周 婧 徐 鵬 楊 波 柏冰雪 孫麗艷 孫東林

ADAM33基因多態(tài)性與東北漢族銀屑病的相關性

周 婧 徐 鵬 楊 波 柏冰雪 孫麗艷 孫東林

目的: 確定解整合素金屬蛋白酶(ADAM 33)基因與東北地區(qū)漢族人群銀屑病的相關性。方法: 利用多重SNaPSHOT方法檢測東北漢族400例銀屑病患者和398名正常對照的ADAM 33基因中rs2787094、rs512625、rs597980位點的基因分型。比較患者和對照組間、不同臨床表型組間的基因型、等位基因和單體型頻率分布的差異性。結果: ADAM33基因rs2787094CC、CG基因型和2個單體型(H3和H5)可能為銀屑病的危險因素(P＜0.05)，rs512625AA基因型和3個單體型(H1、H4和H7)可能是銀屑病的保護因素(P＜0.05)。rs597980的基因型和等位基因在病例和對照組間無差異(P＞0.05)。rs2787094CC基因型和C等位基因可能與晚期發(fā)病和/或無家族史的患者具有相關性，與病情嚴重程度和性別無關。結論: ADAM33基因的多態(tài)位點與東北地區(qū)漢族人群銀屑病具有相關性。

銀屑病； 解整合素金屬蛋白酶33； 多態(tài)位點

最近，一些研究表明銀屑病可能與ADAM33具有相關性。1－4人類ADAM33(hADAM33)基因是ADAM家族成員之一，位于20號染色體短臂13區(qū)(20p13)，在包括皮膚在內的多種組織中廣泛表達。5目前，ADAM33基因已被確定為哮喘易感基因，同時也發(fā)現ADAM33與許多免疫介導疾病具有相關性。6－9ADAM33參與細胞表面蛋白的脫落，可能與銀屑病有關。

Lesueur等在對46例法國斑塊型銀屑病家系全基因組掃描中發(fā)現了位于20p13的一個銀屑病的易感基因ADAM33；1隨后，分別在法國、北美和中國南方人群中得到驗證。2－4本研究采用分子生物學和生物信息學等手段，通過對ADAM33基因中多態(tài)位點的基因型的分布頻率檢測，來確定ADAM33基因多態(tài)位點在北方漢族人群銀屑病中的分布頻率，并通過關聯(lián)分析，進一步研究基因型與表型的關聯(lián)性。

1 材料與方法

1.1 研究對象 銀屑病病例組:銀屑病病例樣本取自2008年10月至2010年5月到哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院皮膚科門診就診的銀屑病患者，共計400例。所有患者均經過兩名皮膚科醫(yī)師的嚴格診斷確診，符合尋常型銀屑病的診斷標準。10并且根據銀屑病的嚴重程度、發(fā)病年齡、有無家族史以及性別進行分組。11

正常對照組:正常對照樣本共計398名，取自哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院體檢中心。正常對照個體家族中無銀屑病患者，而且無其它免疫炎癥性疾病。研究對象的性別、年齡在病例－對照兩組中匹配完全(表1)。

所有受試者之間無血緣關系，采集受試者外周靜脈血3～5 m L，ACD抗凝，于－70℃保存。全部受試者均簽署知情同意書。

表1 研究對象臨床特征

1.2 SNaPshot基因分型 利用DNA提取試劑盒(Qiagen，德國)提取基因組DNA，利用SNaPshot基因分型技術對樣本進行多態(tài)位點分型。12設計了3對PCR引物用于擴增3個位點的片段，設計了3個緊鄰SNP位點的延伸引物用于單堿基延伸。引物采用在線Primer3軟件設計(http://frodo.wi.mit.edu/cgibin/primer3/primer3＿www.cgi)(表2)。PCR產物用Qiagen公司的HotStarTaq進行多重PCR獲得，PCR產物經蝦堿酶(SAP)(Promega)和外切酶I(EXO I) (Epicentre)純化后用ABI公司的SNaPshot Multiplex kit進行延伸反應。延伸產物用蝦堿酶(SAP)純化后在ABI3130xl上樣，SNP分型用GeneMapper 4.0(Appliedbiosystems)來分析。經隨機選取5%的樣本重新分型，驗證結果，一致率為100%。

1.3 統(tǒng)計學方法 利用SPSS軟件對全部樣本的性別、年齡基本資料，進行獨立樣本t檢驗，以保證病例、對照樣本完全匹配。利用SPSS 13.0軟件，首先檢驗各群體是否符合Hardy－Weinberg遺傳平衡定律，接著進行χ2檢驗以檢測各個位點與銀屑病發(fā)生的關聯(lián)情況，進行病例組及正常對照組間基因型、等位基因和單體型頻率比較，探討ADAM33與銀屑病的相關程度。以比值比(OR)及95%可信區(qū)間(CI)表示各等位基因頻率、基因型頻率與疾病風險的相關性，P＜0.05為差異有顯著性意義。

2 結果

2.1 3個ADAM33基因多態(tài)位點的等位基因頻率和基因型頻率 見表3。經χ2檢驗，3個多態(tài)位點在病例組和對照組中的分布均符合Hardy－Weinberg平衡定律(P＞0.05)。以OR值和95%CI表示ADAM33 rs2787094、rs512625和rs597980各種基因型與銀屑病之間的相關性。rs2787094C等位基因頻率在病例組中明顯高于對照組(分別為46.3%、34.9%，P＜0.001)。rs2787094GG基因型作為參照，CC基因型和CG基因型在病例組和對照組的比較中，有明顯的差異，是銀屑病的高危因素[CC:OR，1.6047(1.2592～2.0450)，P＜0.0001；CG:OR，1.3130(1.1384～1.5143)，P＝0.0002]。

對于rs512625，A等位基因在對照組中明顯高于病例組(分別為41.6%、36%，P＝0.022)，AA基因型在對照組中的頻率高于病例組，這表明AA基因型可能是保護因素[OR:0.7890(0.6556～0.9495)，P＜0.0164]。然而，rs597980位點在病例組和對照組中等位基因和基因型的頻率無顯著差異，它們與銀屑病可能無相關性。

2.2 rs2787094與銀屑病臨床表型的相關性 分析rs2787094的基因型和等位基因在各臨床表型分組中分布頻率的差異性(表4、5)。rs2787094CC基因型的頻率在晚期發(fā)病組明顯高于對照組(P＜0.05)和早期發(fā)病組(P＜0.05)，在早期發(fā)病組和對照組間無差異(P＝3.144)。rs2787094C等位基因得到同樣結果，表明rs2787094CC基因型和rs2787094C等位基因與晚期發(fā)病具有相關性。

rs2787094CC基因型頻率在嚴重組高于對照組(Pc＜0.05)，同時對照組高于輕型組(Pc＜0.05)，但在嚴重組和輕型組之間無差異(Pc＝0.252)。rs2787094C等位基因在輕型組頻率高于對照組(Pc＜0.05)，在輕型組和嚴重組之間無差異(Pc＝0.78)，在嚴重組和對照組間無差異(Pc＝0.786)。因此認為rs2787094CC基因型、rs2787094C等位基因與皮損嚴重程度無相關性。

rs2787094CC基因型和C等位基因頻率在無家族史組明顯高于對照組(Pc＜0.05)和有家族史組(Pc＜0.05)，而在有家族史組和對照組之間無差異(分別Pc＝5.616和Pc＝2.85)，因此rs2787094CC基因型和C等位基因與無家族史患者具有相關性。

在性別分組中，rs2787094CC基因型和C等位基因頻率在男性患者和女性患者之間無明顯差異(分別為Pc＝4.236和Pc＝0.714)，因此認為rs2787094CC基因型和C等位基因與性別無相關性。

2.3 單體型與東北人群銀屑病的關聯(lián)分析 連鎖分析發(fā)現，3個多態(tài)位點無連鎖不平衡性，由此，3個多態(tài)位點均用于構建單體型，以便尋找與東北漢族人群銀屑病相關的單體型。表6列出了所有構建的單體型。針對單體型與銀屑病的相關性進行分析，結果顯示ADAM33的單體型與銀屑病具有相關性，在8個單體型中，H3和H5單體型在病例組中頻率高于對照組，表明H3和H5單體型可能與東北漢族的銀屑病具有相關性[H3:OR，1.512(1.137～2.011)，P＝0.004；H5:OR，3.837(2.656～5.543)，P＜0.001]。另外，H1、H4和H7單體型在病例組的頻率低于對照組，可能是保護性因素[H1:OR，0.711(0.563～0.900)，P＝0.004；H4:OR，0.621(0.462～0.836)，P＝0.002；H7:OR，0.569(0.382～0.849)，P＝0.005]。然而，其它單體型(H2，H6和H8)在病例組和對照組中頻率無顯著差異(P＞0.05)，提示與東北漢族的銀屑病無相關性。

表2 基因分型引物

表3 病例組和對照組中3個ADAM33基因多態(tài)位點的等位基因頻率和基因型頻率

表4 rs2787094CC基因型在不同臨床表型組間及與對照組之間的頻率比較

表5 rs2787094C等位基因在不同臨床表型組間及與對照組間的頻率比較

表6 ADAM33單體型在病例和對照中的分布及其與銀屑病的相關性

3 討論

本研究對400例北方銀屑病患者和398名正常對照的ADAM33基因中的3個位點多態(tài)性進行檢測，結果證實ADAM33基因的多態(tài)性可能與東北漢族銀屑病的發(fā)病有關，在銀屑病的易感性方面發(fā)揮重要作用。

3個被檢測的SNPs位于基因的3’端附近，此處為ADAM33基因調節(jié)信號的序列區(qū)域，因此這些SNPs可能影響轉錄的效率或者轉錄穩(wěn)定性。6其中rs2787094位于3’UTR的第22外顯子中，可能參與mRNA的定位和加工以及蛋白質的成熟，因此rs2787094可能影響基因的調節(jié)功能；rs512625位于3’側翼，因此這些多態(tài)位點可能與真正的影響信號傳導的多態(tài)位點存在連鎖不平衡關系，潛在的影響ADAM33的功能，以此參與銀屑病的發(fā)病機制。9

在法國家族性樣本中ADAM33基因中的四個多態(tài)位點(rs512625，rs677044，rs597980和rs44707)首次證實與銀屑病具有相關性，表明ADAM33基因是銀屑病的候選易感基因。1該結果在另外一個法國人群研究中得到驗證:rs512625與銀屑病具有相關性，rs628977與銀屑病的早期發(fā)病相關聯(lián)；2此外，在對北美的人群研究中發(fā)現rs597980與銀屑病具有明顯的相關性，進一步支持了ADAM33是銀屑病的易感基因的可能性；3在中國南方小樣本的人群研究中發(fā)現rs2787094與銀屑病有相關性。4雖然不同種族的人群遺傳背景存在很大差異，但在不同種族的人群中均證實了ADAM33基因與銀屑病存在相關性，這提示ADAM33基因作為銀屑病易感基因，在銀屑病的發(fā)生過程中發(fā)揮了重要作用。

在本研究中發(fā)現的與銀屑病具有明顯相關性的兩個多態(tài)位點(rs2787094和rs512625)與以往文獻報道的結果不盡相同。例如，在法國家族性研究和人群研究以及本次中國人群研究中，rs512625被證實與銀屑病具有相關性的多態(tài)位點，1但在北美的人群研究中，并未發(fā)現這種相關性。3另外，rs2787094在本研究的東北人群和南方的人群研究中均顯示與銀屑病有相關性，4但在法國家族研究中卻無相關性。1由此可見，在每個研究中都有明顯相關的多態(tài)位點，但每個研究結果不盡相同，在基因多態(tài)性研究中，這種不一致性是很普遍的。12－14這種偏差可能有幾種原因:首先，真正的ADAM33基因功能改變的相關突變還沒有被發(fā)現，或者和已發(fā)現的突變標記多態(tài)位點具有連鎖不平衡；其次，銀屑病遺傳異質性可能導致種族之間差異；再者，在不同的種族之間可能存在不同的連鎖不平衡；最后，臨床異質性也有可能影響即定的關聯(lián)研究。

在既往的基因型和表型相關性的研究中，只有在亞組和對照組之間，或者在各亞組之間進行比較。然而，本研究同時進行亞組和對照組之間以及各亞組之間進行比較，避免了假陽性結果。我們選取在中國南方和北方兩個人群中均與銀屑病相關的ADAM33基因位點rs2787094進行基因型和表型的分析發(fā)現，在發(fā)病年齡亞組中，數據顯示rs2787094CC基因型和C等位基因與晚期發(fā)病有關，在有無家族史亞組中，顯示與散發(fā)患者具有相關性，這與以往報道的早期發(fā)病患者多伴有家族史的臨床特征相一致。15－17而且，進一步支持基因多態(tài)性在銀屑病遺傳因素中的作用，以及多態(tài)位點與臨床表型的相關性。

構建單體型是疾病關聯(lián)分析中的重要方法之一。由于所有檢測的多態(tài)位點之間不具有連鎖不平衡性，因此，我們構建了單體型，通過檢測單體型在病例組和對照組的分布，以進一步分析ADAM33基因多態(tài)性在銀屑病的發(fā)病機制中的作用。研究結果發(fā)現，H3和H5單體型為銀屑病危險因素，而H1、H4和H7單體型是保護性因素。由此，單體型可能攜帶針對銀屑病的真正的未知病因性變異區(qū)域的重要的信息。

綜上所述，本研究表明ADAM33基因多態(tài)性和東北漢族銀屑病具有相關性，為銀屑病的診療方案提供新的信息。今后，將在各種族大樣本的人群中，進一步進行ADAM33其它位點的關聯(lián)和深入的功能研究，以闡明ADAM33基因在銀屑病發(fā)病中的作用機制。

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(收稿:2013－12－04 修回:2014－01－28)

Association of ADAM 33 gene polymorphism and psoriasis in Northeastern Chinese Han population

ZHOU Jing，XU Peng，YANG Bo，et al.Department ofDermatology，The Second Affiliated Hospital ofHarbin Medical University，Harbin，150081

Objective:To determine the association between ADAM33 and psoriasis in the northeastern Han population.Methods:Three common single nucleotide polymorphisms(SNPs)(rs2787094，rs512625 and rs597980)from ADAM33 were genotyped in 400 patients with psoriasis and 398 controls from the northeastern Han population using a Multiplex SNaPSHOTmethod.SNPs genotypes and alleles frequencieswere analyzed by SPSS 13.0.Rs2787094 CC genotype and C allelewere compared between the patients and controls，aswell as between patientswith different clinicalphenotypes of psoriasis.Results:The rs2787094CCCG genotypes(P＜0.05)and 2 haplotypeswere associated with an increased risk of psoriasis(H3，H5；P＜0.05). The rs512625AA genotype and 3 haplotypes(H1，H4，H7)were found to be a protective factor against psoriasis(P＜0.05).Rs2787094CC genotype and C allele were associated with patients both in the late onset group and/or in the sporadic group(P＜0.05).Conclusion:ADAM33 is associated with psoriasis in the northeastern Han population.

psoriasis；ADAM33；SNP

黑龍江省教育廳科學技術研究項目(編號:12511178)

哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院皮膚科，150081