范付華，夏輝，王振啟，陳洪國

（1.湖北科技學院核技術與化學生物學院，湖北咸寧437100；2.咸寧職業(yè)技術學院，湖北咸寧437000）

0 引言

桂花（Osmanthus fragrans Lour.）為木犀科（Oleaceae）木犀屬（Osmanthus Lour.）植物，是我國特有的常綠小喬木或灌木經(jīng)濟樹種，原產(chǎn)于我國長江流域至華南、西南各地，在長期的人工栽培和演化過程中，形成了歷史上著名的桂花五大產(chǎn)區(qū)：江蘇蘇州、浙江杭州、湖北咸寧、四川成都和廣西桂林.桂花栽培范圍廣，自然環(huán)境復雜，由此也產(chǎn)生了許多的性狀變異，形成了豐富的品種資源.長期以來，科研工作者以形態(tài)學基礎對桂花品種進行分類，但由于對品種概念、分類方法及標準的認識不盡相同，20世紀80年代以后，有多人提出了不同的分類標準［1－4］，導致了部分桂花品種分類較為混亂，記載不統(tǒng)一.咸寧作為“中國桂花之鄉(xiāng)”，從桂花數(shù)量、產(chǎn)量到品種都保持全國領先地位，對咸寧桂花遺傳多樣性的研究將有助于其品種及其相關產(chǎn)業(yè)的長遠發(fā)展.

分子標記技術已廣泛用于植物遺傳多樣性分析、親緣關系和品種鑒定。盡管利用分子標記技術研究桂花親緣關系、品種分類等已見諸多報道［5－10］，其中咸寧地區(qū)部分種質親緣關系的分析也有涉及［7，9］，但所選品種較少，不足以反映咸寧桂花品種遺傳多樣性的實質.本研究中以咸寧地區(qū)48份桂花主要栽培品種為供試材料，利用ISSR技術分析鑒定，旨在進一步揭示咸寧地區(qū)桂花親緣關系和品種多樣性，為地方桂花資源保護和遺傳改良提供更充實的理論基礎.

1 材料與方法

1.1 材料 選取咸寧地區(qū)48份桂花主要栽培品種作為研究對象。試驗材料均采集于湖北咸寧潛山國家森林公園。采集幼嫩葉片，液氮處理后迅速放入－80℃超低溫冰箱保存.試驗所用的材料如表1.

表1 供試桂花品種名稱及其資源類別

1.2 DNA的提取及檢測 取超低溫保存下的幼嫩桂花葉片，利用DNA secure Plant Kit（DP320－02）試劑盒（天根）提取DNA.經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量完好后，用TE緩沖液稀釋DNA至約20ng／μL，放入－20℃冰箱備用.

1.3 PCR擴增及檢測 參照范付華［11－12］方法，稍作修改.選取UBC公司公布的50條ISSR引物序列.篩選出合適的引物及每個引物的最佳退火溫度.最適ISSR擴增反應體系為（15μL）：7.5μL Mix，1.2μL引物（10μmol／L），1.5μL模板DNA和4.8μL ddH2O.PCR反應程序為94℃預變性4min；94℃變性1min，復性1min，溫度隨引物而定（表2），72℃延伸1min，30個循環(huán)；最后72℃延伸7min.ISSR擴增產(chǎn)物，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測.

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析 每個引物重復擴增2次，選擇可重復且清晰可見的譜帶進行統(tǒng)計.將擴增所得到的譜帶按“引物號－片段長度”進行指紋記錄，以按譜帶的有無分別賦值“1”和“0”建立數(shù)據(jù)庫，利用NTSYSpc 2.10e軟件計算供試材料間的相似性系數(shù)，并構建親緣關系樹狀圖.

2 結果與分析

2.1 ISSR擴增多態(tài)性 采用篩選出的11條擴增穩(wěn)定性高、譜帶清晰的ISSR引物，對48份供試桂花材料進行PCR擴增分析.結果表明（表2）：所有11條引物共擴增出清晰可辨的譜帶81條，平均每個引物可擴增7.4條，其中多態(tài)性譜帶共70條，多態(tài)性比率達到86.4%；擴增出譜帶最多的引物為825，共10條帶；819擴增的譜帶最少，僅為5條；823、842和844擴增的譜帶多態(tài)性比率都達到了100%；引物891獲得多態(tài)性譜帶的比率最低，僅為71.4%.所有引物擴增出的DNA片段大小大多在250～2 000bp之間，并且譜帶清晰（圖1），可以用于桂花親緣關系及遺傳多樣性分析.上述ISSR引物檢測到較高的多態(tài)性譜帶比率，說明了桂花品種間的遺傳變異較大.

表2 用于PCR擴增的ISSR引物及其擴增結果

圖1 引物842擴增48份供試材料的電泳圖樣品1～48的含義同表1

2.2 遺傳相似系數(shù)分析 供試材料的SIMQUAL相似系數(shù)在0.46～0.97之間.29號“滿條紅”在湖北咸寧地區(qū)稱作“紅花”，自古享有盛名，是當?shù)爻Ｒ姷钠贩N，其與同為丹桂品種群的22號“大花丹桂”的相似系數(shù)最大，達到了0.97.相似系數(shù)最小的是來自四季桂品種群的3號和6號“小葉四季桂”和“天女散花”與丹桂品種群的24號“平脈紅”，僅為0.46，說明這兩個品種間具有較大的遺傳差異，推測親緣關系較遠.對各個品種群內(nèi)樣品之間的遺傳相似系數(shù)分析，四季桂品種群平均值為0.79，丹桂品種群為0.76，銀桂品種群為0.75，金桂品種群為0.74.由此可知，咸寧地區(qū)四季桂品種群內(nèi)種質間的遺傳差異相對較小，遺傳多樣性不如其他品種群，其中金桂品種群遺傳多樣性相對最為豐富.

2.3 供試桂花品種的聚類 采用UPGMA法對供試桂花品種進行聚類分析，建立樹狀分支圖（圖2）.48份材料在以相似系數(shù)0.75為閾值的情況下被分為5類，第Ⅰ大類包含所有的9個四季桂品種；第Ⅱ類全部為秋季開花的22個品種（包括銀桂、丹桂和金桂品種群）；丹桂12個品種及金桂1個品種聚為第Ⅲ大類.金桂品種群36號“大葉黃”與供試材料遺傳距離較遠，單獨聚為第Ⅳ類；第Ⅴ大類中包括2個丹桂品種“平脈紅”、“朱砂丹桂”和1個金桂品種“叢中笑”.從聚類圖中可見，四季桂品種群與秋桂品種可以明顯分開，而四季桂較之其他品種群童期短、花期長，一年多次開花，說明桂花親緣關系的遠近與其開花習性具有一定的相關性.由圖2可知，四季桂品種單獨被聚為1類，銀桂品種群10個品種聚為1類，丹桂品種群15個品種分別聚入不同的3類，而金桂品種群14個品種被聚入不同的4類.反映了咸寧地區(qū)金桂品種群的遺傳多樣性比其他品種群豐富，這與遺傳相似系數(shù)的結論一致.

圖2 48個咸寧桂花品種的UPGMA聚類分析圖

3 討論

從ISSR引物擴增譜帶的多態(tài)性比率和供試品種間遺傳相似性系數(shù)可知，咸寧地區(qū)桂花品種間具有較大變異，存在豐富的遺傳多樣性，這與長期的自然選擇和人工干預密切相關.咸寧也以其資源的多樣性、栽培的廣泛性、桂花產(chǎn)量和品質的優(yōu)良性于2000年被國家命名為唯一的“中國桂花之鄉(xiāng)”.桂花各品種群平均遺傳相似性系數(shù)依次為四季桂品種群 ＞ 丹桂品種群 ＞ 銀桂品種群 ＞ 金桂品種群，這與李梅等［8］研究結果相似又不完全相同，僅在銀桂和金桂品種群間有所區(qū)別.種群間遺傳多樣性比率顯示咸寧地區(qū)桂花大部分種內(nèi)變異存在于秋桂（金桂、銀桂、丹桂）之間.桂花品種資源遺傳多樣性的分析，為當?shù)胤N質資源管理和育種提供重要參考.

聚類分析結果（圖2）顯示，多季開花的四季桂品種全部聚在一起，與3個秋桂類品種群遺傳距離較遠.基于ISSR分子標記的聚類結果與按傳統(tǒng)形態(tài)學的一級分類標準結果相符，說明開花習性是桂花品種劃分的依據(jù)之一，具有重要的分類學意義.由聚類圖可見，秋桂中各個品種群的大多數(shù)品種可以先聚在一起，部分不同品種群的品種也會聚為一個分支，但多為花色相近的品種，特別是花色為橙紅色的丹桂品種群的品種幾乎聚在1類，而其他品種也是先聚為同一品種群后再與別的品種群有所交集.這與趙小蘭等［13］的同工酶分析、尚富德等［5］的RAPD分析、韓遠記等［7］的AFLP分析，以及李梅等［8］的ISSR分析的結論基本相似，說明將桂花花色作為品種分類標準具有一定合理性，但本研究中金桂與銀桂、金桂與丹桂部分品種往往也聚在一起，因此，僅以花色作為桂花品種分類的二級標準并不能完全反映品種間的親緣關系.綜上所述，今后應以傳統(tǒng)形態(tài)分類學為基礎，結合酶學、分子標記及解剖學等多種分類方法，相互印證［14］，以期提出更科學合理的桂花品種分類系統(tǒng).

ISSR是Zietkiewicz等［15］創(chuàng)建起來的以PCR技術為基礎且不要求預知基因組序列信息的分子標記，該項技術兼具RAPD和SSR優(yōu)點，DNA用量少、多態(tài)性水平高、可重復性好、穩(wěn)定性高，是一種快速、可靠、可提供豐富位點信息的DNA指紋技術［16］，已在多種果樹［17］、林木［18］上得到廣泛應用，在親緣關系和品種鑒定方面有較高的可靠性.本研究中發(fā)現(xiàn)，ISSR標記揭示出桂花不同品種及不同品種群間的多態(tài)性較豐富，存在較明顯的遺傳差異.并非每一個供試桂花品種都具有特征標記，但通過不同的ISSR引物組合，能將所有樣品區(qū)分開，且與蔡宇良等［19］對櫻桃種質資源的分析中認為的隨著引物數(shù)量增加而區(qū)分更多材料的結論一致.對供試材料相似性系數(shù)及聚類顯示，丹桂品種群中22號“大花丹桂”和29號“滿條紅”遺傳差異極小，本研究中可視為同一品種，對于是否是引物太少導致的此類結果，將結合品種的形態(tài)特征，利用更多的分子標記方法進行深入研究.

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