謝樂靜

(深圳羅湖醫(yī)院貴賓病區(qū)，廣東 深圳 518000)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種自身免疫功能紊亂，血清內(nèi)產(chǎn)生抗核抗體(antinuclear antibody，ANA)等多種免疫性抗體，多系統(tǒng)或器官受累的系統(tǒng)性自身免疫性疾病[1]。中青年女性發(fā)病較多見，表現(xiàn)為病程冗長、病情復(fù)雜，若不進(jìn)行積極有效的治療，患者病情將急劇惡化而危及生命。SLE與環(huán)境、免疫、感染、遺傳等多種因素相關(guān)。本研究通過檢測SLE患者外周血內(nèi)纖維膠凝蛋白3(Ficolin-3)的表達(dá)情況，研究其與SLE發(fā)病機(jī)制、組織器官受累的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2010年3月至2012年5月深圳羅湖醫(yī)院收治的SLE患者30例(SLE組)、門診風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)患者30例(RA組)，其中SLE組患者的分類和診斷標(biāo)準(zhǔn)采用美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)1997年制訂的標(biāo)準(zhǔn)[2]。SLE組：男2例、女28例，年齡19～32(26.7±3.4)歲，病程1～102(36.2±22.1)個(gè)月； RA組：男5例、女25例，年齡21～38(32.5±4.3)歲，病程1～101(34.5±21.3)個(gè)月。同期選取健康體檢者30例作為健康對照組,男4例、女26例，年齡17～38(27.7±4.1)歲。三組受試者納入研究前均經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)同意，并簽署知情同意書，且在性別、年齡等基線資料的比較具有可比性。

1.2方法

1.2.1資料采集 采用自制采集表格，嚴(yán)格記錄研究對象入院時(shí)臨床癥狀，根據(jù)SLE疾病活動(dòng)指數(shù)對30例SLE患者病情進(jìn)行評分，其中評分≥5分為活動(dòng)組，評分<5分為非活動(dòng)組。并對SLE患者的ANA、抗ds-DNA抗體、補(bǔ)體、紅細(xì)胞沉降率、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、24 h尿蛋白定量等指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.2儀器與試劑 研究涉及儀器為超低溫冰箱(美國Forma702)，TDL-50b離心機(jī)，TMP電子天平，GNP隔水式恒溫箱，Bio-Rad 680酶標(biāo)儀，1 L量筒。

主要試劑：ANA、抗ENA抗體、抗ds-DNA抗體測定試劑均來自德國歐蒙公司，F(xiàn)icolin-3試劑盒和蒸餾水，均由上海研卉生物科技有限公司提供。

1.2.3實(shí)驗(yàn)室檢測

1.2.3.1常規(guī)項(xiàng)目 SLE患者清晨抽取外周靜脈血10 mL，間接免疫熒光法測定ANA，放射免疫法測定抗ds-DNA抗體，速率散射比濁法測定補(bǔ)體C3、C4，自然沉降法測定紅細(xì)胞沉降率，乳膠增強(qiáng)免疫散射比濁法測定超敏C反應(yīng)蛋白。

1.2.3.2Ficolin-3 三組受試者空腹抽取外周靜脈血5 mL，靜置30 min。設(shè)定離心半徑8 cm，3000 r/min離心15 min后停止，吸取上清液200 μL，EP管中保存于-80 ℃冰箱備用。由冰箱中取出試劑盒，在室溫下靜置平衡30 min。使用蒸餾水將20倍濃縮液稀釋成原倍數(shù)洗滌液，酶標(biāo)包被板分別設(shè)置孔位，標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣本、空白并詳細(xì)記錄。標(biāo)準(zhǔn)孔加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)品，待測空加入10 μL待測樣本，40 μL樣品稀釋液，對照孔空白。封板后37 ℃恒溫箱溫育30 min。拆掉封板膜后棄液體甩干，滴加洗滌液后靜置30 min，棄液。反復(fù)進(jìn)行5次后，拍干[3]。

空白孔僅加入蒸餾水，其他各孔加入酶標(biāo)試劑50 μL，溫育后重復(fù)洗板步驟，再每孔滴入顯色a液50 μL，之后加入顯色b液50 μL，輕輕震蕩混合30 s，37 ℃避光顯色15 min。最后每孔滴加終止液50 μL，以空白孔調(diào)零，終止液滴入15 min后，450 nm波長依次測量各孔吸光度的OD值(光密度值)。

1.3數(shù)據(jù)計(jì)算 采用CurveExpert1.3軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，其中縱軸為吸光度值，橫軸為血清Ficolin-3水平，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值及相對應(yīng)的Ficolin-3濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線得出回歸方程后，將樣本吸光度值代入方程，所得數(shù)據(jù)再乘以樣本稀釋倍數(shù)得到測試樣本Ficolin-3濃度。

2 結(jié) 果

2.1一般情況 參照評分結(jié)果將SLE患者進(jìn)行劃分為：活動(dòng)期18例，非活動(dòng)期12例。30例SLE患者分別伴有不同程度腎損害或血液系統(tǒng)損害，其中15例的患者伴有貧血，12例患者出現(xiàn)補(bǔ)體C3下降，27例患者ANA陽性，16例患者抗SSA抗體陽性，9例患者抗Sm抗體陽性，15例患者抗ds-DNA抗體檢測后結(jié)果≥20%，17例患者紅細(xì)胞沉降率≥20 mm/h，14例患者24 h尿蛋白定量≥0.5 g。

2.2血清Ficolin-3表達(dá)

2.2.1ELISA法檢測血清Ficolin-3的標(biāo)準(zhǔn)曲線 通過CurveExpert1.3軟件分析后，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1),Ficolin-3標(biāo)準(zhǔn)品濃度與吸光度值見表1。其中Ficolin-3為1.5～47.8 mg/L時(shí)，濃度與吸光度值接近直線關(guān)系，并且為正相關(guān)(r=0.95,P=0.00)。直線回歸方程Y=0.0698X+0.0706，r≈1，曲線擬合度較好。

圖1 血清Ficolin-3標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

表1 ELISA檢測Ficolin-3標(biāo)準(zhǔn)品濃度與吸光度值

ELISA：酶聯(lián)免疫吸附測定；Ficolin-3：纖膠凝蛋白3

2.2.2三組外周血清Ficolin-3表達(dá)水平的比較 三組外周血清Ficolin-3水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),RA組和健康對照組Ficolin-3水平均低于SLE組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。SLE組中非活動(dòng)期血清Ficolin-3水平為(33.14±7.52) mg/L，活動(dòng)期為(32.11±6.33) mg/L，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.405，P>0.05)。

表2 SLE、RA、健康對照組血清Ficolin-3水平分析 (mg/L)

SLE：系統(tǒng)性紅斑狼瘡；RA：風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；Ficolin-3：纖膠凝蛋白3；a與SLE組比較，P<0.05

2.2.3血清Ficolin-3表達(dá)與SLE患者臨床癥狀情況分析 30例 SLE患者皮疹、光過敏、口腔潰瘍、關(guān)節(jié)痛、腎損害、漿膜腔積液陽性的Ficolin-3水平與陰性患者比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

表3血清Ficolin-3表達(dá)與SLE患者臨床癥狀情況分析(mg/L)

主要癥狀及實(shí)驗(yàn)室檢查陽性患者例數(shù)Ficolin-3陰性患者例數(shù)Ficolin-3tP皮疹833.19±6.612233.04±6.210.0580.62光過敏733.07±4.012332.04±7.410.3490.89口腔潰瘍338.02±8.212733.96±7.320.9030.41關(guān)節(jié)痛533.44±6.822532.92±7.010.1520.93腎損害1833.54±5.921232.47±7.120.4470.65漿膜腔積液933.66±8.142132.17±6.210.5480.61

Ficolin-3：纖膠凝蛋白3

2.3血清Ficolin-3表達(dá)與SLE患者實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)情況分析 血小板計(jì)數(shù)減少的患者血清內(nèi)Ficolin-3水平高于血小板計(jì)數(shù)正常者(P<0.05)；抗Sm抗體陽性、抗SSA抗體陽性患者Ficolin-3水平均低于抗Sm抗體陰性和抗SSA陰性患者(P<0.05)(表4)。

表4血清Ficolin-3表達(dá)與SLE患者實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)情況分析(mg/L)

主要癥狀及實(shí)驗(yàn)室檢查陽性患者例數(shù)Ficolin-3陰性患者例數(shù)Ficolin-3tP血小計(jì)數(shù)減少738.15±6.312332.09±6.732.179<0.05抗Sm抗體928.79±5.342135.62±5.563.118<0.05抗SSA抗體 1830.76±6.531236.12±6.482.209<0.05

Ficolin-3：纖膠凝蛋白3；SLE：系統(tǒng)性紅斑狼瘡

2.4血清Ficolin-3診斷SLE的可靠性分析 抗Sm抗體和抗ds-DNA分別與Ficolin-3檢測對SLE進(jìn)行性診斷時(shí)，陽性率上升為90.0%(27/30)和86.7%(26/30)，明顯高于單獨(dú)檢測抗Sm抗體和抗ds-DNA抗體(30.0%和50.0%)(P=0.232;P=0.032)，故而聯(lián)合檢測更有利于提高SLE診斷的敏感性。

表5 血清Ficolin-3診斷SLE的可靠性分析

Ficolin-3：纖膠凝蛋白3；SLE：系統(tǒng)性紅斑狼瘡；Ficolin-3≥30 mg/L為陽性

3 討 論

Ficolin-3主要在肝臟膽管上皮細(xì)胞和干細(xì)胞產(chǎn)生，最后分泌到膽管中。肺毛細(xì)血管和支氣管纖毛上皮細(xì)胞可分泌Ficolin-3。近期研究表明，心臟、腦、腎臟、脾臟甚至胰臟和胎盤也具有少量表達(dá)[4]。而本研究通過測試外周血清Ficolin-3表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SLE組顯著高于RA組和健康對照組。但是，研究結(jié)果與國外研究[5]的Ficolin-3水平比較略偏低，這與選取樣本數(shù)較小和血清Ficolin-3表達(dá)水平的地域性差異有關(guān)。Krarup等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，正常人的血清Ficolin-3表達(dá)為20 mg/L，研究與此結(jié)果大體符合，提示血清Ficolin-3的表達(dá)與自身免疫性疾病有關(guān)。另有報(bào)道指出Ficolin-3表達(dá)水平與臨床癥狀不具有相關(guān)性[7]，這一觀點(diǎn)通過本組數(shù)據(jù)也有體現(xiàn)。

部分實(shí)驗(yàn)室指標(biāo),如抗Sm抗體陽性、抗SSA抗體陽性、血小板計(jì)數(shù)等與血清Ficolin-3表達(dá)經(jīng)分析后發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。患者自身血小板減少作為SLE常見的臨床指標(biāo)，部分首發(fā)或者單發(fā)癥狀的患者容易與血液系統(tǒng)疾病混淆[8]。通常情況下SLE臨床表現(xiàn)與自身抗體具有一定關(guān)系，抗ds-DNA抗體與腎臟損害有關(guān)，抗核糖體P蛋白與相關(guān)精神癥狀[9]。在研究中發(fā)現(xiàn)SLE患者血小板異常，表明也與相關(guān)抗體具有相關(guān)性。推測Ficolin-3與血小板相關(guān)抗體的相互作用并參與血小板破壞。Andersen等[10]對升高Ficolin-3水平與溶血、淋巴細(xì)胞減少、Coomb′s實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究，證實(shí)Ficolin-3升高與SLE患者血液系統(tǒng)損害具有關(guān)聯(lián)。

本研究顯示，檢測Ficolin-3對診斷SLE具有一定的價(jià)值，尤其是與抗ds-DNA、抗SSA抗體進(jìn)行聯(lián)合檢測，敏感性將會(huì)比單獨(dú)檢測有所提高?？傊?，膠凝纖維蛋白可能參與了SLE患者發(fā)病，通過聯(lián)合檢查Sm-抗體和抗ds-DNA對診斷SLE具較高的敏感性。

[1] 陳意.男性系統(tǒng)性紅斑狼瘡52例臨床分析[J].中國基層醫(yī)藥，2008，15(8)：1301-1302.

[2] 譚愛國，高明，屈旭亮.系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血基質(zhì)金屬蛋白酶-3檢測及其臨床意義[J].天津醫(yī)藥，2003，31(2)：94-96.

[3] Swigris JJ,Fischer A,Gillis J,etal.Pulmonary and thrombotic manifestati-ons of systemic lupus erythematosus[J].Chest,2008，133(1)：271-280.

[4] Hummelshoj T,Munthe-Fog L,Madsen HO,etal.ComParative study of the human ficolins reveals unique features of ficolin-3(Hakataantigen)[J].Mol Immunol,2008,45(6):1623-1632.

[5] Jensen ML,Honoré C,Hummelsh?j T,etal.Ficolin-2 recognizes DNA and participates in the clearance of dying host cells[J].Mol Immunol,2007,44(5):856-865.

[6] Krarup A,S?rensen UB,Matsushita M,etal.Effect of Capsulation of opportunistic pathogenic bacteria on binding of the pattern recognition molecules mannan-binding lectin,L-Ficolin,and H-Ficolin[J].Infect Immun,2005,73(2):1052-1060.

[7] Irie J,Wu Y,Sass DA,etal.Genetic control of anti-Sm autoantibody production in NOD congenic mice narrowed to the Idd9.3 region[J].Immunogeneics，2006.58(1):9-14.

[8] Zhang XL,Ali MA.Ficolins:structure,function and associated diseases[J].Adv Exp Med Biol，2008，632:105-115.

[9] Honoré C,Hummelshoj T,Hansen BE，etal.The innate immune component ficolin 3(Hakata antigen) mediates the clearance of late apoptotic cells[J].Arthritis Rheum,2007,56(5):1598-1607.

[10] Andersen T,Munthe-Fog L,Garred P,etal.Serum levels of ficolin-3(Hakata antigen) in patients with systemic lupus erythematosus[J].J Rheumatol,2009,36(4):757-759.