CCACCGTTG-3′), H15915 (5′-CTCCGATCTCCGGA TTACAAGAC-3′)。PCR反應(yīng)總體積為30 μL, 其中含60 ng基因組DNA, 10 ×緩沖液3 μL, dNTP(各2.5 mmol/L)1.5 μL, 正反向引物(10 mmol/L)各1.5 μL, Taq聚合酶1.5 U, 最后補足滅菌雙蒸水至終體積。PCR反應(yīng)條件為: 94℃預(yù)變性3min, 然后30個循環(huán)(包括94℃變性1min, 50℃退火1min, 72℃延伸1min),最后在72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性。PCR產(chǎn)物經(jīng)過純化, 送商業(yè)測序公司測序, 測序引物與PCR引物相同。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

在SeqMan Ⅱ 程序中手工校正DNA序列, 序列的多重比對在Clustal W軟件中進行。用MEGA4.0軟件計算樣品之間的遺傳距離。

用 MEGA5.0構(gòu)建所有序列的和單倍型的鄰接樹(NJ)。 選擇翹嘴 鲌(Culter alburnus)作為外類群。

單倍型之間的進化關(guān)系采用系統(tǒng)發(fā)育網(wǎng)絡(luò)分析,在network4.611軟件中完成。用dnasp5.10.0.1軟件統(tǒng)計群體單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(π); 并用 ARLEQUIN3.0軟件包中的 AMOVA方法(Analysis of molecular variance)估計可能的群體遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳變異的地理分布。AMOVA根據(jù)單倍型的頻率及單倍型序列之間的差異, 來檢驗不同等級水平(地理群體、組內(nèi)不同地理群體之間、不同組間)的遺傳結(jié)構(gòu)在變異參數(shù)上是否存在顯著差異。其中, 使組間差異(Fct值為衡量標(biāo)準(zhǔn))達到最大的劃分方式是群體遺傳變異最為合理的分布格局。本研究將323個樣本分別按地理分布、系統(tǒng)樹識別的進化譜系劃分為不同的組, 用于估計群體結(jié)構(gòu)及遺傳變異的地理分布。利用ARLEQUIN 3.0軟件包中的蒙特爾測驗(Mantel test)(1000置換)進行IBD (Isolation by distance), 估計地理距離矩陣與遺傳分化矩陣的相關(guān)系數(shù), 地理距離可以大致通過取樣點的經(jīng)緯度坐標(biāo)(表1)來測定。

聯(lián)合使用Fu’Fs檢驗、Tajima’D中性檢驗和核苷酸不配對分布(Mismatch distribution)推斷群體是否發(fā)生擴張的歷史。一般地, 群體如果遵守嚴格分子鐘模式, 則可以用T群體的擴張時間(T = τ/2u)進行估算, τ是根據(jù)廣義非線性最小二乘法所估計的群體擴張參數(shù); u 依據(jù) u = 2×μ×k 計算, 其中 μ 是基因序列每一世代的突變率, k是分析序列的堿基數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 遺傳多樣性

對來自長江流域及其周圍湖泊的323尾個體的Cyt b序列進行排序較對后, 得到長為1110 bp的細胞色素b序列片段。GenBank登錄號為: KF020899-KF021222。

經(jīng)過分析, 研究的所有序列中, A、T、C、G四種堿基平均含量分別為28.0%、28.2%、28.4%、15.4%, A+T的含量為 56.2%, 明顯高于 G+C的含量43.8%。323條序列檢測到175個單倍型, 變異位點244個, 約占全序列的 21.98%, 其中單核苷酸變異位點56個, 簡約信息位點有188個。這244 個突變位點, 有18個為非同義突變, 226個為同義突變。突變方式檢驗結(jié)果顯示, 轉(zhuǎn)換位點(Ts)有 35個, 顛換位點(Tv)2個, 平均轉(zhuǎn)換和顛換比(Ts/Tv)為 19.50。323條Cyt b序列定義了175個單倍型。

遺傳多樣性分析結(jié)果如表1 所示, 所有樣本平均單倍型多樣性(h)為0.9789±0.0041, 核苷酸多樣性(π)為0.03289±0.00224。在所有獨立種群中, 嘉魚群體單倍型多樣性與核苷酸多樣性均為最高(1.000± 0.126、0.0618±0.0158), 合江群體則最低(0.400±0.237、0.0004±0.0002)。

2.2 群體遺傳分化

表1 長江中13個群體代碼、樣本量及遺傳多樣性Tab. 1 Codes, sample numbers and genetic diversity of 13 Hemiculter leucisculus populations in the Yangtze River

表1 長江中13個群體代碼、樣本量及遺傳多樣性Tab. 1 Codes, sample numbers and genetic diversity of 13 Hemiculter leucisculus populations in the Yangtze River

代號Code 緯度N 經(jīng)度E樣本量Sample numbers單倍型數(shù)目Number of haplotypes Hap (p.)單倍型多樣性Haplotype diversity HdWTQ N29.412535° E114.35471° 19 9(4) 0.889±0.046 HJ N28.813525° E114.35465° 5 2(1) 0.400±0.237 LZ N28.80843° E114.35468° 37 20(17) 0.940±0.021 MD N29.570359° E114.35470° 28 17(10) 0.913±0.043 ZG N30.25966° E114.35473° 35 32(30) 0.993±0.009 DT N30.549456° E114.35463° 29 22(15) 0.958±0.028 HH N29.779278° E114.35474° 26 17(8) 0.951±0.027 JY N30.082° E114.35467° 5 5(3) 1.000±0.126 JK N30.334796° E114.35466° 10 9(4) 0.978±0.054 DH N29.382175° E114.35464° 30 25(11) 0.982±0.016 LZH N30.087699° E114.35469° 41 30(17) 0.961±0.022 WX N29.840197° E114.35472° 31 25(11) 0.974±0.020 PYH N29.249467° E116.192951° 27 19(14) 0.957±0.026 all 323 175 0.9789±0.0041核苷酸多樣性Nucleotide diversity Pi多態(tài)位點數(shù)Numbers of polymorphism loci 0.00714±0.00049 27 0.00036±0.00021 1 0.01343±0.00294 62 0.02261±0.00135 62 0.01179±0.00472 151 0.00612±0.00052 41 0.00598±0.00037 31 0.06180±0.01583 121 0.00715±0.00089 22 0.000629±0.00032 41 0.00971±0.00158 62 0.00567±0.00066 44 0.00873±0.00261 73 0.03289±0.00224 244

表2 ?13個群體的遺傳距離(對角線下)和遺傳分化指數(shù)(Fst)(對角線上)Tab. 2 Pairwise genetic distances (below diagonal) and fixation index (above diagonal) among 13 populations of Hemiculter leucisculus from the middle and upper Yangtze River drainage

表3 利用Arlequin 軟件計算的13個地理群體間基因流Nm值Tab.3 Nmvalues among 13 populations of Hemiculter leucisculus analyzed by Arlequin3.0

表3 利用Arlequin 軟件計算的13個地理群體間基因流Nm值Tab.3 Nmvalues among 13 populations of Hemiculter leucisculus analyzed by Arlequin3.0

群體Population WTQ HJ LZ MD ZG DT HH JY JK DH LZH WX PYH WTQ —HJ 0.067 —LZ 0.074 –45.372 —MD 6.023 0.239 0.200 —ZG 0.072 37.174 –187.969 0.200 —DT 1.589 0.945 0.684 2.587 0.695 —HH 0.061 0.064 0.055 0.079 0.055 0.109 —JY 0.112 5.057 6.274 0.248 21.368 0.919 0.064 —JK 0.360 0.412 0.212 0.241 0.213 0.482 0.772 0.266 —DH 0.068 4.558 9.159 0.194 505.051 0.673 0.053 –290.697 0.199 —LZH 0.068 53.475 –33.400 0.200 –35.997 0.698 0.055 10.091 0.222 25.038 —WX 0.124 14.814 13.089 0.232 31.606 0.771 0.064 17.966 0.239 24.213 24.331 —PYH 0.082 3.843 3.496 0.231 2.757 0.833 0.061 2.655 0.282 1.969 2.909 3.280 —

表4 六個譜系個體來源數(shù)目統(tǒng)計Tab. 4 Statistics of the individuals according to the sources for the 6 lineages

表5群體分子變異分析結(jié)果Tab. 5 Analysis of molecular variance (AMOVA) for the Hemiculter leucisculus populations

表5群體分子變異分析結(jié)果Tab. 5 Analysis of molecular variance (AMOVA) for the Hemiculter leucisculus populations

分組Groups θSTθCTθsc組間% Among groups湖泊/非湖泊Lake/Non-lake 0.72328 0.14672 0.67569 14.67上下游Upstrem/Downstream 0.74581 0.29695 0.63844 29.7線粒體DNA譜系mtDNA lineage 0.92258 0.56818 0.92258 56.82群體Population 0.70370 — — 70.37種群內(nèi)% Within populations P 27.67 0.07527 25.42 0.00587 7.74 0.25220 29.63 0.00000

以翹嘴 鲌(Culter alburnus)為外類群, 采用 NJ法構(gòu)建了單倍型關(guān)系樹(圖1), 顯示了175個單倍型之間的相互關(guān)系。H3、H50、H72、H101、H98、H135、H146為主要的單倍型, 具有較大的頻率或處在網(wǎng)絡(luò)中的輻射中心。多個單倍型通過短枝與之相連, 表明近期突變形成的單倍型。單倍型進化網(wǎng)絡(luò)圖(圖2)與單倍型系統(tǒng)樹的拓撲結(jié)構(gòu)大體相一致, 形成了5個明顯的譜系。各類群都含有自己特有的單倍型。其中單倍型H3、H45、H50、H40、H22、H45、H98、H135被多個群體共享, 其中出現(xiàn)頻率最高的是單倍型(H3), 被38 個體, 11個群體共享。

圖 1 基于細胞色素b基因序列片段的鄰接樹Fig. 1 Phylogenetic relationships of all individuals based on the NJ tree analysis of the Cyt b gene fragment

圖2單倍型中值連接網(wǎng)絡(luò)分析圖Fig. 2 The geographical distribution of 175 haplotypes of Hemiculter leucisculus analyzed by median-joining network using NETWORK 4.6

表 6 六個譜系間的遺傳距離(對角線上)和遺傳分化指數(shù)(Fst) (對角線下)Tab.6 6 pairwise genetic distances (below diagonal) and fixation index (above diagonal) among 6 lineages of Hemiculter leucisculus from the middle and upper Yangtze River drainage

2.3 種群擴張

用 Fu’Fs法對所有樣品進行中性檢驗, 結(jié)果未顯示顯著負值, 說明群體歷史上沒有明顯擴張。但是, 根據(jù)圖1顯示的5個譜系分別進行中性檢驗,其中4個(A、B、E、F)的Fu’Fs出現(xiàn)顯著負值。采用堿基錯配分布分析, A、B、E、F這4個譜系呈明顯單峰。暗示這4個譜系的群體在歷史上發(fā)生過種群擴張[5]。以硬骨魚類Cyt b 突變速率0.65%[6,7]為基準(zhǔn), 按世代為2年, 計算出這4個譜系的群體擴張時間(圖3)。

3 討論

遺傳多樣性、生物多樣性和生態(tài)系統(tǒng)多樣性是多樣性三個層次的概括, 其中遺傳多樣性是物種多樣性和生態(tài)系統(tǒng)多樣性的基礎(chǔ), 也是生物多樣性的核心組成部分。遺傳多樣性是指生物種內(nèi)的遺傳變異度, 是生物適應(yīng)環(huán)境與進化的基石[8]。單倍型多樣性指數(shù)(h)、核苷酸多樣性指數(shù)(π)值是衡量一個物種群體多樣性的兩個非常重要的指標(biāo)[9]。

圖 3 四個譜系錯配分布圖呈現(xiàn)單峰及Fu’Fs檢驗結(jié)果、種群擴張時間實線顯示的是期望值(虛線顯示的是觀測值)Fig. 3 Mismatch distributions of Hemiculter leucisculus mtDNA lineages with unimodal distributions (A, B, E and F) (Solid lines show the simulated values and dash lines show the observed values)

13個種群AMOVA分析顯示, 大多數(shù)上游群體間以及上游群體與中游群體間的分化系數(shù)均大于0.25, 各群體之間缺乏明顯的基因交流, 表明種群間的遺傳分化很大[14]。僅大多數(shù)中游類群間遺傳分化系數(shù)小于 0.05, 表明分化程度較低。上游群體的凈遺傳距離明顯比中游群體的凈遺傳距離大。中游群體間凈遺傳距離小于 0.00899, 推測歷史上存在長江中游的湖泊與長江的連通, 或者湖泊之間以前存在流通, 導(dǎo)致長江中游的群體間存在較高水平的基因交流, 從而顯現(xiàn)單倍型比較豐富, 遺傳距離較小的現(xiàn)象, 這也可能與全新世以來, 長江中下游頻繁發(fā)洪水泛濫, 長江兩岸湖沼發(fā)育, 導(dǎo)致種群之間的交流機會增多。

基于NJ樹和單倍型網(wǎng)絡(luò), 可以將323個體分為6個大的譜系, 譜系A(chǔ)、B、E、F用Fu’Fs中性檢驗顯著偏離中性突變, 被認為群體在歷史上有擴張的跡象[15]。用323 個個體按譜系分組, 分別對A、B, C、D、E、F作錯配分布圖(圖3) , 除了譜系C、D, 譜系 A、B、E、F均呈單峰分布, 表明群體存在近期擴張[10]。譜系E的擴張時間, 大致和三峽形成貫通的時間吻合(70萬—100萬年前)[16,17], 暗示合江瀘州木洞群體擴張與三峽形成這一歷史地理事件有關(guān)。譜系A(chǔ)的擴張時間, 這一時期剛好處在第四紀冰期的廬山亞冰期(20萬—23萬年前)與大理亞冰期(1萬—11萬年前)之間的間冰期[16,17], 間冰期相對于冰期而言, 氣候相對溫暖, 總體上, 冰期間冰期溫度相差約12℃[18]。不僅有利于物種生存, 也有助于物種從冰期的“避難所”向外擴散, 為發(fā)展不同的種群儲備; 逐步建立起來的種群在隨后的進化過程中逐漸產(chǎn)生不同的周單倍型, 形成現(xiàn)今的遺傳結(jié)構(gòu)模式。譜系B擴張可能是導(dǎo)致群體單倍型多樣度高而核苷酸多樣度低的重要原因。另外, 譜系 E主要是包括瀘州群體和木洞群體, 譜系 F主要是秭歸群體, 而譜系 A主要是長江中游及毗鄰湖泊群體, 譜系B主要是中游群體和少量五通橋個體, 主要由瀘州及木洞群體組成的譜系 E最先擴張, 而后是秭歸群體組成的譜系F擴張, 然后是譜系B, 再就是譜系A(chǔ)擴張, 呈現(xiàn)出由上游群體向中游擴散的規(guī)律。在單倍型網(wǎng)絡(luò)圖中, 五通橋群體的單倍型也是處在網(wǎng)絡(luò)的中心位置, 但是祖先單倍型缺失。推測長江流域的古老單倍型應(yīng)該在長江上游附近, 也支持可能從上游向中游擴張。

從圖1的拓撲結(jié)構(gòu)、群體間的和譜系間的遺傳距離和遺傳分化指數(shù)(表 2,6)來看, 長江中上游mtDNA譜系產(chǎn)生了明顯的遺傳結(jié)構(gòu)分化, 較高的Fst表明譜系間的遺傳分化程度很高[19]。另外, 根據(jù)一些關(guān)于中國鯉形目魚類的研究, 發(fā)現(xiàn)廣布種可能不是一個單系類群[20]。整體的遺傳距離達到3.531%,暗示條可能存在物種分化, 當(dāng)前的物種數(shù)目很可能被低估, 如長江流域的寬鰭、馬口魚均存在隱存種[21,22]。的遺傳結(jié)構(gòu)和地理分隔值得更進一步地研究, 可能還有更多的譜系更多物種存在。根據(jù)目前的研究可能存在4個不同的種。從圖3來看, E譜系主要是合江、瀘州、木洞群體為代表, F譜系主要是秭歸群體為代表, 譜系 A、B譜系主要是長江中游群體, 且互相摻雜, 相似的遺傳分隔與共同的歷史因素有關(guān), 如河流形成。在長江中游, 獨特地理湖泊格局暗示, 湖泊分布格局可能重塑(Reshape)種內(nèi)的關(guān)系相近的群體遺傳結(jié)構(gòu), 并反映出不同的假想的時間框架。另外, 長江中游和上游分化明顯, 也可能是與上中游的差異有關(guān), 因為長江上游和中游曾經(jīng)是兩條獨立的河流[23]。為了進一步證實以上觀點, 需要更多的樣本量, 另外增加采樣點予以補充。另外,群體食性和繁殖能力強, 能很好地適應(yīng)長江流域復(fù)雜生境, 呈現(xiàn)復(fù)雜遺傳多樣性和結(jié)構(gòu),更多的詳細機理還有待進一步地研究。

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THE PATTERN OF UPPER AND MIDDLE YANGTZE DRAINAGES SHAPES THE GENETIC STRUCTURE AND DIVERSITY OF HEMICULTER LEUCISCULUS REVEALED BY MITOCHONDRIAL DNA LOCUS

FAN Qi1,2and HE Shun-Ping1
(1. The Key Laboratory of Aquatic Biodiversity and Conservation of Chinese Academy of Science, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Fish population genetics have mainly focused on economic fish or endangered species, while the knowledge on genetic structure of the fish with low economic value is limited. In the present study, we collected a total of 323 sharpbelly (Hemiculter leucisculus) individuals from 13 populations in Yangtze River Basin and the affiliated lakes to evaluate their genetic diversity and population structure by amplifying the mitochondrial DNA Cyt b gene fragments (1100 bp). Genetic diversity analysis showed the pattern of high haplotype diversity and high nucleotide diversity, suggesting that the populations in the Yangtze River Basin were fairly stable. In addition, based on mitochondrial cytochrome b gene phylogenetic analysis, there were five mitochondrial lineages (lineage A-F). The neutral test of Fu’Fs and mismatch distributions with negative Tajima’s D values indicated that the lineage A, B, E, and F underwent population expansion, and the expansion was from the upper section to the middle section of the Yangtze drainage. Fstand phylogenetic analysis and the significant divergence among lineages A-F implied that there are at least four different species on the level of mitochondrial DNA in the Yangtze River Basin. The population genetic structure and diversity of Hemiculter leucisculus may reflect the distribution pattern in Yangtze River Basin.

Hemiculter leucisculus; Genetic structure; Cyt b; Genetic diversity; Yangtze drainage

Q346+.5

A

1000-3207(2014)04-0627-9

10.7541/2014.89

2013-05-08;

2013-12-01

重大基金項目(Y11321-1-101)資助

范啟(1986— ), 男, 湖北浠水人; 碩士研究生; 主要從事種群遺傳研究。E-mail: fanqi0.618@163.com

何舜平, E-mail: clad@ihb.ac.cn