劉俊紅，洪 軍，趙彩霞，陸友云

（河南城建學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，河南 平頂山 467036）

0 引言

進(jìn)入21 世紀(jì)以來，人類在能源、資源、環(huán)境等方面面臨著越來越嚴(yán)峻的挑戰(zhàn).中國的情況尤為突出[1-2]：一方面，中國的石油對外依存度已經(jīng)過半，大部分石油消費要靠進(jìn)口，國家的能源安全和經(jīng)濟(jì)安全無法得到保證；另一方面，大量使用礦石燃料又嚴(yán)重污染環(huán)境.乙醇燃料無疑是化石類能源的最佳替代能源.生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為生物乙醇工藝無論是從可行性、清潔性抑或是經(jīng)濟(jì)性來看都具有可大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用的前景[3-4].

燃料乙醇的發(fā)展經(jīng)歷了兩個階段：淀粉質(zhì)原料和纖維素原料.前者的發(fā)展由于糧食供應(yīng)問題受到限制，后者的發(fā)展是利用農(nóng)業(yè)廢棄物為原料展開的，屬于清潔、可再生能源，其中以秸稈為原料進(jìn)行的生物乙醇的研究受到廣泛關(guān)注.秸稈結(jié)構(gòu)中，纖維素和半纖維素被木質(zhì)素層層包裹，降低了酶的可及性[5]，在同樣的處理條件下，酶解效率偏低；麩皮是面粉加工的剩余物，含有粗纖維和淀粉，經(jīng)酶解后可得到還原糖，進(jìn)而發(fā)酵制備乙醇.麩皮來源廣、成本低，為生物乙醇發(fā)展提供了豐富的原料.

筆者通過研究溫度、時間、pH、PBS（Phosphate Buffered Saline，磷酸緩沖液）的用量及淀粉酶和纖維素酶（以下簡稱雙酶）的配比等因素對雙酶降解麩皮還原糖得率的影響，進(jìn)而找到雙酶降解的最佳條件，以利于研究后續(xù)的乙醇發(fā)酵生產(chǎn)條件.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

麩皮：市售，烘干后用粉碎機(jī)粉碎，過60 目篩密封保存.干燥時使用鼓風(fēng)干燥箱，溫度設(shè)定為70℃，避免過高溫度[6].

1.2 試驗器材與試劑

QE-100 屹立高速中藥粉碎機(jī)：浙江屹立工貿(mào)有限公司；LDZX-75KBS 蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；HWS28 型電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；KDC-1044 低速離心機(jī)：科大創(chuàng)新股份有限公司；721 紫外可見分光光度計：北京普新通用儀器有限公司、PHSJ-3F 型pH 計：上海精密科學(xué)儀器有限公司.

3，5-二硝基水楊酸（化學(xué)純）：上海科豐化學(xué)試劑有限公司；NaOH（分析純）：萊陽市雙雙化工有限公司；酒石酸鉀鈉（分析純）：天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；苯酚（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；亞硫酸鈉（分析純）：洛陽市化學(xué)試劑廠；鹽酸（分析純）：洛陽市化學(xué)試劑廠；α-淀粉酶：和氏璧生物技術(shù)有限公司，2 000-5 000 U/g；纖維素酶：和氏璧生物技術(shù)有限公司，20 000 U/g；糖化酶：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，100 000 U/g；磷酸氫二鉀（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心；磷酸二氫鉀（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心.

1.3 方法

1.3.1 試劑配制

DNS 試劑：將6.3 g 3，5-二硝基水楊酸溶于262 mL 的2 mol/L 的NaOH 中，加到500 mL 含有182 g 的酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5 g 苯酚和5 g 亞硫酸鈉，充分?jǐn)嚢枞芙?，冷卻后加水定容到1 000 mL，貯藏于棕色瓶中，避光保存，備用.

1.3.2 單因素與正交試驗[6-8]

每次稱取2 g 過60 目篩的麩皮，初始液固比為5，加入10 mL 1.5%的稀鹽酸，在120 ℃下預(yù)處理80 min 后，將試樣取出冷卻至室溫，加磷酸鹽緩沖液（PBS：0.2 mol/L，pH 7.2）并用稀鹽酸調(diào)pH值，加入淀粉酶、纖維素酶，反應(yīng)結(jié)束后加入糖化酶40 ℃反應(yīng)1 h.分析溫度、時間、pH 值、PBS 用量、雙酶配比等因素對酶解糖化率的影響，得出麩皮酶解的最佳工藝條件.

①溫度的選擇：雙酶配比3∶3，加入8 mL 磷酸鹽緩沖液，調(diào)整體系的pH 值至4.5，在30～70 ℃（溫度增量為10 ℃）之間處理40 h.

②反應(yīng)時間的確定：雙酶配比3∶3，加入8 mL磷酸鹽緩沖液，調(diào)整體系的pH 值至4.5，50 ℃進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)時間20～60 h，時間梯度10 h.

③pH 值的影響：雙酶配比3:3，加入8 mL 磷酸鹽緩沖液，調(diào)整體系pH 值至3.5～5.5，梯度為0.5，50 ℃反應(yīng)40 h.

④PBS 用量：雙酶配比3∶3，加入4～20 mL 的磷酸鹽緩沖液，增量為4 mL，調(diào)整體系pH 值至4.5，50 ℃反應(yīng)40 h.

⑤雙酶比例：雙酶配比依次為3∶3、3∶2、3∶1、1∶3、2:3，加入8 mL 的磷酸鹽緩沖液，調(diào)整體系pH值至4.5，50 ℃反應(yīng)40 h.

反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液在3 600 r/min 下離心7 min，吸取上清液進(jìn)行一定比例稀釋（吸取1 mL 的反應(yīng)液，加入6～10 mL 的蒸餾水）后，取2 mL 稀釋液到小試管，將2 mL DNS 試劑加入小試管，充分混勻后沸水浴7 min，冷卻后測550 nm 處的吸光值.在單因素試驗的基礎(chǔ)上設(shè)計正交試驗，得出麩皮酶解的最佳工藝條件.

1.3.3 分析方法

測吸光值采用DNS 進(jìn)行顯色，吸取離心液的上清液進(jìn)行一定比例稀釋后，取2 mL 稀釋液到小試管，將2 mL DNS 試劑加入小試管，充分混勻后沸水浴7 min，冷卻后測550 nm 下的吸光值，記錄試驗數(shù)據(jù).

還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=7.108 6x-0.096 5（x 為葡萄糖含量mg/mL，y 為OD 值）；

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 溫度對還原糖得率的影響

預(yù)處理溫度對還原糖得率的影響見圖1.

圖1 溫度對麩皮酶解制備還原糖的影響

由圖1 可以看出，隨著溫度的逐漸升高，酶解糖化率隨之增大，當(dāng)溫度達(dá)到40 ℃時，酶解總糖化率達(dá)到25.64%，即為該反應(yīng)體系酶的最適反應(yīng)溫度.酶的最適溫度是隨溫度上升酶活性的增強(qiáng)和酶的變性失活兩方面綜合作用的結(jié)果.溫度既影響化學(xué)反應(yīng)速度，又影響酶的穩(wěn)定性和空間構(gòu)象，進(jìn)而影響酶的生物活性.當(dāng)溫度繼續(xù)上升時，酶的活性下降，酶解糖化率開始下降.

2.1.2 時間對還原糖得率的影響

預(yù)處理時間對還原糖得率的影響見圖2.

圖2 時間對麩皮酶解制備還原糖的影響

圖2 顯示，隨著時間的延長，酶解糖化率隨之發(fā)生變化，反應(yīng)50 h 后，總糖化率達(dá)到30.1%，以后隨著時間的延長糖化率逐漸下降.因為隨著反應(yīng)時間的延長酶降解副產(chǎn)物的增加抑制了酶的生物活性.對于某一定用量的酶，糖化率與時間呈正相關(guān)性，這與酶促反應(yīng)的動力學(xué)方程基本一致.在反應(yīng)開始的前段時間內(nèi)，沒有反饋抑制作用，反應(yīng)速率加快；當(dāng)反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行時，隨著糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的不斷增加，反饋抑制增強(qiáng)，正向反應(yīng)的速率降低[9].

2.1.3 pH 對還原糖得率的影響

溶液pH 對還原糖得率的影響見圖3.

圖3 表明，試樣pH 值對雙酶糖化反應(yīng)有顯著的影響，當(dāng)試樣pH 4.5 時，酶解糖化率達(dá)到了20.79%，pH 4.5 為該反應(yīng)體系酶的最適pH.過酸或過堿可以使酶的空間結(jié)構(gòu)破壞，引起酶構(gòu)象的改變，酶活性喪失.當(dāng)pH 改變不很劇烈時，酶雖未變性，但活力受到影響.pH 影響了底物的解離狀態(tài)，或者使底物不能和酶結(jié)合，或者結(jié)合后不能生成產(chǎn)物；pH 影響酶分子活性部位上有關(guān)基團(tuán)的解離，從而影響與底物的結(jié)合或催化，使酶活性降低；也可能影響到中間絡(luò)合物的解離狀態(tài)，不利于催化生成產(chǎn)物[10].

圖3 pH 對麩皮酶解制備還原糖的效果影響

2.1.4 PBS 用量對還原糖得率的影響

PBS 用量對還原糖得率的影響見圖4.

圖4 PBS 用量對麩皮酶解制備還原糖的影響

由圖4 可以看出，隨著PBS 用量的逐漸增大，酶解糖化率隨之增大，當(dāng)PBS 用量達(dá)到8 mL 時，此時酶解總糖化率達(dá)到22.83%，即8 mL 為該反應(yīng)體系酶的最適PBS 用量.當(dāng)PBS 用量繼續(xù)增大時，酶解糖化率開始下降.隨著PBS 量的增大，預(yù)處理的糖化液稀釋度增大，不利于酶與底物的反應(yīng)，進(jìn)而使酶解效率下降.在該反應(yīng)中加入PBS后，底物濃度和酶濃度被等程度稀釋.該過程的變化是由PBS 用量的改變引起的，因此，引起還原糖得率變化的直接原因是PBS.

2.1.5 雙酶配比（淀粉酶/纖維素酶）對麩皮酶解制備還原糖效果的影響（圖5）

圖5 顯示，雙酶配比對糖化率的影響不是太顯著，說明兩種酶間相互促進(jìn)作用不太明顯，可結(jié)合經(jīng)濟(jì)成本進(jìn)行控制.當(dāng)雙酶配比為3∶1 時，糖化率最低.隨著雙酶配比的變化，糖化率緩慢升高.當(dāng)雙酶配比為2∶3 時，酶解糖化率最大，達(dá)到29.71%.

圖5 雙酶配比對麩皮酶解制備還原糖的影響

2.2 正交試驗

在單因素試驗及其結(jié)果分析的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗設(shè)計，得出麩皮酶解制備還原糖的最佳工藝條件.正交試驗安排以及結(jié)果與分析見表1 和表2.

表1 因素與水平

表2 正交試驗結(jié)果與分析

對正交試驗的直觀分析顯示：16 個工藝組合中A4B2C3D1E4為酶解的優(yōu)化工藝組合，即當(dāng)溫度60 ℃、時間40 h、pH 5.00、PBS 用量4 mL、雙酶配比1∶3 時，還原糖得率為36.72%.

極差分析結(jié)果表明：A4B2C2D1E2的條件下，即當(dāng)溫度60 ℃、時間40 h、pH 4.50、PBS 用量4 mL、雙酶配比3∶3 時，還原糖的得率為37.23%，高于正交試驗的直觀分析值.因此，酶解麩皮水解液制備還原糖的最佳工藝條件為A4B2C2D1E2.

3 結(jié)論

以面粉加工的剩余物——麩皮為原料，研究了溫度、時間、pH 值、PBS 用量和雙酶配比等因素對麩皮酶解糖化的影響，通過正交試驗對酶解工藝進(jìn)行了優(yōu)化.結(jié)果顯示：溫度60 ℃、時間40 h、pH 4.50、PBS 用量4 mL、雙酶配比3∶3 為麩皮酶解制備還原糖的最佳工藝條件.以麩皮為原料進(jìn)行生物乙醇的生產(chǎn)，不失為緩解能源短缺、實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展的有效途徑之一.

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