吳秀蘭，賈 艷，朱 波，周 杰

(正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，江蘇 南京 210023)

1 紫杉醇介紹

紫杉醇(Paclitaxel，商品名Taxol) 被用于治療卵巢癌、乳腺癌、肺癌以及Kaposi’s 肉瘤的治療，同時(shí)也在研究與其他抗癌藥物聯(lián)用的治療方法，是獲得FDA批準(zhǔn)的第一個(gè)來自天然植物的化學(xué)藥物[1]。最初，紫杉醇是從短葉紫杉(Taxusbrevifolia)的樹皮中分離獲得，這種紫杉主要分布在北美西北太平洋區(qū)域從北加拿大到阿拉斯加的原生森林中。

短葉紫杉生長(zhǎng)極其緩慢且不易繁殖，一棵直徑22 cm、高度9 m的樹大約有125年樹齡，其樹皮極薄，只有大約0.3～0.6 cm厚，這樣的一棵樹可以得到大約2 kg樹皮。紫杉醇必須從新鮮砍伐剝?nèi)〉臉淦ぶ刑崛　目撤淠?，收集紫杉樹皮到分離萃取出紫杉醇，消耗極大的人力物力財(cái)力。30噸干樹皮可以得到大約100 g紫杉醇，花費(fèi)大約150萬(wàn)美元。因?yàn)樽仙即紭O難得到，所以在研究初期對(duì)紫杉醇的研究進(jìn)度也極其緩慢。因此從植物中提取紫杉醇代價(jià)太高，而且會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境造成破壞。迄今為止已經(jīng)探索出化學(xué)半合成法、化學(xué)全合成法、植物細(xì)胞培養(yǎng)或內(nèi)生菌培養(yǎng)等多種方法獲得紫杉醇[1-3]。

2 紫杉醇的理化性質(zhì)

紫杉醇為白色結(jié)晶性粉末，不溶于水，易溶于氯仿、丙酮等有機(jī)溶劑。紫杉醇(C47H51NO14)(圖1)基本骨架為三環(huán)二萜，具有高度官能團(tuán)化的6-8-6-4四環(huán)結(jié)構(gòu)和一個(gè)異絲氨酸側(cè)鏈[4]。紫杉醇具有11個(gè)手性中心，其合成方法往往被化學(xué)家們公認(rèn)為最具挑戰(zhàn)性的任務(wù)之一。

圖1 紫杉醇結(jié)構(gòu)式

3 紫杉醇的來源

3.1 從植物中提取

紫杉醇最早在1966年被提取出來，當(dāng)時(shí)主管北卡“研究三角學(xué)院”(research triangle institute，RTI)分餾實(shí)驗(yàn)室的化學(xué)家華爾(Monroe Wall)的研究小組采用400 根試管的逆流分配色譜法，從12 kg太平洋短葉紅豆杉樹皮中提取0.5 g紫杉醇，共歷時(shí)2年，這種工藝十分繁瑣，而且效率極低[5]。隨著研究的不斷深入，提取分離方法也在不斷改進(jìn)。目前比較成熟的方法為有機(jī)溶劑萃取法、固相萃取法和超臨界流體萃取法。有機(jī)溶劑主要采用乙醇、甲醇或甲醇和二氯甲烷混合溶劑提取，提取效率高，方法簡(jiǎn)單，能耗少。Mattina等人[6]利用Empore固相萃取盤對(duì)甲醇粗提物進(jìn)行提取，紫杉醇回收率為115.8%。近年來，超臨界流體技術(shù)也被應(yīng)用到紫杉醇的分離純化過程中。Jennings等人[7]發(fā)現(xiàn)以乙醇為修飾劑的超臨界CO2流體可以快速地從太平洋紅豆杉樹皮中提取出紫杉醇，收率較高。

3.2 化學(xué)全合成

由于紫杉醇具有復(fù)雜的手性中心，化學(xué)全合成方法的尋找成為了化學(xué)家們所面臨的一個(gè)挑戰(zhàn)。迄今為止已經(jīng)有6個(gè)比較成熟的全合成方法。1997年，美國(guó)斯坦福大學(xué)Wender教授領(lǐng)導(dǎo)的研究小組完成了紫杉醇的第4條合成路線。Wender以馬鞭烯酮為起始物，并采用直線法的合成戰(zhàn)略。馬鞭烯酮是大量存在于松樹中的蒎烯在空氣中的氧化產(chǎn)物，該化合物包括了紫杉醇20個(gè)骨架碳中的10個(gè)[8]。具體地說，包括了A環(huán)的6個(gè)骨架碳和B環(huán)關(guān)鍵的骨架碳。路線最顯著的特點(diǎn)在于通過分子內(nèi)的aldol反應(yīng)完成了C環(huán)的構(gòu)建，另外值得一提的是，Wender的路線是目前公開報(bào)道的較短的紫杉醇全合成路線。

1998年，日本的Kuwajima教授領(lǐng)導(dǎo)的研究小組公布了他們完成的紫杉醇合成路線。隨后2000年他們又發(fā)布了在原合成路線上進(jìn)行改進(jìn)的路線，Kuwajima小組[9,10]采用的是匯聚式合成策略，分別合成A環(huán)片段和C環(huán)片段，隨后，A環(huán)片段與C環(huán)片段連接構(gòu)建關(guān)鍵中間體，并在此基礎(chǔ)上完成環(huán)系上手性中心及官能團(tuán)的構(gòu)建，其中19位甲基立體選擇性引入以及C3位手性中心的構(gòu)建頗具特色。

同樣在1998年，日本東京大學(xué)的Mukaiyama教授領(lǐng)導(dǎo)的研究小組完成了一條采用直線-匯聚聯(lián)合策略的全合成路線，依次合成B環(huán)、BC環(huán)、ABC環(huán)、ABCD環(huán)[11]。路線中，通過不對(duì)稱的aldol反應(yīng)合成線性前體，再通過分子內(nèi)的aldol環(huán)合構(gòu)建八元環(huán)的反應(yīng)很有特點(diǎn)。

3.3 半合成

所謂半合成，就是從可以再生的植物枝葉中提取本身并無活性的紫衫烷二萜類成分，并以之作為前體半合成紫杉醇，這也是緩解紫杉醇供應(yīng)危機(jī)的可行手段之一。研究最多的是以巴卡亭III漿果赤霉素(baccatinIII)(圖2)和10-去乙?；涂ㄍII(10-脫乙?；鶟{果赤霉素III,10-deacetybaccatinIII)為原料，通過選擇性保護(hù)部分羥基，然后在C13羥基上接上合成側(cè)鏈，再去掉保護(hù)基團(tuán)得到紫杉醇[12]。從目前看來，半合成是最具有實(shí)用價(jià)值的制備方法，并且通過半合成研究可以獲得有關(guān)紫杉醇類似物構(gòu)效關(guān)系的信息，對(duì)紫杉醇進(jìn)行結(jié)構(gòu)改性以尋找活性更大、毒副作用小、抗癌譜有所不同或更廣的抗癌藥物。

圖2 巴卡亭III

3.4 離體培養(yǎng)法

利用離體培養(yǎng)的紅豆杉細(xì)胞或發(fā)根生產(chǎn)紫杉醇及其合成前體是紫杉醇來源的又一重要途徑，它具有無污染、不破壞自然資源及不受自然條件的限制等優(yōu)點(diǎn)。1989年，美國(guó)Christen等通過對(duì)太平洋紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)出紫衫醇[13-14]。隨后，日本、德國(guó)和韓國(guó)等也先后報(bào)道可以用細(xì)胞培養(yǎng)的方法產(chǎn)生高含量的紫杉醇。華東理工大學(xué)生物工程系對(duì)紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)、蛋白質(zhì)代謝、底物消耗及紫杉醇合成動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了全面研究，在100L生物反應(yīng)器中培養(yǎng)出紅豆杉細(xì)胞，生長(zhǎng)周期為20天左右紫杉醇含量達(dá)細(xì)胞干重的0.1%，比樹皮中含量高10倍。梅興國(guó)等還研究了兩相培養(yǎng)系統(tǒng)中紅豆杉細(xì)胞的生長(zhǎng)與代謝規(guī)律，經(jīng)過40天的培養(yǎng)，細(xì)胞生物量為17.85 g/L(干重)，紫杉醇的產(chǎn)量為30.19 mg/L[15]。這些研究為紅豆杉懸浮細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化奠定了基礎(chǔ)。

離體培養(yǎng)的另一途徑是用發(fā)根土壤桿菌(Agrobacteriumrhizogens)轉(zhuǎn)化紅豆杉細(xì)胞，誘導(dǎo)出發(fā)根，然后大量培養(yǎng)發(fā)根，再?gòu)陌l(fā)根中提取紫杉醇。由于發(fā)根生長(zhǎng)速率快、遺傳穩(wěn)定以及具有正常根的分化結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的特點(diǎn)，發(fā)根大量培養(yǎng)很可能成為生產(chǎn)紫杉醇的有效途徑。盛長(zhǎng)忠等利用土壤農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)對(duì)東北紅豆杉(Taxuscuspidate)不同外植體和不同生長(zhǎng)期的愈傷組織進(jìn)行了感染，結(jié)果表明，20 d的愈傷組織對(duì)該菌比較敏感，感染時(shí)間為5 min時(shí)，冠癭誘導(dǎo)率較高(15.0%)，對(duì)在無激素B5培養(yǎng)基中得到的白色松軟的冠癭組織分析檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，有特異的胭脂堿(nopaline)存在，并具有產(chǎn)生紫杉醇的能力[16]。

3.5 內(nèi)生菌法

Stierle等人[17]與1993年在Science上報(bào)道了通過紫杉樹上分離出來的內(nèi)生植物真菌(Taxomycesandreanae)來生產(chǎn)紫杉醇和相關(guān)的紫杉烷的研究結(jié)果，其紫杉醇的產(chǎn)量可達(dá)24～25 ng/L。研究人員通過大量的實(shí)驗(yàn)證明了所產(chǎn)生的化合物為紫杉醇，并且是由真菌生成的，并不是由植物或?qū)嶒?yàn)環(huán)境帶入的。其中一個(gè)最有力的證據(jù)是用放射性乙酸鹽進(jìn)行飼喂實(shí)驗(yàn)，利用二維色譜檢測(cè)產(chǎn)物的放射性斑點(diǎn)，與紫杉醇完全一致。隨后，他們又從西藏紅豆杉細(xì)枝中分離到一株內(nèi)生真菌—小孢擬盤多毛孢菌(Pestalotiopsismicrospora)，其發(fā)酵水平又比Taxomycesandreanae略高。因此推測(cè)，這可能是真菌偶然得到了一個(gè)紫杉樹生物合成紫杉醇的基因造成的。此發(fā)現(xiàn)具有重大的科學(xué)意義和潛在的商業(yè)價(jià)值，但因表達(dá)量仍偏低，近期不可能實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)。

3.6 微生物轉(zhuǎn)化法

利用生物酶類的高度選擇性將紫杉醇結(jié)構(gòu)類似的一些紫杉烷類化合物轉(zhuǎn)化成紫杉醇的半合成前體，這樣簡(jiǎn)化了分離過程并大大地提高了資源的利用率，為解決紫杉醇來源問題提供了一個(gè)很好的方法和思路。目前，紫杉醇類似物之間基因修飾以獲得更高活性的新化合物應(yīng)是一個(gè)更廣闊的應(yīng)用領(lǐng)域，近年來以紫杉烷類化合物為底物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的研究獲得了不少有意義的結(jié)果。

4 紫杉醇的生物合成途徑

紫杉醇的生物合成途徑目前已基本明了，其生物合成途徑中多種酶的基因已經(jīng)成功克隆。因此，隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，通過微生物及酶法實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)紫杉醇及其類似物終將實(shí)現(xiàn)。

紫杉醇的生物合成途徑大致分為3個(gè)主要階段：①紫杉醇骨架的生物合成；②苯基異絲氨酸側(cè)鏈的生物合成；③紫杉烷骨架和側(cè)鏈的酯化反應(yīng)，最終形成完整的紫杉醇分子。

4.1 紫杉醇骨架的生物合成

紫杉醇是萜類物質(zhì)，根據(jù)生物次生代謝中酸類化合物的生源途徑，紫杉醇的三環(huán)二萜骨架應(yīng)由乙酰CoA開始，經(jīng)某種代謝路徑合成牻牛兒焦磷酸酯(geranyl geranyl diphosphate，GGPP)，再由GGPP環(huán)化形成碳環(huán)骨架，然后經(jīng)一系列官能團(tuán)化反應(yīng)，最終形成紫杉醇[18]。

⑴ GGPP的生物合成。GGPP(圖3)是二萜類化合物生物合成的共同前體，它是經(jīng)焦磷酸異戊烯酯(isopentenyl dilphosphate，IPP)(圖4)轉(zhuǎn)變而來。關(guān)于GGPP的合成途徑目前存在兩種爭(zhēng)論。

圖3 GGPP 圖4 IPP

①甲羥戊酸途徑。由3個(gè)乙酰輔酶A(乙酰CoA)縮合生成3-羥基-3-甲基-戊二單酰輔酶A(HMG-CoA)，隨后，在HMG-CoA還原酶(HMGR)的作用下，產(chǎn)生甲羥戊酸(MVA)。MVA再經(jīng)焦磷酸化及脫羧脫水作用，形成C5的焦磷酸異戊烯酯(IPP)[19]，見圖5。

圖5 甲羥戊酸途徑

②3-磷酸甘油醛/丙酮酸途徑。Eisenreich等[20]利用核磁共振技術(shù)發(fā)現(xiàn)紫杉醇骨架結(jié)構(gòu)的合成可能存在類似于真菌中的途徑。這一途徑與甲羥戊酸途徑最大的不同之處就是所處的亞細(xì)胞位點(diǎn)不同，甲羥戊酸途徑位于細(xì)胞質(zhì)中，而3-磷酸甘油醛/丙酮酸途徑位于質(zhì)體中，兩條途徑作用的酶也有著重要區(qū)別，見圖6。

圖6 3-磷酸甘油醛-丙酮酸途徑

⑵ 紫杉烷碳環(huán)骨架的生物合成。紫杉醇生物合成中第一步重要的反應(yīng)是雙烯前體GGPP環(huán)化形成紫杉-4(20)，11(12)-二烯(圖7)。1995年，Ccroteau R等[21]將標(biāo)記的GGPP加入到紫杉莖提取液中，進(jìn)行放射化學(xué)方面的分離，通過二維NMR光譜證實(shí)，GGPP環(huán)化形成紫杉-4(5)，11(12)-二烯[taxa-4(5)，11(12)-diene](圖8)。該反應(yīng)是在紫杉二烯環(huán)化酶的作用下完成的，隨后此二烯萜中間體進(jìn)行不同程度的官能化，最后形成紫杉醇。

圖7 紫杉-4(20)，11(12)-二烯

圖8 紫杉-4(5)，11(12)-二烯

⑶ 紫杉烷碳環(huán)骨架的官能化反應(yīng)?，F(xiàn)知的第一步官能化反應(yīng)是紫杉二烯的C5在細(xì)胞色素P450介導(dǎo)下的羥基化，形成紫杉-4(20)，11(12)-二烯-5α-醇[taxa-4(20)，11(12)-dien-5α-ol][22]，隨后是?；?，接著是C10位的羥基化，之后是一系列的細(xì)胞色素P450介導(dǎo)的羥基化和依賴于乙酰CoA的乙酰化反應(yīng)，最后形成紫杉醇碳環(huán)骨架。

4.2 紫杉醇側(cè)鏈的生物合成

苯丙氨酸是紫杉醇側(cè)鏈合成的前體物質(zhì)，F(xiàn)leming等人[23-24]對(duì)苯丙氨酸的反應(yīng)順序進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。他們發(fā)現(xiàn)紫杉醇的側(cè)鏈?zhǔn)怯杀奖彼嵩诎被兾幻傅淖饔孟滦纬搔卤奖彼?，隨后C2位發(fā)生羥基化反應(yīng)生成苯基異絲氨酸，最后經(jīng)過NH2基的酰基化而形成的。其苯甲酰部分與巴卡亭III結(jié)合生成去苯甲?；仙即?，進(jìn)而合成紫杉醇。

5 對(duì)紫杉醇研究的展望

由于全球環(huán)境的不斷惡化，癌癥的發(fā)病率越來越高，治療癌癥病人所消耗的紫杉醇將會(huì)越來越多?，F(xiàn)階段還無法大規(guī)模生產(chǎn)紫杉醇，導(dǎo)致紫杉醇價(jià)格昂貴，大多數(shù)病人無法支付其高昂的費(fèi)用。如何將紫杉醇應(yīng)用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)將會(huì)成為研究的重點(diǎn)領(lǐng)域，讓紫杉醇更好地造福全人類，戰(zhàn)勝腫瘤，促進(jìn)人類健康事業(yè)的發(fā)展。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李杰,王春梅.紫杉醇組合生物合成的研究進(jìn)展[J].生物工程學(xué)報(bào),2014,30(4)：1-13.

[2] Ajikumar P K,Xiao W H,Tyo K E,et al.Isoprenoid pathway optimization for taxol precursor overproduction in Escherichia coli[J].Science,2010,330(6000): 70-74.

[3] 王正平.天然抗癌藥物——紫杉醇[J].應(yīng)用科技,2004,31(1): 56-58.

[4] 唐培,王鋒鵬.近年來紫杉醇的合成研究進(jìn)展[J].有機(jī)化學(xué),2013(3): 4.

[5] 彭天浩,王燕.紅豆杉中提取紫杉醇研究進(jìn)展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工,2013(12):57-59,62.

[6] Mattina M J I.Extraction，purification by solid-phase extraction and high-performance liquid chromatographic analysis of taxanes from ornamental Taxus needles[J].Journal of Chromatography A，1994，679：269-275.

[7] Vandana V,Teja A S,Zalkow L H.Supercritical extraction and HPLC analysis of taxol fromTaxusbrevifoliausing nitrous oxide and nitrous oxide+ ethanol mixtures[J].Fluid phase equilibria,1996,116(1): 162-169.

[8] Wender P A,Badham N F,Conway S P,et al.The pinene path to taxanes.6.A concise stereocontrolled synthesis of taxol[J].Journal of the American Chemical Society,1997,119(11): 2757-2758.

[9] Morihira K,Hara R,Kawahara S,et al.Enantioselective total synthesis of taxol[J].Journal of the American Chemical Society,1998,120(49): 12980-12981.

[10] Kusama H,Hara R,Kawahara S,et al.Enantioselective total synthesis of (-)-taxol[J].Journal of the American Chemical Society,2000,122(16): 3811-3820.

[11] Shiina I,Saitoh K,Frechard-Ortuno I,et al.Total asymmetric synthesis of taxol by dehydration condensation between 7-TES baccatin III and protected N-benzoylphenylisoserines prepared by enantioselective aldol reaction[J].Chemistry letters,1998,1998(1): 3-4.

[12] 王淑月譯.紫杉醇類似物[J].藥學(xué)進(jìn)展,1995，19(3)：159-163.

[13] Christen A A,Bland J,Gibson D M.Cell culture as a means to produce taxol[J].Proc Am Assoc Cancer Res,1989,30:A2252.

[14] Christen A A,Gibson D M,Bland J.Production of taxol or taxol-like compounds in cell culture[S].USP,5019504.1991.

[15] 梅興國(guó)，黃偉，王傳貴,等.紅豆杉細(xì)胞兩相培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇的研究[J].生物技術(shù)，2000,10:10-12.

[16] 盛長(zhǎng)忠，王淑芳，張心平,等.土壤農(nóng)桿菌C58遺傳轉(zhuǎn)化東北紅豆杉的初步研究[J].南開大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，32:27-30.

[17] Stierle A,Strobel G,Stierle D.Taxol and taxane production by Taxomyces andreanae,an endophytic fungus of Pacific yew[J].Science,1993,260(5105): 214-216.

[18] 孔建強(qiáng),王偉,朱平,等.紫杉醇生物合成的研究進(jìn)展[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2007,42(4): 358-365.

[19] 王玉霞,王春梅.紫杉醇在酵母中的組合生物合成[J].藥物生物技術(shù),2013,20(003): 271-275.

[20] Eisenreich W,Menhard B,Hylands P J,et al.Studies on the biosynthesis of taxol: the taxane carbon skeleton is not of mevalonoid origin[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,1996,93(13): 6431-6436.

[21] Croteau R,Hezari M,Hefner J,et al.The Early Steps in Taxane Anticancer Agents: Basic Science and Current Status.Geory G I,Chen T T,Ojima I,Vyas D M.American Chemical Society: Washigton D C,1995,72.

[22] Hefner J,Rubenstein S M,Ketchum R E B,et al.Cytochrome P450-catalyzed hydroxylation of taxa-4(5),11 (12)-diene to taxa-4 (20),11 (12)-dien-5a-o1: the first oxygenation step in taxol biosynthesis[J].Chemistry & Biology,1996,3(6): 479-489.

[23] Fleming P E,Mocek U,Floss H G.Biosynthesis of taxoids.Mode of formation of the taxol side chain[J].Journal of the American Chemical Society,1993,115(2): 805-807.

[24] Fleming P E,Knaggs A R,He X G,et al.Biosynthesis of taxoids.Mode of attachment of the taxol side chain[J].Journal of the American Chemical Society,1994,116(9): 4137-4138.