李乃順 冷向軍 李小勤 劉 波 柴仙琦 李忠銘 鄭小淼

(上海海洋大學(xué), 農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201306)

綠原酸對(duì)草魚魚種生長、非特異性免疫和肉質(zhì)的影響

李乃順 冷向軍 李小勤 劉 波 柴仙琦 李忠銘 鄭小淼

(上海海洋大學(xué), 農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201306)

為考察綠原酸對(duì)草魚魚種生長、非特異性免疫指標(biāo)和肌肉品質(zhì)的影響, 在基礎(chǔ)飼料中分別添加0.00%(對(duì)照組)、0.01%、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%綠原酸, 飼養(yǎng)平均體重(3.19±0.03) g的草魚魚種。經(jīng)60d飼養(yǎng), 各組草魚增重率分別為 283.1%、305.7%、307.3%、329.6%、308.3%、303.0%, 飼料系數(shù)分別為1.45、1.33、1.33、1.26、1.30、1.36; 與對(duì)照組相比, 添加0.04%綠原酸顯著提高草魚魚種增重率, 降低了飼料系數(shù)(P＜0.05), 添加 0.01%、0.02%、0.06%綠原酸有提高草魚魚種增重率的趨勢(shì); 在飼料中添加 0.04%綠原酸可顯著提高肝胰臟 SOD活性(P＜0.05), 添加 0.08%綠原酸可顯著降低血漿天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性(P＜0.05), 各組肝胰臟溶菌酶、血漿堿性磷酸酶和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性無顯著差異(P＞0.05)。對(duì)肌肉成分的分析表明, 各組水分、粗脂肪含量無顯著差異(P＞0.05), 但添加 0.04%綠原酸可顯著提高肌肉粗蛋白、纈氨酸、異亮氨酸、組氨酸、必需氨基酸和總氨基酸含量(P＜0.05)。添加0.02%綠原酸可顯著提高肌肉羥脯氨酸、膠原蛋白含量(P＜0.05)。綜上所述, 適量綠原酸能改善草魚魚種生長性能、非特異性免疫功能和肌肉品質(zhì)。草魚魚種飼料中綠原酸添加量推薦為0.04%。

草魚魚種; 綠原酸; 生長; 非特異性免疫; 肉質(zhì)

杜仲(Eucommia ulmoides Olive)屬杜仲科、杜仲屬, 為一種名貴中藥材。杜仲作為天然植物, 具有多功能性、無藥殘、無耐藥性等優(yōu)點(diǎn)。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為, 杜仲具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、降血壓等功效, 用于肝腎不足, 頭暈?zāi)垦? 腰膝酸痛, 筋骨瘺軟等[1]。目前, 有關(guān)杜仲在動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用已見于豬[2,3]、雞[4—6]、草魚[7,8]、鯉[9,10]等, 這些研究表明, 杜仲可改善動(dòng)物的生長性能、肌肉品質(zhì)和免疫功能, 這些作用效果與其活性成分綠原酸、桃葉珊瑚甙、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖甙等有關(guān)[3,7,11,12]。

綠原酸是一類多酚化合物, 具有抗氧化[13]、抗糖尿病[14]、抗高血糖[15]、抗應(yīng)激[16]、抗病毒[17,18]等作用。目前, 綠原酸已被應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)[18—20], 而在動(dòng)物養(yǎng)殖方面的研究很少。在中華鱉[21]和建鯉[22]的研究表明綠原酸能提高動(dòng)物生長性能、改善肉質(zhì), 增強(qiáng)非特異性免疫和抗氧化能力。綠原酸在其他水產(chǎn)動(dòng)物方面的研究尚未見報(bào)道。

草魚(Ctenopharyngodon idellus)是我國最為重要的養(yǎng)殖魚類之一。本次研究以草魚魚種為實(shí)驗(yàn)對(duì)象, 在飼料中添加不同劑量綠原酸, 考察對(duì)草魚魚種生長、非特異性免疫相關(guān)指標(biāo)和肌肉品質(zhì)的影響,為中草藥提取物在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)飼料

在基礎(chǔ)飼料中分別添加0.00%(對(duì)照組)、0.01%、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%綠原酸, 共6個(gè)處理組, 每組設(shè)3個(gè)平行。飼料配制時(shí), 所添加的綠原酸以等量減少麥麩用量保持配方平衡。飼料以顆粒機(jī)(浙江新昌城關(guān)陳氏機(jī)械廠KL系列105A-4-2型)制成粒徑2 mm沉性顆粒?；A(chǔ)飼料組成及成分分析見表1。綠原酸購于成都康邦生物科技有限公司, 含量≥98%。

表1 基礎(chǔ)飼料配方組成及營養(yǎng)成分含量Tab.1 Ingredient and nutritional composition of basal diet

1.2 實(shí)驗(yàn)用魚

實(shí)驗(yàn)用草魚魚種平均體重(3.19±0.03) g, 體質(zhì)健壯, 規(guī)格整齊, 購于上海市根敏水產(chǎn)專業(yè)合作社。

1.3 飼養(yǎng)管理

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)在上海海洋大學(xué)南匯水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行。在正式實(shí)驗(yàn)前, 草魚魚種放入暫養(yǎng)池馴化一周以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)飼料及環(huán)境, 選取 810尾草魚魚種移入18個(gè)網(wǎng)箱(2 m×1.2 m×1 m), 網(wǎng)箱置于水泥池(5.0 m ×3.0 m×1.2 m) 中, 每網(wǎng)箱 45尾。每天按體重3%—5%分3次(8:00、12:00、16:00)投喂, 根據(jù)水溫、攝食情況進(jìn)行調(diào)整, 各網(wǎng)箱保持基本一致的投飼量。飼養(yǎng)時(shí)間為2012年8月23日—10月21日, 為期 60d。飼養(yǎng)期間水溫(22—30)℃, DO＞5 mg/L、NH3-N＜0.3 mg/L。

1.4 測(cè)定指標(biāo)與方法

生長性能和形體指標(biāo) 于養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)開始及結(jié)束時(shí)稱量各組實(shí)驗(yàn)魚的體重, 稱量前魚體饑餓24h。計(jì)算相對(duì)增重率、飼料系數(shù)和成活率等; 隨機(jī)取魚6尾, 測(cè)其體重、體長、內(nèi)臟重、肝臟重, 計(jì)算肝體比、臟體比、肥滿度等形體指標(biāo)。

相對(duì)增重率(%)=(末重–初重)(g)/初重(g)×100

飼料系數(shù)(FCR)=攝食量(g)/魚體增重量(g)

成活率(%)=實(shí)驗(yàn)?zāi)~尾數(shù)/實(shí)驗(yàn)初魚尾數(shù)×100

肝體比=肝臟重量(g)/體重(g)

臟體比=內(nèi)臟重量(g)/體重(g)

肥滿度(K)=魚體重(g)/魚體長3(cm3)

血漿和肝胰臟生化指標(biāo) 在飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,每網(wǎng)箱取魚6尾, 以尾靜脈處采血(1%肝素鈉抗凝), 6000 r/min離心 10min, 取上清液于–20℃凍存, 測(cè)定堿性磷酸酶(ALP)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)活性。ALP、AST、ALT活性測(cè)定分別采用AMP緩沖液法、紫外-蘋果酸脫氫酶法、紫外-乳酸脫氫酶法(測(cè)試盒均購自邁瑞公司), 于邁瑞B(yǎng)S-200全自動(dòng)生化分析儀上完成。

在飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后, 每網(wǎng)箱取魚 6尾, 分別取其肝臟并剪碎, 加入預(yù)冷的生理鹽水進(jìn)行勻漿(3—4min), 4℃下離心10min(6000 r/min), 取上清液在–20℃下凍存, 測(cè)定溶菌酶(LSZ)、超氧化物歧化酶(SOD)活力。LSZ測(cè)定采用比濁法; SOD活力測(cè)定采用黃嘌呤氧化酶法(測(cè)試盒均購自南京建成生物技術(shù)研究所)。比活力單位用每mg蛋白樣品所含的酶量, 即U/mg蛋白質(zhì)表示。

肌肉成分分析 在飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后, 每池隨機(jī)取魚 15尾, 取背部肌肉–20℃凍存?zhèn)錅y(cè)。水分測(cè)定采用 105℃烘干法, 粗蛋白測(cè)定采用凱氏定氮法,粗脂肪測(cè)定采用氯仿甲醇法, 膠原蛋白由羥脯氨酸乘以換算系數(shù)11.1而來[23], 羥脯氨酸測(cè)定采用堿水解法(測(cè)試盒均購自南京建成生物技術(shù)研究所), 其原理為羥脯氨酸在氧化劑的作用下所產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物與二甲氨基苯甲醛作用呈現(xiàn)紫紅色, 根據(jù)呈色深淺可測(cè)算其含量。

在測(cè)定肌肉常規(guī)成分后, 將每網(wǎng)箱15尾肌肉合并為一個(gè)樣本(每處理3個(gè)樣本), 以6 mol/L鹽酸水解, 用Sykam433D氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定肌肉氨基酸組成。

1.5 數(shù)據(jù)分析與處理

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析, 差異顯著者進(jìn)行LSD多重比較, P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)草魚魚種生長性能和形體指標(biāo)的影響

經(jīng)過 60d飼養(yǎng), 飼料中添加綠原酸對(duì)草魚魚種生長性能的影響見表 2。在飼料中添加 0.01%—0.08%綠原酸后, 均在不同程度上提高了魚體增重率, 降低了飼料系數(shù)。其中添加0.04%綠原酸組草魚魚種增重率較對(duì)照組提高16.4%(P＜0.05), 飼料系數(shù)降低13.1%(P＜0.05)。與對(duì)照組相比, 添加0.01%、0.02%、0.06%綠原酸也顯著降低了飼料系數(shù)(P＜0.05), 并有提高增重率的趨勢(shì)(P＞0.05)。由表 3可見, 各處理組在肥滿度、肝體比、臟體比之間無顯著差異(P＞0.05)。

2.2 對(duì)草魚魚種血漿生化指標(biāo)的影響

在飼料中添加綠原酸對(duì)草魚魚種血漿 AST、ALT、ALP活性的影響見表 4。在 AST活性方面, 0.08%綠原酸組 AST活性顯著低于對(duì)照組(P＜0.05),其余各組和對(duì)照組之間無顯著差異(P＞0.05); 各處理組在 ALT活性方面無顯著差異(P＞0.05); 添加0.01%—0.08%綠原酸, 在數(shù)值上增加了 ALP活性,其中0.04%組最高, 但無顯著性差異(P＞0.05)。

2.3 對(duì)草魚魚種肝胰臟SOD、溶菌酶活力的影響

表2 綠原酸對(duì)草魚魚種生長性能的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)Tab. 2 Effects of chlorogenic acid on growth performances of juvenile grass carp (means±SD)

表3 綠原酸對(duì)草魚魚種形體指標(biāo)和內(nèi)臟指數(shù)的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)Tab. 3 Effects of chlorogenic acid on physical indicator and visceral index of juvenile grass carp (means±SD)

對(duì)于肝胰臟非特異性免疫指標(biāo)的測(cè)定表明(表5), 飼料中添加0.04%綠原酸可顯著提高SOD活性(P＜0.05), 各處理組溶菌酶活性無顯著差異(P＞0.05)。

表4 綠原酸對(duì)草魚魚種血漿生化指標(biāo)的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)Tab. 4 Effects of chlorogenic acid on plasma biochemical indicator of juvenile grass carp (means±SD)

表5 綠原酸對(duì)草魚魚種肝胰臟SOD、溶菌酶活力影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)Tab. 5 Effects of chlorogenic acid on hepato-pancreas SOD, LSZ activities of juvenile grass carp (means±SD)

2.4 對(duì)草魚魚種肌肉成分的影響

由表 6可見, 隨著配方中綠原酸的增加, 草魚魚種肌肉粗蛋白、膠原蛋白含量呈先升高后降低趨勢(shì)。其中 0.04%綠原酸組的肌肉粗蛋白顯著高于對(duì)照組(P＜0.05), 0.02%綠原酸組的肌肉膠原蛋白顯著高于對(duì)照組(P＜0.05); 各處理組在肌肉水分、粗脂肪含量間無顯著差異(P＞0.05)。

2.5 對(duì)草魚魚種肌肉氨基酸組成的影響

對(duì)肌肉氨基酸的測(cè)定表明(表7), 添加0.01%綠原酸可顯著增加肌肉纈氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、賴氨酸含量(P＜0.05); 添加0.02%綠原酸可顯著增加肌肉纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、賴氨酸、丙氨酸、精氨酸含量(P＜0.05), 較對(duì)照組提高鮮味氨基酸含量19.6%(P＜0.05); 添加0.04%、0.06%和0.08%綠原酸組可顯著增加纈氨酸、異亮氨酸、組氨酸含量; 添加0.02%、0.04%和0.06%綠原酸組均可顯著增加肌肉氨基酸總量和必需氨基酸含量(P＜0.05)。

3 討論

表6 綠原酸對(duì)草魚魚種肌肉組成的影響(鮮重) (平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)Tab. 6 Effects of chlorogenic acid on muscle composition of juvenile grass carp (fresh tissue) (means±SD)

3.1 綠原酸對(duì)草魚魚種生長的影響

目前, 杜仲應(yīng)用于動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)的報(bào)道已見于豬[2,3]、雞[4—6]、草魚[7,8]、鯉[9,10]等, 但關(guān)于其主要活性成分綠原酸在動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)中的研究則很少。在飼料中添加200 mg/kg綠原酸, 可顯著提高中華鱉增重率[21], 也提高了建鯉增重率38.2%[22]。在本實(shí)驗(yàn)中,草魚魚種攝食含 0.04%綠原酸飼料后, 其增重率較對(duì)照組提高 16.4%, 飼料系數(shù)降低 13.1%(P＜0.05),但高劑量的綠原酸(0.08%)添加并沒有進(jìn)一步促進(jìn)草魚魚種的生長, 這在中華鱉[21]、建鯉[22]的研究中也有類似報(bào)道。這些結(jié)果表明, 適宜添加量的綠原酸對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的生長性能有改善作用, 其作用機(jī)理可能與綠原酸具有廣譜抗菌性[11,21,25,26], 具有抗氧化、清除自由基作用[27,28]有關(guān), 從而改善了機(jī)體健康功能, 提高動(dòng)物生長性能。此外, 在養(yǎng)殖過程中發(fā)現(xiàn), 攝食含綠原酸飼料的草魚魚種, 食欲旺盛, 搶食積極主動(dòng)。

表7 綠原酸對(duì)草魚魚種肌肉氨基酸組成的影響(脫脂DM g/100g) (平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)Tab. 7 Effects of chlorogenic acid on muscle amino acids of juvenile grass carp (DM g/100g) (means±SD)

3.2 綠原酸對(duì)草魚魚種免疫功能的影響

研究表明, 綠原酸具有抗氧化[29,30]、抗菌[31]、增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫[32]等功效。在魚類中, SOD、溶菌酶等是反映機(jī)體非特異性免疫功能較為重要的指標(biāo)[33]。建鯉的實(shí)驗(yàn)表明, 在飼料中添加(200—400) mg/kg綠原酸能顯著提高血漿溶菌酶、SOD活性, 增強(qiáng)抗氧化能力[22]; 在飼料中添加200和400 mg/kg綠原酸均能顯著增強(qiáng)中華鱉血漿 SOD 活性(P＜0.05)[21];異育銀鯽的研究表明, 在飼料中添加 400 mg/kg綠原酸并長時(shí)間(30d)飼喂時(shí), 會(huì)抑制血清堿性磷酸酶(ALP)活性[34]; 在草魚的實(shí)驗(yàn)中, 0.04%、0.08%綠原酸對(duì)血清溶菌酶活性無顯著影響(P＞0.05)[35]。本實(shí)驗(yàn)在飼料中添加 0.04%綠原酸顯著提高了草魚魚種肝胰臟SOD活性, 但添加0.08%綠原酸, 則顯著降低了血漿 AST活性(P＜0.05), 各綠原酸添加組對(duì)肝胰臟溶菌酶活性無顯著影響。這表明, 適宜添加量的綠原酸會(huì)對(duì)某些機(jī)體免疫指標(biāo)和抗氧化指標(biāo)產(chǎn)生影響, 但過高量的添加, 會(huì)帶來負(fù)面作用, 這可能和高濃度綠原酸對(duì)魚體產(chǎn)生一定的毒副作用有關(guān),相關(guān)機(jī)理尚需進(jìn)一步研究。

綠原酸的抗氧化功能與其多酚結(jié)構(gòu)有關(guān)。在小鼠抗氧化實(shí)驗(yàn)中, 綠原酸是羥基自由基清除劑, 也是過氧自由基清除劑, 其可能的抗氧化機(jī)制和兒茶酚類似, 即作為過氧自由基接受氫原子供體, 終止鏈自由基反應(yīng)[36]。

3.3 綠原酸對(duì)草魚魚種肌肉成分和品質(zhì)的影響

杜仲及其提取物已被證明具有提高雞[5]、草魚[7]、鯉[9]、鰻[37]、異育銀鯽[12,38]等肌肉蛋白和(或)機(jī)體膠原蛋白含量的作用, 而膠原蛋白是反映肌肉品質(zhì)的重要指標(biāo); 此外, 在飼料中添加杜仲葉粉還顯著提高了草魚[7]、鯉[9]肌肉呈味氨基酸、總氨基酸及必需氨基酸含量(P＜0.05)。杜仲改善肉質(zhì)的作用可能與其活性成分京尼平甙、桃葉珊瑚甙、綠原酸等有關(guān)。已有研究表明了京尼平甙和桃葉珊瑚甙二者可促進(jìn)大鼠的膠原合成和表皮細(xì)胞增殖[39], 但在這方面關(guān)于綠原酸的研究很少。中華鱉的研究表明, 在飼料中添加200、400 mg/kg綠原酸, 可顯著提高裙邊和肌肉膠原蛋白含量, 其中 400 mg/kg綠原酸組的肌肉粗蛋白含量也較對(duì)照組顯著提高(P＜0.05)[21]。本實(shí)驗(yàn)在飼料中添加 0.02%和 0.04%綠原酸, 顯著增加了草魚魚種肌肉氨基酸總量和必需氨基酸含量,分別提高了肌肉膠原蛋白含量和粗蛋白含量(P＜0.05)。但綠原酸提高肌肉蛋白含量和膠原蛋白含量的機(jī)理是什么, 在杜仲的活性成分京尼平甙、桃葉珊瑚甙、綠原酸中, 各自對(duì)肌肉品質(zhì)改善的貢獻(xiàn)有多少, 均有待于進(jìn)一步研究。

在本實(shí)驗(yàn)條件下, 在飼料中添加 0.04%綠原酸可顯著提高草魚魚種增重率, 降低飼料系數(shù), 提高肌肉粗蛋白含量、氨基酸含量和肝臟SOD活性; 草魚魚種飼料中綠原酸的添加量推薦為0.04%。

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THE EFFECTS OF CHLOROGENIC ACID ON THE GROWTH, NON-SPECIFIC IMMUNE INDEX AND THE MEAT QUALITY OF JUVENILE GRASS CARP (CTENOPHARYNGODON IDELLUS)

LI Nai-Shun, LENG Xiang-Jun, LI Xiao-Qin, LIU Bo, CHAI Xian-Qi, LI Zhong-Ming and ZHENG Xiao-Miao
(Key Laboratory of Freshwater Aquatic Genetic Resources, Ministry of Agriculture, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

To investigate the effects of chlorogenic acid on the growth, non-specific immune function and the meat quality of juvenile grass carp, the diets were improved with the addition of chlorogenic acid at the concentrations of 0.00% (control group), 0.01%, 0.02%, 0.04%, 0.06%, and 0.08%. Fish with an average weight of (3.19±0.03) g were selected and fed for 60 days. The results showed that the growth rate of the six diet groups were 283.1%, 305.7%, 307.3%, 329.6%, 308.3%, 303.0%, and the FCR was 1.45, 1.33, 1.33, 1.26, 1.30, and 1.36, respectively. The growth rate and FCR were significantly improved with the addition of 0.04% chlorogenic acid compared with the control group (P＜0.05). It was indicated that the growth yate was improved with the addition of chlorogenic acid at the concentrations of 0.01%, 0.02%, and 0.06%. SOD activities of hepato-pancreas increased significantly with 0.04% chlorogenic acid (P＜0.05), and plasma AST activities decreased significantly with 0.08% chlorogenic acid (P＜0.05). However, hepato-pancreas lysozyme, ALP and ALT of plasma activities were not affected by dietary chlorogenic acid (P＞0.05). In terms of the muscle composition and the meat quality, there were no significant differences in muscle moisture and crude lipid contents among different diet groups. The muscle protein, Val, Ile, His, essential amino acids and total amino acids significantly increased (P＜0.05) with the addition of 0.04% chlorogenic acid. Hydroxyproline and the collagen content of muscle increased (P＜0.05) with the addition of 0.02% chlorogenic acid. In conclusion, the results above showed that the growth, non-specific immunity ability and the meat quality of juvenile grass carp could be improved with the addition of chlorogenic acid in diets. Therefore, the recommended level of chlorogenic acid in juvenile grass carp diet should be 0.04%.

Juvenile grass carp; Chlorogenic acid; Growth; Non-special immunity; Meat quality

S963

A

1000-3207(2014)04-0619-08

10.7541/2014.88

2013-03-20;

2013-12-19

上海市農(nóng)委“科技興農(nóng)”重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目(2009-6-6); 上海市重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(Y1101) 資助

李乃順(1987—), 男, 浙江杭州人; 碩士; 主要研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物營養(yǎng)與飼料學(xué)。E-mail: linaishun@163.com

冷向軍(1972—), 男, 四川眉山人; 博士生導(dǎo)師; 主要研究方向?yàn)閯?dòng)物營養(yǎng)與飼料學(xué)、飼料加工工藝學(xué)、飼料與水產(chǎn)品安全等。E-mail: xjleng@shou.edu.cn