張煒 張玲 王綺 張虎 陳彥平

近年來的研究表明，腫瘤的發(fā)生發(fā)展是由癌基因和抑癌基因共同調控的。過氧化物增殖體激活物受體γ(peroxisome proliferator-activatived receptorsγ，PPARγ)是配體依賴性核激素受體超家族成員之一［1］。大量研究表明，不同部位、多種惡性腫瘤的PPARγ表達與相應的正常組織明顯不同［2］，并且已有PPARγ配體抗腫瘤的臨床試驗研究，這些研究主要集中在乳腺癌，卵巢癌，結腸癌等［3］。目前關于PPARγ在口腔涎腺腫瘤領域相關性的研究極少，與惡性腫瘤遠處轉移的探索也很少。本研究從mRNA和蛋白水平研究PPARγ在涎腺腺樣囊性癌SACC-83及SACC-LM細胞中的表達，探討PPARγ與涎腺腺樣囊性癌發(fā)生、發(fā)展的關系。

1 材料與方法

1.1 細胞株與細胞培養(yǎng) SACC-83及SACC-LM細胞系由北京大學口腔醫(yī)學院口腔外科實驗室提供。細胞加10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37℃，5%CO2飽和濕度的溫箱中培養(yǎng)。

1.2 藥物與試劑 Trizol試劑購自美國Invitrogen公司。逆轉錄試劑盒購自美國Promega公司。PPARγ的引物(上游:5’-ATGGCAATTGAATGTCGTGTC-3’，下游:5’-TCCGCCCAAACCTGATG-3’)及管家基因 gapdh(上游:5’-CATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3’，下游:5’-CGTCAAAGGTGGAGGAGTGG-3’)購自上海生物工程技術公司。

1.3 RT-PCR反應 PCR反應在Biometra熱循環(huán)儀中進行。PCR產(chǎn)物行210%瓊脂糖凝膠(含0.125 μg/ml EB)電泳鑒定，反映 PPARγ mRNA 在SACC-83和SACC-LM細胞系中的表達。

1.4 實時定量PCR(Quantitative Real-time PCR)方法于 PCR 管 中 加 入 10 ×Buffer 215 μl，dNTP(215 mmol/L)，上游引物和下游引物各 1 μl，Taq DNA聚合酶 0.15 μl，DNA 模板 1 μl，2 × Eva(熒光染料)1 125 μl，ddH2O 25 μl。反應條件:95℃ 預變性 15 s;56℃退火20 s，72℃延伸30 s，循環(huán)40次;對擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析特異性，以PPARγ與GAPDH相對濃度的比值來反映PPARγ表達量。以檢測肺高轉移性涎腺腺樣囊性癌(SACC-LM)及肺低轉移性涎腺腺樣囊性癌(SACC-83)細胞系中PPARγ蛋白表達和PPARγmRNA的表達水平。

2 結果

2.1 逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)結果 通過RT-PCR檢測在SACC-LM細胞中PPARγmRNA的表達水平高于SACC-83細胞。見圖1。

圖1 RT-PCR結果

2.2 實時定量(Quantitative Real-time)RT-PCR對RTPCR結果的驗證 為了對RT-PCR的結果進行進一步驗證，我們采用Quantitative Real-time RT-PCR的方法對同批RNA進行了檢測。實驗結果表明，QRT-PCR的結果與RT-PCR的結果一致。見表1。

表1 實時定量RT-PCR檢測結果

3 討論

腺樣囊性癌是發(fā)生在涎腺最常見的惡性腫瘤之一，也是頭頸部極易發(fā)生遠處轉移的惡性腫瘤，其遠處轉移率高達40%［4］。不少學者針對腺樣囊性癌的轉移做了大量的工作，但多為針對單一因素的探索，不能全面的反映腫瘤的轉移的真實情況。PPARγ作為目前研究最成熟的核激素受體，有上百種天然及人工合成配體，部分配體已經(jīng)應用于臨床［5］，腫瘤轉移的復雜性決定了轉移是一個多基因共同參與的復雜過程，PPARγ在涎腺腺樣囊性轉移細胞系中的表達為研究腫瘤轉移相關基因提供了條件。

近年來對于涎腺腺樣囊性癌的研究多集中于病理學和免疫組化的方法。而本實驗運用逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測腫瘤轉移細胞系，相比于病理學和免疫組化等方法有特異性高、靈敏度能夠達到對單個分子的檢測、準確性方面，盡管達不到100%的準確率，但卻在原有方法基礎上大大降低了假陽性率優(yōu)點。

本部分研究采用RT-PCR技術比較了SACC-LM中PPARγ基因及蛋白水平表達均明顯高于SACC-83。同時運用實時定量PCR(Quantitative Real-time RTPCR)技術進行驗證，SACC-LM細胞系與SACC-83細胞系中 PPAR-γmRNA 表達水平比值為 4.346939∶1。我們從不同方法的實驗證明，實驗的結果表現(xiàn)為同步一致性。說明PPARγ在SACC遠處轉移方面起著重要作用。

口腔頜面部惡性腫瘤中，腺樣囊性癌(ACC)極易發(fā)生遠處轉移。而轉移性和侵襲性是惡性腫瘤的重要特征［6］，腫瘤若失去轉移特性其惡性度將大大降低，對腫瘤轉移相關基因的研究是攻克腫瘤不可缺少的重要基礎工作之一。利用涎腺腺樣囊性癌低轉移細胞系(SACC-83)與高轉移細胞系(SACC-LM)，對SACC的轉移機制進行科學研究，探索核激素受體PPARγ與SACC轉移的關系，進一步豐富對SACC轉移的研究。

1 Issemann I，Green S.Activation of a Member of the Steroid-Hormone Receptor Superfamily by Peroxisome Proliferators.Nature，1990，347:645-650.

2 Wang TT，Xu J，Yu XF，et al.Peroxisome proliferator-activated receptor gamma in malignant diseases.Critical Reviews in Oncology Hematology，2006，58:1-14.

3 Han S，Roman J.Peroxisome proliferator-activated receptorγ:a novel target for cancer therapeutics?Anti-Cancer Drugs，2007，18:237-244.

4 Sung MW，Kim JW.Clinicopathologic predictorsand impact of distant metastasis from adenoid cystic cancinoma of the head and neck.Arch Otolarngol Head Neck Surg，2003，129:1193-1197.

5 Wei S，Yang J，Lee SL，et al.PPAR gamma-independent antitumor effects of thiazolidinediones.Cancer Letters，2009，276:119-124.

6 方偉崗.21世紀腫瘤侵襲轉移研究面臨的機遇和挑戰(zhàn).中華醫(yī)學雜志，2001，81:193-194.