賀 琪 吳 艷 岳 青 李家文

·論著·

IL－36γ、p38MAPK通路和Th17細(xì)胞因子在扁平苔蘚中的表達(dá)

賀 琪 吳 艷 岳 青 李家文?

目的: 檢測(cè)IL－36及p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)通路和Th17細(xì)胞因子在扁平苔蘚中的表達(dá)。方法: 應(yīng)用Envision免疫組化法檢測(cè)58例扁平苔蘚及19名正常皮膚標(biāo)本中IL－36γ、磷酸化－p38MAPK(p－p38)和IL－17A的表達(dá)。結(jié)果: IL－36γ、p－p38和IL－17A在扁平苔蘚皮損中的蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為86.21%、79.31%和94.83%，顯著高于正常對(duì)照標(biāo)本陽(yáng)性率為68.42%、15.79%和63.16%(均P＜0.01)。扁平苔蘚組中，IL－36γ與p－p38、IL－36γ與IL－17A的表達(dá)水平存在顯著正相關(guān)(P＜0.001)，兩因子表達(dá)強(qiáng)度有顯著差異(P＜0.05)。結(jié)論: p38MAPK通路和Th17細(xì)胞因子可能與扁平苔蘚的發(fā)病有關(guān)。

白細(xì)胞介素－36； 扁平苔蘚； p38絲裂原活化蛋白激酶； Th17細(xì)胞； 白細(xì)胞介素－17A

白細(xì)胞介素－36(IL－36)細(xì)胞因子作為新的IL－1家族成員在近幾年的相關(guān)研究中逐漸嶄露頭角。1迄今的研究成果證實(shí)，IL－36是一種促炎性細(xì)胞因子，能被多種細(xì)胞分泌產(chǎn)生，在先天性和獲得性免疫應(yīng)答過(guò)程中均發(fā)揮重要作用。2絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是一個(gè)高度保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)家族，可被多種刺激活化，目前已有ERK途徑、JNK途徑、p38MAPK途徑及ERK5/BMK1途徑等經(jīng)典MAPK信號(hào)通路被鑒定出來(lái)，當(dāng)機(jī)體受到不同刺激時(shí)，相應(yīng)通路被激活并參與特定的病理過(guò)程，產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)。3輔助性T細(xì)胞17(Th17)由CD4＋T細(xì)胞分化而來(lái)，可分泌IL－17A、IL－17F、IL－6和TNF－α等炎性細(xì)胞因子，參與多種細(xì)胞、因子及信號(hào)通路的誘導(dǎo)和調(diào)控，在慢性炎癥及自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中占有重要地位。4文獻(xiàn)揭示，IL－36在銀屑病、關(guān)節(jié)炎、慢性腎炎、呼吸道及肺部感染等多種炎癥性疾病中表達(dá)升高，參與炎性細(xì)胞的趨化和募集，誘導(dǎo)多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放，并可于體外誘導(dǎo)激活在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中占據(jù)重要位置的MAPK信號(hào)通路與核因子－κB(NF－κB)信號(hào)通路。1，2，5本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)IL－36γ、磷酸化－p38MAPK(p－p38)和IL－17A在扁平苔蘚患者皮損組織中的表達(dá)，以探討扁平苔蘚中IL－36與p38MAPK信號(hào)通路及Th17細(xì)胞因子之間的關(guān)聯(lián)和意義。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 病理組皮損標(biāo)本取材自2011年1月至2013年5月于我院皮膚科經(jīng)臨床病理確診的門(mén)診患者，58例扁平苔蘚患者，男38例，女20例，年齡24～58歲，平均38.4±8.9歲；所有患者均未患其他皮膚疾病，活檢取材前1個(gè)月內(nèi)未行系統(tǒng)治療，2周內(nèi)未行局部治療。對(duì)照組標(biāo)本取材自我院泌尿外科行包皮環(huán)切手術(shù)的19名健康男性，年齡14～35歲，平均19.2±4.8歲，標(biāo)本經(jīng)組織病理學(xué)檢查確認(rèn)為正常皮膚。本研究已經(jīng)過(guò)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者皆已簽署知情同意書(shū)。

1.2 試劑 IL－36γ兔多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Gene Tex公司，磷酸化p38 MAPK小鼠單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，IL－17A兔多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech Group公司，Envision K5007免疫組化試劑盒購(gòu)自丹麥Dako公司。

1.3 方法 將新鮮標(biāo)本用10%福爾馬林固定后進(jìn)行石蠟包埋，切片。應(yīng)用Envision免疫組織化學(xué)染色法，將切片脫蠟至水；微波修復(fù)抗原；放入3%過(guò)氧化氫溶液室溫孵育10 min，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；加入一抗(IL－36γ、p－p38和IL－17A的稀釋濃度分別為1∶400、11∶300和11∶50)4℃過(guò)夜；PBS洗凈后加入相應(yīng)二抗4℃孵育50 min；PBS洗凈后加入新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡控制顯色；蘇木素復(fù)染；脫水封片。空白對(duì)照標(biāo)本以PBS溶液代替一抗。

1.4 結(jié)果判定 胞核或胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色染色顆粒的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞，p－p38主要定位于胞核，IL－36γ和IL－17A則為胞漿表達(dá)。陰性對(duì)照為無(wú)染色或與背景色一致。應(yīng)用半定量積分法評(píng)估實(shí)驗(yàn)結(jié)果。每個(gè)標(biāo)本任選10個(gè)400倍視野，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占視野中總細(xì)胞數(shù)的比值，取平均值作為該標(biāo)本的陽(yáng)性細(xì)胞百分比。按陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分:＜5%計(jì)0分，6%～25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，＞75%計(jì)4分。按染色強(qiáng)度評(píng)分:無(wú)染色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，黃色計(jì)2分，棕黃色計(jì)3分；將上述兩項(xiàng)的乘積作為每個(gè)標(biāo)本的總評(píng)分，0～1分為陰性(－)，2～4分為弱陽(yáng)性(＋)，5～8分為陽(yáng)性(2＋)，9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性(3＋)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間比較應(yīng)用χ2檢驗(yàn)，兩因子間的相關(guān)性分析應(yīng)用spearman等級(jí)相關(guān)法。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 IL－36γ、p－p38和IL－17A的表達(dá)情況 扁平苔蘚組中，IL－36γ陽(yáng)性率86.21%，主要表達(dá)于表皮細(xì)胞的胞漿中，多聚集在基底細(xì)胞液化變性區(qū)及周?chē)?xì)胞層；p－p38陽(yáng)性率79.31%，主要分布于顆粒層角質(zhì)形成細(xì)胞及真皮炎性細(xì)胞的胞核與胞漿中，染色較濃；IL－17A陽(yáng)性率94.83%，廣泛表達(dá)于表皮細(xì)胞胞漿、胞外間隙及臨近的真皮結(jié)締組織中，染色深。正常對(duì)照組中，IL－36γ陽(yáng)性率為68.42%和IL－17A陽(yáng)性率為63.16%。在標(biāo)本中的分布情況與病理組相似，但陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量和染色強(qiáng)度相應(yīng)減少，p－p38陽(yáng)性率15.79%則在正常表皮中表達(dá)極少(圖1、2)。IL－36γ、p－p38和IL－17A在扁平苔蘚組中的蛋白表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組(χ2＝14.546，P＜0.01；χ2＝28.002，P＜0.001；χ2＝25.024，P＜0.001)，見(jiàn)表1。

圖1 a、b、c:IL－36γ，p－p38和IL－17A在扁平苔蘚中的表達(dá)(免疫組化，×200)圖2 a、b、c:IL－36γ，p－p38和IL－17A在正常表皮中的表達(dá)(免疫組化，×200)

表1 IL－36γ、p－p38和IL－17A在扁平苔蘚和正常表皮中的表達(dá)

2.2 IL－36γ與p－p38和IL－17A之間的相關(guān)性分析對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，在扁平苔蘚組中，IL－36γ與p－p38的蛋白表達(dá)存在顯著正相關(guān)(r＝0.655，P＜0.001)，兩因子的表達(dá)強(qiáng)度有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Z＝3.336，P＜0.05)，IL－36γ以陽(yáng)性為主，p－p38傾向于陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性染色。IL－36γ與IL－17A的表達(dá)亦呈顯著正相關(guān)(r＝0.637，P＜0.001；表2)，兩因子的表達(dá)強(qiáng)度有明顯差異(Z＝5.633，P＜0.05)，IL－17A以陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性為主。

表2 扁平苔蘚組中IL－36γ與p－p38和IL－17A的蛋白表達(dá)相關(guān)性

3 討論

IL－1家族的新晉成員IL－36是最初作為促炎癥因子被發(fā)現(xiàn)并報(bào)道，6它包含三個(gè)分子，分別是IL－36α、IL－36β和IL－36γ(亦被稱(chēng)為IL－1F6、IL－1F8和IL－1F9)，因其高度同源性而具有相似的生物學(xué)活性。1有研究揭示IL－36因子在人類(lèi)表皮中廣泛表達(dá)，IL－36α在皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞中過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致皮膚炎癥，而在IL－36受體拮抗劑(IL－36Ra)天然缺乏時(shí)炎癥加劇。7本研究結(jié)果顯示，IL－36γ存在于大部分扁平苔蘚標(biāo)本的皮損表皮中，蛋白表達(dá)水平較正常組織顯著升高，說(shuō)明扁平苔蘚的發(fā)病與IL－36的表達(dá)改變密切相關(guān)，為該因子與炎癥性疾病的關(guān)聯(lián)提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

MAPK廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，目前已被鑒定出來(lái)的經(jīng)典MAPK胞外刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，p38 MAPK通路與細(xì)胞的增殖、分化和細(xì)胞因子合成相關(guān)，并參與T細(xì)胞的激活，在光老化、增生性瘢痕、銀屑病、黑素瘤及尖銳濕疣等多種皮膚病的局部炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，當(dāng)受到胞外刺激時(shí)，p38 MAPK以三級(jí)激酶級(jí)聯(lián)模式活化后被磷酸化并轉(zhuǎn)移入胞核，通過(guò)其特有通路介導(dǎo)相應(yīng)的生物學(xué)功能。8在本研究中，我們檢測(cè)到p－p38蛋白在較多扁平苔蘚標(biāo)本中表達(dá)，具有親核性，且染色較深，而在正常對(duì)照標(biāo)本中則表達(dá)極少或不表達(dá)，證明p38MAPK在扁平苔蘚皮損組織中被活化，轉(zhuǎn)變成p－p38，可能因此而激活p38 MAPK通路，參與局部炎癥進(jìn)程。

文獻(xiàn)報(bào)道，Th17細(xì)胞的主要分泌產(chǎn)物IL－17與系統(tǒng)性硬化癥、哮喘、銀屑病及類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病的炎癥浸潤(rùn)密切相關(guān)，IL－17 mRNA在口腔扁平苔蘚患者的皮損黏膜及黏膜下結(jié)締組織中表達(dá)升高，推測(cè)其與口腔扁平苔蘚的病程進(jìn)展有關(guān)。9本研究所收集的扁平苔蘚皮損標(biāo)本均取自體表非黏膜區(qū)，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到，IL－17A在幾乎所有的組織病理標(biāo)本中廣泛表達(dá)，含量顯著高于正常對(duì)照組，這提示IL－17與非黏膜扁平苔蘚皮損的發(fā)病亦存在關(guān)聯(lián)。

Towne等人證明，IL－36家族的幾種因子可在體外培養(yǎng)的Jurkat細(xì)胞中構(gòu)成一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的信號(hào)系統(tǒng)，并能誘導(dǎo)激活MAPK信號(hào)通路。6Carrier等人發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的人類(lèi)角質(zhì)形成細(xì)胞中，IL－36可被以IL－17A和TNF－α為主的Th17細(xì)胞因子所誘導(dǎo)，反之亦然。10我們以往的研究結(jié)果顯示，尋常型銀屑病患者皮損中IL－36可誘導(dǎo)p38MAPK通路活化。11本研究通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，扁平苔蘚患者皮損中，IL－36γ與p－p38和IL－17A的表達(dá)水平均存在顯著正相關(guān)，證明IL－36在該病中與p38MAPK通路及Th17細(xì)胞因子密切相關(guān)，三者可能在局部免疫應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)中存在相互誘導(dǎo)的關(guān)系。針對(duì)近幾年的研究成果推測(cè)，扁平苔蘚的發(fā)病可能是一種體內(nèi)外刺激所致的由細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞自身抗原的應(yīng)答改變。12通過(guò)對(duì)標(biāo)本切片的鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，IL－36γ集中表達(dá)于液化變性的基底細(xì)胞層及臨近表皮，pp38和IL－17A則傾向表達(dá)于鄰近基底層液化變性區(qū)的真皮炎性細(xì)胞帶，這提示扁平苔蘚的主要炎癥應(yīng)答位于表皮基底細(xì)胞層及鄰近區(qū)域，IL－36γ、p－p38及IL－17A趨向患者皮損基底層的這種變化和相互影響可能促使角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)自身抗原，誘發(fā)或加劇炎癥反應(yīng)，繼而導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡，基底層液化變性，最終致使疾病的發(fā)生和發(fā)展。

本研究首次探討了IL－36在扁平苔蘚中的表達(dá)情況及其與p－p38和IL－17A的關(guān)聯(lián)，結(jié)果提示IL－36因子、MAPK信號(hào)通路和Th17細(xì)胞在該病的局部免疫應(yīng)答中均扮演重要角色，且存在復(fù)雜的相互影響，三者協(xié)同作用于該病的發(fā)生及病程進(jìn)展，這為扁平苔蘚的治療和預(yù)后提供了新的思路，其具體病理機(jī)制、相互作用及臨床意義則有待進(jìn)一步研究探索。

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(收稿:2013－12－24 修回:2014－02－05)

Expression of IL－36 and p38MAPK pathway and Th17 cytokine in lichen planus

HE Qi，WU Yan，YUE Qing，et al.Department of Dermatology，Union Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan，430022

Objective:To detect the expression of IL－36，p38mitogen－activated protein kinase(p－p38) pathway and Th17 cytokine in lichen planus.Methods:Immunohistochemistry EnVision technique was used to detect the expression of IL－36γ，p－p38 and IL－17A in 58 patients with lichen planus and 19 controls.Results:The expression of IL－36γ，p－p38 and IL－17A was higher in the patients’lesion of lichen planus(the positive rateswere 86.21%，79.31%and 94.83%)than in control group(the positive rates were 68.42%，15.79%and 63.16%)(all P＜0.01).In lichen planus group，therewere positive correlations between the expression of IL－36γand p－p38(P＜0.001)，and between the expression of IL－36γand IL－17A(P＜0.001). Significant differencewas also observed between the two cytokines’expression grade(P＜0.05).Conclusion: p38MAPK pathway and Th17 cytokinemay be involved in the pathogenesis of lichen planus.

interleukin－36；lichen planus；p38 mitogen－activated protein kinase；Th17；interleukin－17A

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助(編號(hào):30972654)

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院皮膚科，武漢，430022

?通信作者