周騰飛，伍 林，秦曉蓉，童 琨，童 玲，胡 適，秦 悅，易德蓮，劉郭飛，李 丹

(1.武漢科技大學(xué) 應(yīng)用化學(xué)研究所，湖北 武漢 430081；2.武昌理工學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430223)

SOD是一種自由基清除劑，能專一地清除超氧陰離子自由基，對治療因超氧陰離子自由基引起的各種疾病都有一定的療效，有明顯的抗輻射、防曬效果，同時還可以抑制心腦血管疾病。

西葫蘆組織中含有豐富的SOD，但直接提取時產(chǎn)量和純度偏低，因此要研究西葫蘆產(chǎn)生SOD的分子機(jī)理，從西葫蘆組織中提取高質(zhì)量的RNA十分重要[1]。但西葫蘆組織中還富含多糖多酚類物質(zhì)，造成RNA的提取很困難。從植物中提取RNA的方法雖然很多，因不同組織化學(xué)組分的異質(zhì)性，還沒有一種適合于所有植物組織RNA的提取方法，需根據(jù)自身材料特點進(jìn)行探究。作者在此對一步法[2]、尿素/氯化鋰法[3]、熱酚法[4]、LUG法[5]等4種方法進(jìn)行對比研究，建立了一種適合西葫蘆組織RNA提取的改進(jìn)的CTAB方法。

1 實驗

1.1 材料、試劑與溶液

西葫蘆從青山區(qū)建設(shè)鄉(xiāng)大棚基地移植，放在實驗室培養(yǎng)，實驗時即取即用。

CTAB，Tris，EDTA，NaCl，SDS，β-巰基乙醇，PVP-K30，氯仿-異戊醇(24∶1)，水飽和酚，2.0 mol·L-1醋酸鈉，DEPC水，70%酒精。

所有溶液均用0.1%DEPC水配制。

CTAB提取緩沖溶液：將2%CTAB、100 mmol·L-1Tris-HCl、25 mmol·L-1EDTA、2.0 mol·L-1NaCl混合均勻后滅菌。使用前加入終濃度為2%的β-巰基乙醇和2%的PVP-K30。

SSTE緩沖溶液：1.0 mol·L-1NaCl、0.5% SDS、1.0 mmol·L-1EDTA混合均勻滅菌后使用。

1.2 儀器

玻璃器皿、研缽、碾槌在180 ℃烘烤過夜；槍頭用DEPC水浸泡4 h，然后滅菌，烘箱烘干；電泳槽先用3%的雙氧水浸泡1 h，然后再用DEPC水浸泡過夜。

1.3 總RNA的提取

1.3.1 提取方法的比較

對比研究一步法、尿素/氯化鋰法、熱酚法、LUG法提取西葫蘆葉的RNA的質(zhì)量和產(chǎn)量，建立了新的RNA提取方法即改進(jìn)的CTAB法。

1.3.2 改進(jìn)的CTAB法提取RNA步驟

在預(yù)冷的研缽中加入2 g樣品、0.3 g PVP-K30，研磨，每個研缽中加30 μLβ-巰基乙醇、15 mL CTAB提取緩沖溶液，轉(zhuǎn)移至離心管，混合均勻；在65 ℃水浴中加熱5 min，其間輕輕搖動，向混合物中加入3 mL pH值為4.0的2.0 mol·L-1醋酸鈉溶液和15 mL水飽和酚輕輕混勻，再加3 mL氯仿-異戊醇，于13 ℃、15 000 g離心10 min；向上清液中加入等體積的氯仿-異戊醇，于13 ℃、15 000 g離心10 min；再向上清液中加入等體積冷處理過的異丙醇，混勻，置于冰上沉淀20 min，于4 ℃、25 000 g離心10 min；向沉淀中加入1 mL 70%的乙醇(注意不要攪動)，于4 ℃、25 000 g離心10 min；再向沉淀中加入1 mL無水乙醇，于4 ℃、25 000 g離心10 min，加入 500 μL SSTE緩沖溶液溶解沉淀，加氯仿-異戊醇(體積比1∶1)抽提1次；上清液轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，加入等體積冷處理過的異丙醇，然后置于冰上20 min，于4 ℃、20 000 g離心15 min；沉淀先后用400 μL 70%乙醇、400 μL無水乙醇洗滌，倒掉乙醇，加50 μL DEPC水溶解。

1.4 總RNA分析

RNA的質(zhì)量和數(shù)量用230 nm、260 nm和280 nm處的紫外吸收值來評定：A260/230值用來判定提取的RNA中是否有多酚和多糖的污染，A260/280值用來判定提取的RNA中是否有蛋白質(zhì)的污染。提取的總RNA樣品在1.2%的瓊脂糖凝膠上電泳，Goldview染色，在紫外燈下觀察RNA的完整度。

1.5 RT-PCR

cDNA用 RevertAidTMFirst Strand cDNA synthesis Kit (M-MuLV，F(xiàn)ermentas，Canada)來合成，PCR采用Cu/Zn-SOD基因的簡并引物，反應(yīng)條件為：94 ℃處理3 min，然后6個循環(huán)，變性溫度94 ℃處理30 s，延伸溫度72 ℃處理45 s，退火溫度從63 ℃ 30 s開始，每個循環(huán)降低1 ℃；緊接著35個循環(huán)，變性溫度94 ℃處理30 s，退火溫度58 ℃處理30 s，延伸溫度72 ℃處理45 s；最后終極延伸72 ℃處理10 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 西葫蘆RNA的提取結(jié)果

用5種方法提取西葫蘆葉中RNA的電泳結(jié)果見圖1，每個泳道RNA上樣量為3.5 μg。

1.一步法 2.尿素/氯化鋰法 3.熱酚法4.改進(jìn)的CTAB法 5.LUG法圖1 5種方法提取西葫蘆葉中RNA的電泳結(jié)果Fig.1 RNA Electrophoretogram of Cucurbita pepo leaf extracted with five different methods

由圖1可知，用一步法、尿素/氯化鋰法、熱酚法、LUG法等4種方法不能提取高質(zhì)量的RNA；用改進(jìn)的CTAB法，RNA樣品在瓊脂糖凝膠上展示了完整的28S和18S兩條RNA鏈，并且28S rRNA的亮度大約是18S rRNA的2倍，說明提取的RNA沒有或者很少降解。A260/230值為2.08、A260/280值為2.0，說明提取的RNA中沒有多酚、多糖、蛋白質(zhì)的污染，是高質(zhì)量的RNA，RNA產(chǎn)量為210 μg·g-1鮮質(zhì)量。RT-PCR的結(jié)果經(jīng)過測序之后，在GenBank數(shù)據(jù)庫中經(jīng)過NCBI-BLAST比對，與印度南瓜的同源性達(dá)89%。用改進(jìn)的CTAB法從西葫蘆果肉中也獲取了高質(zhì)量的RNA，表明改進(jìn)的CTAB法可以有效提取西葫蘆組織中的RNA。

2.2 討論

植物RNA提取中最主要的問題就是RNA的降解和污染。西葫蘆組織中富含多糖、多酚以及次級代謝產(chǎn)物，嚴(yán)重妨礙RNA的提取，尤其是多糖和RNA有相似的生物化學(xué)特性，會與RNA形成凝膠狀的材料進(jìn)而與RNA共沉淀，干擾RNA的產(chǎn)量和質(zhì)量[6-7]。因此，有效地移除污染物并使RNase失活可以保證RNA的質(zhì)量。

一步法、尿素/氯化鋰法、熱酚法、LUG法等4種方法均不能提取高質(zhì)量的未降解的RNA，研究并建立了一種新的RNA提取方法即改進(jìn)的CTAB法：以CTAB和SDS裂解細(xì)胞壁；以異丙醇代替氯化鋰沉淀RNA；以高濃度的NaCl(1.0～2.5 mol·L-1)和醋酸鈉移除多糖[8]；依據(jù)PVP-K30可以和多酚類物質(zhì)通過氫鍵形成復(fù)合物的特性，從勻漿液中移除多酚類物質(zhì)[9]；以β-巰基乙醇作為還原劑抑制多酚化合物的氧化成醌，避免和RNA共沉淀[10-11]，同時破壞二硫鍵來使RNase失活[9]。

改進(jìn)的CTAB法在一開始就抑制了RNase的活性，并且在RNA提取全過程中都有RNase抑制劑的存在；提取過程全程低溫，從而降低RNase的活性，并且酚類化合物不和核酸反應(yīng)，在第一步離心時就和其它碎片一起沉淀[12]；在CTAB提取緩沖溶液中加入2.0 mol·L-1NaCl、在SSTE緩沖溶液中加入1.0 mol·L-1NaCl來移除多糖類物質(zhì)；以異丙醇代替氯化鋰沉淀RNA，沉淀時間大幅縮短，提取全程只需2 h，大大降低了RNA降解的可能性。用該方法從西葫蘆葉和果肉中都提取出了高質(zhì)量的RNA。

3 結(jié)論

(1)對比研究了一步法、尿素/氯化鋰法、熱酚法、LUG法等4種方法，建立了一種適合西葫蘆組織RNA提取的改進(jìn)的CTAB方法。用該方法從西葫蘆葉中提取的RNA在瓊脂糖凝膠電泳上很清楚顯示出28S和18S兩條鏈，A260/280值為2.08、A260/230值為2.0，表明提取的RNA沒有多酚、多糖、蛋白質(zhì)污染；RNA產(chǎn)量為210 μg·g-1鮮質(zhì)量；對RT-PCR的結(jié)果進(jìn)行測序，通過NCBI-BLAST比對可知，與印度南瓜的同源性達(dá)89%。用該方法從西葫蘆果肉中也獲取了高質(zhì)量的RNA。改進(jìn)的CTAB法全程只需2 h，不用液氮、亞精胺、二硫蘇糖醇、蛋白酶K等試劑，不僅有效、經(jīng)濟(jì)，而且從西葫蘆組織中提取出來的RNA的質(zhì)量和產(chǎn)量均很高。

(2)用改進(jìn)的CTAB法從西葫蘆莖和南瓜的根、莖、葉、果實中也提取出了高質(zhì)量的RNA。

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