王藝淳 林新瑜王 芳 廖恒利 劉 偉 陳明懿

芍藥苷對人黑素細胞生物活性及遷移的影響

王藝淳 林新瑜?王 芳 廖恒利 劉 偉 陳明懿

目的: 確定芍藥苷對人黑素細胞生物活性及遷移的影響。方法: 體外培養(yǎng)人表皮黑素細胞,分別使用MTT法、L－DOPA法、NaOH法、Transwell小室法檢測不同濃度的芍藥苷對黑素細胞的增殖活性、酪氨酸酶活性、黑素合成以及黑素細胞遷移的影響。結(jié)果: 芍藥苷能顯著促進黑素細胞增殖和上調(diào)酪氨酸酶活性,且10 μg/mL是產(chǎn)生這兩方面作用的最佳濃度；芍藥苷也能促進黑素的合成,50 μg/mL時作用最顯著。芍藥苷在20 μg/mL時顯著促進黑素細胞遷移。各組與空白對照組比較差異均有顯著性(P＜0.05)。結(jié)論: 芍藥苷單體可能是白芍中促進黑素細胞遷移的主要活性成分。

芍藥苷； 補骨脂素； 黑素細胞

白芍,毛茛科芍藥屬植物,高頻率出現(xiàn)在許多治療白癜風和黃褐斑的方劑中,1具有良好的治療色素障礙性疾病的療效。芍藥苷(paeoniflorin,PF)作為白芍的主要單體,具有抗氧化及改善微循環(huán)等作用。2本文選取白芍的單體做實驗,相比成分復雜的原藥,更能準確反應其對黑素細胞的影響。研究發(fā)現(xiàn),黑素細胞的遷移在白癜風的色素恢復中起重要作用。3本文將芍藥苷作用于黑素細胞,觀察其遷移情況,并選取補骨脂素作為陽性對照,以期為治療色素障礙性疾病尋找安全、有效的治療方案。

1 材料與方法

1.1 材料 黑素細胞來源于健康青少年包皮環(huán)切術后皮膚組織原代培養(yǎng)而來。芍藥苷、補骨脂素均購自成都市藥檢所；人表皮黑素細胞培養(yǎng)基Medium254型,人黑素細胞生長添加劑－2,胎牛血清,胰酶等購自Gibco公司；左旋多巴(L－DOPA),噻唑藍(MTT),纖維連接蛋白均購自Sigma公司；分離酶II購自Roche公司；細胞培養(yǎng)瓶,Transwell小室均購自Corning公司；倒置相差顯微鏡DP72產(chǎn)自Olympus公司；全自動酶標分析儀,CO2恒溫孵育箱均產(chǎn)自Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 黑素細胞的體外培養(yǎng)及鑒定 黑素細胞的培養(yǎng)和鑒定方法參見文獻,4鑒定采用左旋多巴染色和S－100蛋白免疫組化染色,4經(jīng)鑒定證實為黑素細胞后,取純化黑素細胞進行試驗。

1.2.2 對黑素細胞生物活性的影響測定 將黑素細胞接種于96孔培養(yǎng)板。將芍藥苷、補骨脂素分別稀釋為2.5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL由低到高6個濃度梯度。分別加入上述96孔板中,每濃度設4個復孔,并設空白對照組(只加細胞和培養(yǎng)基)及無細胞組(只加培養(yǎng)基),以補骨脂素組為陽性對照。

黑素細胞增殖活性的測定:采用MTT法。按上述分組后96孔板繼續(xù)放入培養(yǎng)箱72 h,取出后每孔分別加入20 μL 1 mg/mL的MTT溶液。再繼續(xù)37℃培養(yǎng)4 h。每孔再加入二甲基亞砜150 μL,振蕩10 min后立即置于酶標儀490 nm波長處測量各孔吸光度值。按以下公式計算:細胞增殖率＝(實驗組吸光度值－無細胞組吸光度值)/(空白對照組吸光度值－無細胞組吸光度值)×100%。

黑素細胞內(nèi)酪氨酸酶活性的測定:采用左旋多巴(L－Dopa)氧化速率法,按上述分組后96孔板繼續(xù)放入培養(yǎng)箱48 h,PBS液洗滌后每孔加入0.5%Triton－X溶液100 μL,迅速置于－80℃凍存30 min,取出后室溫融化。再每孔加入0.1%L－Dopa溶液,于37℃孵育3 h,置于酶標儀在490 nm波長下測量各孔吸光度值。按以下公式計算:酪氨酸酶活性＝(實驗組吸光度值－無細胞組吸光度值)/(空白對照組吸光度值－無細胞組吸光度值)×100%。

黑素細胞黑素合成的測定:采用NaOH裂解法,細胞接種和設組同上,藥物分別作用細胞48 h后PBS液洗滌,每孔加入1 mol/L NaOH 100 μL,37℃水浴1 h,用酶標儀測定波長460 nm的吸光度值。按以下公式計算:黑素合成率＝(實驗組吸光度值－無細胞組吸光度值)/(空白對照組吸光度值－無細胞組吸光度值)×100%。

1.2.3 對黑素細胞遷移的影響測定 Transwell小室由直徑8.0 μm微孔的聚碳酸酯膜將細胞培養(yǎng)孔板分為上下兩室,先取出聚碳酸酯膜用纖維連接蛋白包被,過夜晾干。次日洗滌后,將小室放入預先每孔加500 μL的培養(yǎng)液的24孔板內(nèi),上室中加入純化黑素細胞100 μL,下室中分別加入藥物等。置37℃、5% CO2條件培養(yǎng)14 h后,取出上室,擦去其內(nèi)面(未遷移至膜下側(cè))的細胞。將聚碳酸酯膜用4%多聚甲醛固定30 min,蘇木精－伊紅(H－E)染色。梯度酒精脫水干燥。置顯微鏡下觀察,高倍鏡下(×40)隨機取6個視野計數(shù)穿膜細胞,所有試驗重復3次。

圖2 左旋多巴染色黑素細胞(×400)

圖3 S－100抗體染色黑素細胞(×400)

圖1 原代黑素細胞(×200)

1.2.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 黑素細胞的培養(yǎng)與鑒定 原代黑素細胞大多胞體圓而小,胞漿透明,呈現(xiàn)2個對稱的突起；較少數(shù)細胞胞體大且呈多角形,其胞漿內(nèi)可見色素顆粒,有3個或3個以上的樹突(圖1)。經(jīng)左旋多巴染色鑒定,鏡下可見胞漿及樹突被染成灰棕色或棕褐色(圖2)。再經(jīng)S－100免疫細胞化學染色鑒定鏡下見細胞胞漿內(nèi)著色,呈棕黃色或棕褐色(圖3)。以上兩種鑒定均表明染色結(jié)果為陽性,證實為黑素細胞。

2.2 芍藥苷對黑素細胞生物活性的影響 芍藥苷能促進黑素細胞的增殖,且在較高濃度(100 μg/mL)時對細胞無明顯毒性作用。細胞增殖率隨芍藥苷濃度升高而增強,并于10 μg/mL時上升到最高。5 μg/ mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL濃度組的芍藥苷和補骨脂素均具有顯著的促細胞增殖能力,與空白對照組相比有顯著性差異(P＜0.05)。見表1。

10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL濃度組的芍藥苷顯示出上調(diào)酪氨酸酶的活性,與空白對照組相比有顯著性差異(P＜0.05)。并于10 μg/mL時,促進作用最強。5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL濃度組的補骨脂素亦顯示出上調(diào)酪氨酸酶的活性的作用,與空白對照組相比有顯著性差異(P＜0.05)。見表2。

芍藥苷組在濃度為20 μg/mL、50 μg/mL時顯著的促進黑素合成,與空白對照組相比有顯著性差異(P＜0.05)。50 μg/mL是芍藥苷組的最佳作用濃度。10 μg/mL、20 μg/mL濃度組的補骨脂素顯著促進黑素合成,并于20 μg/mL濃度作用強度最佳。見表3。

表1 不同濃度的中藥單體組與空白對照組黑素細胞增殖活性的比較

表2 不同濃度的中藥單體組與空白對照組酪氨酸酶活性的比較

表3 不同濃度的中藥單體組與空白對照組黑素合成的比較

2.3 芍藥苷對黑素細胞遷移的影響 本次遷移的實驗濃度選擇10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL 3組。測定結(jié)果如下(表4,圖4～8)。20 μg/mL的芍藥苷組具有顯著地促進黑素細胞遷移能力,與空白對照組相比有顯著性差異(P＜0.05)。補骨脂素組在10 μg/ mL、20 μg/mL、50 μg/mL 3個濃度均顯著地促進黑素細胞遷移,與空白對照組相比有顯著性差異(P＜ 0.05)。其中補骨脂素在濃度20 μg/mL時其作用強度最高(表4,圖9～11)。

表4 不同中藥單體組與空白對照組黑素細胞遷移的比較

圖4 無細胞組(HE,×40)

圖5 空白對照組(HE,×40)

圖6 10 μg/mL芍藥苷組(HE,×40)

圖7 20 μg/mL芍藥苷組(HE,×40)

圖8 50 μg/mL芍藥苷組(HE,×40)

圖9 10 μg/mL補骨脂素(HE,×40)

圖10 20 μg/mL補骨脂素(HE,×40)

圖11 50 μg/mL補骨脂素(HE,×40)

3 討論

中藥白芍在黃褐斑和白癜風這兩種色素代謝相反的病種中均被廣泛使用。但這種中藥是通過何種機制作用于色素性疾病尚不清楚。目前許多關于白芍對酪氨酸酶活性影響的研究結(jié)果截然不同。既往研究顯示白芍對酪氨酸酶活性起促進作用；涂彩霞等5研究發(fā)現(xiàn),白芍無明顯上調(diào)酪氨酸酶活性的作用；雷鐵池等6研究發(fā)現(xiàn)白芍對酪氨酸酶活性有高濃度抑制和低濃度激活的作用。以上文獻顯示不同提取方法及不同藥物濃度致其實驗結(jié)果差異較大,中藥成分較為復雜,而中藥單體的純度較高,作為實驗對象更科學。芍藥苷是一種單萜類糖苷化合物,具有抗自由基損傷,抑制細胞內(nèi)鈣超載和抗神經(jīng)毒性等活性,體內(nèi)實驗證明其有降低血液黏度、改善微循環(huán)、抗氧化等多種生物學效應,并且毒副作用較小。2本實驗選擇白芍的主要單體芍藥苷進行實驗,并選取補骨脂素作為陽性對照,以作比較。

本實驗結(jié)果顯示芍藥苷能促進黑素細胞增殖,并在較高濃度時細胞仍生長較好,并能上調(diào)酪氨酸酶活性,且作用強度與補骨脂素相似,無統(tǒng)計學差異。既往張美華等7觀察48味中藥對體外培養(yǎng)鼠黑素瘤細胞黑素形成的影響,發(fā)現(xiàn)白芍對黑素合成無明顯影響。而本實驗發(fā)現(xiàn)芍藥苷能促進黑素的合成。另有李劍等8研究表明濃度為5～20 μg/mL的芍藥苷可促進黑素細胞增殖,濃度為20 μg/mL的芍藥苷顯示出對黑素細胞酪氨酸酶活性和黑素合成均有上調(diào)的作用。與本實驗結(jié)果部分相符。補骨脂作為臨床治療白癜風的常用藥,其對黑素細胞增殖活性、酪氨酸酶活性、黑素合成的促進作用已被許多實驗所證實。9,10本實驗中作為陽性對照的補骨脂素在促進黑素細胞增殖,上調(diào)酪氨酸酶活性,促進黑素合成方面均有顯著作用,與既往文獻報道相符。本實驗得出芍藥苷在一定濃度能促進黑素細胞的生物活性,但未檢測出抑制黑素細胞生物活性的作用,猜測可能與藥物濃度的選擇有關,今后可選擇多些濃度點,進一步完善實驗。

根據(jù)臨床觀察,在白癜風治療起效初期,多數(shù)患者皮損在毛囊周圍先形成色素島,提示毛囊外毛根鞘中的黑素細胞遷移與色素島的形成密切相關。11Norris等12也指出黑素細胞的移行與黑素合成在白癜風的復色過程中有同樣重要的作用。本研究使用Transwell小室檢測體外培養(yǎng)的黑素細胞遷移能力。Transwell小室,即遷移小室,是一種特殊的實驗裝置。用具有通透性的聚碳酸酯膜將培養(yǎng)系統(tǒng)分隔為上室和下室,從而研究下室培養(yǎng)液中成分對上室內(nèi)細胞生長、運動的影響。Transwell現(xiàn)已廣泛用于細胞趨化、細胞遷移和細胞侵襲等多方面的研究。13本實驗發(fā)現(xiàn), 20 μg/mL的芍藥苷組能顯著促進黑素細胞遷移。既往馬慧群等14研究顯示,補骨脂、白芷等可促進黑素細胞遷移和黏附。與本實驗結(jié)果相符。綜合本實驗所得結(jié)合相關文獻,我們認為白芍的主要單體芍藥苷能在多方面促進黑素細胞的生物學活性,并且在一定濃度時能促進黑素細胞的遷移,由此推測白芍中影響黑素細胞的主要活性成分是芍藥苷單體。以上實驗結(jié)果為中藥單體的提純提供了實驗依據(jù),并為色素性疾病的治療提供新的思路。

1賈靜.中醫(yī)藥治療白癜風的近況.中醫(yī)藥信息,2003,20(2):16－20.

2鄭世存,李曉宇,歐陽兵,等.芍藥苷藥理作用研究新進展.中國藥物警戒,2012,9(2):100－103.

3 Yoshida H,Kunisada T,Grimm T,et al.Review:melanocyte migration and survival controlled by SCF/c－kit cxpression.J Invest Dermatol Symp Proc,2001,6(1):1－5.

4朱堅勇,呂中法.堿性成纖維細胞生長因子和內(nèi)皮素－1體外協(xié)同培養(yǎng)正常人黑素細胞.中國皮膚性病學雜志,2011,25 (7):535－537.

5涂彩霞,劉之力,任鳳,等.47種中藥對酪氨酸酶活性的影響及酶動力學的研究.中國麻風皮膚病雜志,2006,6(22):456－458.

6雷鐵池,朱文元,夏明玉,等.89味中藥乙醇提取物對酪氨酸酶活性的上調(diào)作用.臨床皮膚科雜志,1999,28(3):147－149.

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13周云飛,張愛華,劉文虎,等.Transwell模擬生物屏障.北京生物醫(yī)學工程,2009,6(28):657－660.

14馬慧群,張憲旗,牟寬厚,等.單味中藥對黑素細胞黏附和遷移的影響.中國皮膚性病學雜志,2004,18(9):526－527.

(收稿:2014－03－26 修回:2014－06－03)

Effects of paeoniflorin on biological activity and migration of human melanocytes

WANG Yi-chun,LIN Xin-yu,WANG Fang,et al.Department of Dermatology,Sichuan Academy of Medical Sciences＆Sichuan Provincial People’s Hospital,Chengdu,610072

Objective:To determine the effects of paeoniflorin on biological activities and migration of melanocytes.Methods:A melanocytes culture system was established and proliferation activity,tyrosinase activity,melanogenesis and migration were detected by MTT,L－DOPA,NaOH method and transwell assay respectively.Results:The paeoniflorin improved the melanocytes proliferation and tyrosinase activity,in which the effects were the most obvious at the concentration of 10 μg/mL.The paeoniflorin promoted the synthesis of melanin,which was the most obvious at the concentration of 50 μg/mL.Paeoniflorin promoted the migration of melanocytes obviously at the concentration of 20 μg/mL.There were significant differences between the paeoniflorin groups and the control groups(P＜0.05).Conclusion:The paeoniflorin is the principal active component of radix paeoniae alba that promoting the migration of melanocytes.

paeoniflorin；psoralen；melanocytes

四川省衛(wèi)生廳資助課題(編號:110219)

四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院皮膚病性病研究所,四川成都,610072

?通信作者