曹筱筱 徐 蓉 李福倫 王一飛 范 斌 李 峰 李 斌 陳 潔

血熱證銀屑病患者外周血Th1、Th2和Th17的表達

曹筱筱 徐 蓉 李福倫 王一飛 范 斌 李 峰 李 斌 陳 潔?

目的: 確定血熱證銀屑病患者Th1/Th2/Th17主要細胞因子與銀屑病血熱證候的相關性。方法: 分別采用流式細胞技術(FACS)及酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測外周血單個核細胞(PMBCs)及血漿Th1/Th2/Th17細胞分泌主要細胞因子的表達。結(jié)果: 血熱證銀屑病的CD4＋IFN－γ為26.06±11.86較正常對照12.35±6.52升高(P＜0.05)；CD4＋IL－4＋及CD4＋IL－17＋較正常對照稍降低(P＞0.05)。IFN－γ為91.20±48.37較正常對照47.44±21.46升高，而IL－4較正常對照下降(P＜0.05)。IL－17的水平兩組無統(tǒng)計學差異。結(jié)論: 血熱證銀屑病Th細胞免疫機制節(jié)點起主導作用的細胞亞型及細胞因子可能為Th1型，主導細胞因子為IFN－γ。

銀屑病； 血熱證； Th細胞

銀屑病是一種以皮膚的紅斑鱗屑為主要臨床表現(xiàn)的常見慢性復發(fā)性疾病，病理表現(xiàn)為炎癥性表皮過度增生，發(fā)病率高。1銀屑病中醫(yī)稱之為“白疕”，認為本病病位在血分，急性期多以血熱為主，壅于肌表而發(fā)，兼風、寒、濕等因素；靜止期以血瘀為主，緩解期則以血虛為主。根據(jù)臨床表現(xiàn)將其分為“血熱證、血瘀證、血虛證”三個證候，在疾病發(fā)展的過程中，各個證候可以相兼且有所側(cè)重，直至相互轉(zhuǎn)化。本課題分別檢測尋常型銀屑病血熱型患者Th細胞的3種細胞因子IFN－γ、IL－4、IL－17，且與正常對照組進行比較。以明確尋常型銀屑病(PV)血熱型患者起主導作用的Th細胞類型及其細胞因子，繼而篩選PV血熱證侯分型的標志性細胞因子。

1 材料與方法

1.1 研究對象 2011年7月至2012年4月上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院皮膚科門診及病房有完整記錄的血熱證銀屑病患者30例，男19例，女11例；年齡20～65歲，平均46.36±13.04歲；其病情嚴重程度PASI評分為1.20～23.20分，平均10.35± 5.84分。正常對照為健康體檢者30名，其中男17名，女13名，年齡20～39歲，平均27.31±1.398歲。

西醫(yī)診斷標準2銀屑病進行期:皮膚損害以紅色炎性丘疹、斑丘疹及大小不等的斑片為主，上覆多層銀白色鱗屑，刮除鱗屑可見一層光亮的薄膜，薄膜下有點狀出血(Auspitz征)。發(fā)病急，新疹多且不斷有新發(fā)疹出現(xiàn)，可見同形反應(Koebner現(xiàn)象)。

中醫(yī)證型診斷標準3血熱證:新皮疹不斷出現(xiàn)，以丘疹、斑丘疹為主，疹基底皮膚顏色鮮紅，刮去鱗屑見點狀出血，可有同形反應。初發(fā)或復發(fā)，可有不同程度的瘙癢，心煩口渴或口干，便秘尿黃，舌質(zhì)紅，苔黃，脈數(shù)。

納入標準:明確診斷為尋常型銀屑病血熱證；年齡18～65歲；病程0～20年；所選病例均為新發(fā)或最近3月未作任何治療，且無其他疾病史者。排除標準:3個月內(nèi)曾采用系統(tǒng)治療，包括大面積外用強效糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑；合并有心、腦血管、肝、腎和造血系統(tǒng)等嚴重原發(fā)性疾病，精神病患者。

1.2 試劑和儀器 流式細胞儀檢測使用試劑及儀器:RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清、淋巴細胞分離液均由PA公司提供；佛波酯(PMA)、離子霉素(ionomycin)購自美國Sigma Aldrich公司；莫能霉素(monensin)、T細胞表面抗體:抗人CD4 PE、細胞因子抗體，抗人IFN－γ、FITC及抗人IL－4 PE－Cy7均購自美國eBioscience公司；流式細胞儀(MACSQuant SN2187)由德國Miltenyi公司生產(chǎn)。

酶聯(lián)免疫吸附測定法使用試劑及儀器:抗人IFN－γ、IL－4、IL－17A；ELISA試劑盒由西塘科技生物有限公司提供；酶標儀(DENLEY DRAGON Wellscan MK 3)及洗板機(Wellwash 4 MK2)由芬蘭Thermo公司生產(chǎn)；具體步驟:參見試劑盒內(nèi)說明書。

1.3 方法 抽取患者及正常人外周靜脈血5 mL(肝素抗凝)；1000 r/min離心×5 min后取血漿－80℃冰箱凍存?zhèn)錅yELISA部分實驗；采用密度梯度離心法分離單一核細胞(PBMCs)；取分離出PBMCs，5000 r/ min離心×5 min；去上清后再加磷酸緩沖液(PBS)，再次5000 r/min離心×5 min；吸棄上清，加250μL PBS重懸，200μL/孔PBMC細胞懸液鋪入96孔板加試劑(PMA 100 ng/m L，離子霉素1μg/mL，莫能霉素2 μmol/L)，刺激6 h后收細胞；300μL PBS，2000 r/min振蕩離心×5min；去上清后加50μL PBS，再加5μL CD4，孵育10 min后；加300μL PBS，2000 r/min振蕩離心×5 min；去上清加胞內(nèi)固定液500μL；30 min后再加500μL胞內(nèi)穿膜液離心2000 r/min×5 min；去上清加70μL胞內(nèi)穿膜液，分別加抗體IFN－γ、IL－4和IL－17A后振蕩過夜；加500μL胞內(nèi)穿膜液振蕩離心2000 r/min×5 min；去上清加300μL胞內(nèi)穿膜液上機。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計。計量資料以ˉx±s表示，符合正態(tài)分布，則用t檢驗。

2 結(jié)果

見表1、2。從表可以看出血熱證銀屑病患者的CD4＋IFN－γ＋較正常對照升高(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。CD4＋IL－4＋及CD4＋IL－17＋較正常對照降低(P＞0.05)，差異無統(tǒng)計學意義。血漿中IFN－γ較正常組有明顯升高(P＜0.05)，而血漿中IL－4較正常組下降(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。血漿中IL－17較正常略有上升(P＞0.05)，差異無統(tǒng)計學意義。

表1 流式細胞儀檢測結(jié)果

表2 酶聯(lián)免疫吸附測定法結(jié)果

3 討論

銀屑病病因病機比較復雜，幾千年以來中醫(yī)各家對銀屑病的辨證論治觀點各異，大部分的學者主張銀屑病從血分辨證為主，治療上也都從血入手，趙炳南4辨證分為3型:血熱證，血燥證，血瘀證。

現(xiàn)代醫(yī)學研究表明，5尋常型銀屑病的發(fā)病機制與異常T細胞導致表皮角質(zhì)形成細胞過度增生有關。銀屑病的Th細胞主要向Th1及Th17方向分化，Treg起到微調(diào)上述分化的作用，而Th2則具有抑制上述分化趨向。6，7其中IFN－γ及IL－12促使Th向Th1分化并分泌IFN－γ、TNF－α等因子，Tbet是其關鍵的信號轉(zhuǎn)導因子；IL－4誘導Th向Th2分化進而分泌IL－4、IL－5等因子，GATA3是其關鍵的信號轉(zhuǎn)導因子；IL－6、IL－23及TGF－β促使Th向Th17分化并分泌IL－6、IL－17及IL－22，RORγt是其關鍵的信號轉(zhuǎn)導因子。8

通過本次研究可以發(fā)現(xiàn)，血熱證銀屑病患者血漿IFN－γ與外周血PBMCs中CD4＋IFN－ν＋均較正常組有明顯升高，兩者結(jié)果一致，表明血熱證銀屑病患者以Th1細胞占優(yōu)勢主導地位。而血熱證銀屑病患者外周血PBMCs中CD4＋IL－4＋、CD4＋IL－17＋與血漿IL－4、IL－17的改變與正常對照均無明顯差異。上述結(jié)果提示Th2及Th17細胞在血熱證銀屑病中不具有特殊的意義。

本課題通過兩種方法來檢測血熱證銀屑病患者3種Th細胞的代表性細胞因子IFN－γ、IL－4、IL－17，兩者的結(jié)果基本一致。酶聯(lián)免疫吸附測定法其特異性不如流式細胞技術高，檢測的IFN－γ、IL－4、IL－17不僅僅由Th細胞分泌，其他細胞也會少量的分泌，但是通過酶聯(lián)免疫吸附測定的結(jié)果可以對血熱證銀屑病做一個大致的判斷。

本研究檢測的三類Th細胞及其細胞因子只是針對于血熱證銀屑病患者，其與正常對照比較，初步發(fā)現(xiàn)了此類型的患者Th1細胞及其細胞因子的表達較其他Th細胞比較占明顯的主導地位。但是對于血熱證銀屑病患者與其他證型的銀屑病患者在此三類Th細胞及其細胞因子之間是否有差異，有待于進一步的研究來證實。

1Blauvelt A，Bichenbach JR，Dulesz－Martin MF，et al.Montagna symposium 2008:the biologic basis of posriasis.J Invest Dermatol，2009，129(2):259－260.

2趙辨.臨床皮膚病學.3版.南京:江蘇科學技術出版社，2001. 759－772.

3上海市衛(wèi)生局.上海市中醫(yī)病癥診療常規(guī).2版.上海:上海中醫(yī)藥大學出版社，2005.231－234.

4趙炳南，張志禮.簡明中醫(yī)皮膚病學.北京:中國展望出版社，1983.9:200－203.

5Oritz A，Yamauchi PS.A treatment strategy for psoriasis transitioning from systemic therapy to biologic agents.Skinmed，2006，5(6):285－288.

6Harrington LE，Hatton RD，Mangan PR，et al.Interleukin 17－producing CD4＋effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages.Nat Immunol，2005，6 (11):1123－1132.

7 Park H，Li Z，Yang XO，et al.A distinct lineage of CD4 cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17.Nat Immunol，2005，6(11):1133－1141.

8Weaver CT，Harrington LE，Mangan PR，et al.Th17:an effector CD4T cell lineage with regulatory T cell ties.Immunity，2006，24:277－688.

(收稿:2013－10－30)

The expression of Th1/Th2/Th17 in peripheralblood of the patientsw ith b lood－h(huán)eat syndrome of psoriasis

CAO Xiao-xiao，XU Rong，LIFu-lun，et al.Yueyang Hospital of Integrative Chinese＆Western Medicine Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，200437

Objective:To determ ine the association between Th1/Th2/Th17 cytokines，and blood－h(huán)eat syndrome of psoriasis.Methods:Flow cytometry and ELISA were applied to test Th1/Th2/Th17 cytokines in the peripheral blood of the patientswith blood－h(huán)eatsyndrome of psoriasis and healthy controls.Results:CD4＋IFN－γ＋was higher in the patients with blood－h(huán)eat syndrome of psoriasis than in the healthy controls，with a significant difference between the two groups(P＜0.05)，but the level of CD4＋IL－4＋and CD4＋IL－17＋was lower than healthy controls(P＞0.05).The level of IFN－γwas higher in the patients with blood－h(huán)eat syndrome of psoriasis than in healthy controls.The level of IL－4 was lower in the patientswith blood－h(huán)eat syndrome of psoriasis than in controls(P＜0.05).There was no significant difference in the level of IL－17 between the two groups(P＞0.05).Conclusion:Themajor Th cell immunemechanism in blood－h(huán)eat syndrome of psoriasis was Th1 cell and themajor cytokineswas IFN－γ.

psoriasis；blood heat syndrome；Th cells

上海市自然基金(編號:11ZR1438000)

上海市高級中西醫(yī)結(jié)合人才培養(yǎng)計劃(編號:ZYSNXD012－RC－ZXY010)

上海市衛(wèi)生局項目(編號:2011XY004)

上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院皮膚科，上海，200437

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