程家樂(lè)，姚 敬，彭佳遠(yuǎn)，汪 昱

(上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院普外科,上海200000)

大腸癌是影響人類健康的重要疾病，其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)位于第三位。盡管診斷技術(shù)和治療方式的不斷改進(jìn)，每年仍有約100萬(wàn)人發(fā)生大腸癌，并且有60萬(wàn)人死于該病[1]，約一半大腸癌患者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其中通過(guò)門靜脈系統(tǒng)肝轉(zhuǎn)移是主要的轉(zhuǎn)移途徑[2-3]。故對(duì)大腸癌肝轉(zhuǎn)移的早期發(fā)現(xiàn)及早期診斷成為治療的關(guān)鍵。大腸癌肝轉(zhuǎn)移的上皮細(xì)胞相關(guān)基因目前國(guó)內(nèi)外研究較多，而間質(zhì)遺傳不穩(wěn)定基因國(guó)外報(bào)道較少，國(guó)內(nèi)未見(jiàn)報(bào)道。激光捕獲顯微切割和基因芯片兩種新興技術(shù)已成為腫瘤研究的重要手段。前者能在顯微鏡直視下通過(guò)激光捕獲和顯微切割從異質(zhì)性組織中得到目的細(xì)胞或細(xì)胞群，保證了組織的同質(zhì)性；后者可同時(shí)高效率檢測(cè)成千上萬(wàn)個(gè)基因，是篩選差異表達(dá)基因有力的工具。因此，本實(shí)驗(yàn)聯(lián)合應(yīng)用激光捕獲顯微切割和基因芯片技術(shù)篩選大腸癌肝轉(zhuǎn)移間質(zhì)相關(guān)基因，為臨床早期診斷和靶向治療大腸癌肝轉(zhuǎn)移奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1組織標(biāo)本 于2008年7月至2010年7月由上海市第六人民醫(yī)院提供的手術(shù)切除大腸癌伴肝轉(zhuǎn)移及不伴肝轉(zhuǎn)移原發(fā)灶標(biāo)本各4例。大腸癌非轉(zhuǎn)移為大腸癌術(shù)后2年內(nèi)未見(jiàn)肝轉(zhuǎn)移的病例。實(shí)驗(yàn)標(biāo)本基本信息見(jiàn)表1，所有患者術(shù)前均未行化療和放療，術(shù)后30 min內(nèi)取腫瘤組織并與液氮罐保存?zhèn)溆?，全部?biāo)本均由病理學(xué)診斷確診。

表1 大腸癌標(biāo)本臨床病理資料

mT代表有肝轉(zhuǎn)移的大腸癌原發(fā)灶組織;T代表無(wú)肝轉(zhuǎn)移大腸癌組織;1～4為標(biāo)本序號(hào)

1.2激光捕獲顯微切割與微量RNA提取 標(biāo)本取出后，用冰凍切片機(jī)(德國(guó)徠卡儀器公司生產(chǎn),型號(hào):CM1850 UV)行連續(xù)切片，厚度約7 μm，將切片放在56 ℃烘烤過(guò)夜，HE染色，室溫待標(biāo)本干燥后采用激光顯微切割機(jī)(Arctururs公司生產(chǎn),型號(hào):Pix Cell Ⅱ LCM)切割，分離出標(biāo)本中的間質(zhì)組織。顯微切割時(shí)間不能超過(guò)30 min，以免RNA降解。使用Trizol試劑(英杰公司提供,批號(hào):15596026)進(jìn)行標(biāo)本微量RNA提取。使用RNeasy Mini Kit(Qiagen公司生產(chǎn),型號(hào):74104)純化RNA，甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的濃度。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，質(zhì)量合格的RNA進(jìn)入下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3RNA線性擴(kuò)增、熒光標(biāo)記和芯片雜交 質(zhì)檢合格的RNA樣本，采用單標(biāo)快速擴(kuò)增熒光標(biāo)記試劑盒(安捷倫公司生產(chǎn),批號(hào):0006081570)進(jìn)行互補(bǔ)核糖核酸(complementary ribonucleic acid,cRNA)合成，行線性擴(kuò)增，Cy3單色熒光標(biāo)記，用紫外分光光度計(jì)(安捷倫公司生產(chǎn)，型號(hào):ND-1000)檢測(cè)標(biāo)記后的cRNA質(zhì)量和熒光標(biāo)記率，當(dāng)RNA溶液的A260/A280比值范圍在1.8～2.1之間時(shí)，說(shuō)明RNA純度好。檢測(cè)合格的標(biāo)志物與安捷倫人全基因組表達(dá)譜芯片(4×44K 2.0)雜交，洗滌。

1.4芯片檢測(cè)資料的分析 采用安捷倫微陣列掃描儀(安捷倫公司生產(chǎn),型號(hào):G2505B)掃描芯片，將安捷倫芯片特征提取軟件讀出的熒光值導(dǎo)入Agilent Genespring GX軟件中進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化后得出大腸癌伴肝轉(zhuǎn)移原發(fā)灶間質(zhì)和不伴肝轉(zhuǎn)移大腸癌癌灶間質(zhì)標(biāo)記的信號(hào)比值(倍數(shù)變化)，即為該基因組在大腸癌伴肝轉(zhuǎn)移原發(fā)灶間質(zhì)和不伴肝轉(zhuǎn)移大腸癌癌灶間質(zhì)中變化情況。最后經(jīng)過(guò)T-test檢驗(yàn)，篩選出倍數(shù)變化≥2的基因?yàn)楸磉_(dá)顯著上調(diào)基因，倍數(shù)變化≤0.5為表達(dá)顯著下調(diào)基因。同時(shí)將所有差異性表達(dá)基因?qū)階gilent Genespring GX軟件后，得出基因本體學(xué)分析和通路分析結(jié)果。

1.5實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)驗(yàn)證4個(gè)基因的表達(dá) 利用激光捕獲顯微切割提取4例大腸癌伴肝轉(zhuǎn)移原發(fā)灶及4例大腸癌不伴肝轉(zhuǎn)移癌灶的間質(zhì)組織，使用Trizol試劑(英杰公司提供,批號(hào):15596026)進(jìn)行標(biāo)本微量RNA提取。對(duì)表達(dá)上調(diào)骨膜蛋白(Periostin)基因、胰島素樣生長(zhǎng)因子2(insulin-like growth factor-2,IGF-2)基因和表達(dá)下調(diào)的過(guò)氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子(peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator,PGC)、趨化因子配體21(chemokine ligand 21,CCL21)基因進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié) 果

2.1激光捕獲顯微切割后的組織 激光捕獲顯微切割后，間質(zhì)成功地從組織中分離出來(lái)。如圖所示,圖1-1(見(jiàn)封三)為其中1例伴肝轉(zhuǎn)移大腸癌間質(zhì)切割后的剩余組織;圖1-2(見(jiàn)封三)為該例伴肝轉(zhuǎn)移大腸癌切割下來(lái)的間質(zhì);圖1-3(見(jiàn)封三)為其中1例不伴肝轉(zhuǎn)移大腸癌間質(zhì)切割后的剩余組織;圖1-4(見(jiàn)封三)為該例不伴肝轉(zhuǎn)移大腸癌切割下來(lái)的間質(zhì)。

2.2甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA質(zhì)量 由于通過(guò)激光捕獲顯微切割獲得的目的細(xì)胞數(shù)量有限，RNA產(chǎn)量較低，故點(diǎn)樣量相對(duì)偏少RNA變性瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)28S和18S兩條帶，且28S帶密度約為18S帶密度的2倍，幾乎未出現(xiàn)其他混雜帶(圖2)，據(jù)此可判斷RNA質(zhì)量好，可以進(jìn)入下一步的實(shí)驗(yàn)。

mT:伴有肝轉(zhuǎn)移的大腸癌原發(fā)灶間質(zhì)細(xì)胞;T：不伴肝轉(zhuǎn)移大腸癌組織的間質(zhì)細(xì)胞;1～4：標(biāo)本編號(hào)

圖2微量RNA的變性瓊脂糖凝膠電泳

2.3熒光標(biāo)記的cRNA定量分析 激光捕獲顯微切割所得的總RNA經(jīng)過(guò)線性擴(kuò)增，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)表明所得的cRNA量為1.70～1.86 μg，大腸癌伴肝轉(zhuǎn)移原發(fā)灶間質(zhì)和不伴肝轉(zhuǎn)移大腸癌癌灶間質(zhì)組織的A260/A280比值介于1.9～2.1之間，說(shuō)明RNA純度高，熒光標(biāo)記效率在9 pmol/μg以上可參加雜交反應(yīng)，RNA基本信息見(jiàn)表2。質(zhì)量合格，可進(jìn)入下一步實(shí)驗(yàn)。

表2 大腸癌RNA樣品基本信息

mT:伴有肝轉(zhuǎn)移的大腸癌原發(fā)灶間質(zhì)細(xì)胞；T：不伴肝轉(zhuǎn)移大腸癌組織的間質(zhì)細(xì)胞

2.4芯片檢測(cè)結(jié)果 用Cy3分別標(biāo)記大腸癌伴肝轉(zhuǎn)移原發(fā)灶間質(zhì)和不伴肝轉(zhuǎn)移大腸癌癌灶間質(zhì)，與芯片雜交后掃描圖像，可以看到空白對(duì)照點(diǎn)無(wú)信號(hào)，陰性對(duì)照點(diǎn)有弱信號(hào)，陽(yáng)性對(duì)照點(diǎn)為強(qiáng)信號(hào)。經(jīng)Agilent Genespring GX軟件分析，背景信號(hào)噪音低，證實(shí)該實(shí)驗(yàn)可靠。用大腸癌伴肝轉(zhuǎn)移原發(fā)灶間質(zhì)和不伴肝轉(zhuǎn)移大腸癌癌灶間質(zhì)的熒光信號(hào)作散點(diǎn)圖，大部分聚集在一個(gè)以45°對(duì)角線為中心的區(qū)域里，表示信號(hào)差異在0.5～2.0之間，所有差異性基因均滿足P<0.05(圖3)。

圖3-1 mT1 VS T1 圖3-2 mT2 VS T2

圖3-3 mT3 VS T3 圖3-4 mT4 VS T4

圖3大腸癌肝轉(zhuǎn)移間質(zhì)差異表達(dá)基因的散點(diǎn)圖其中位于三條基線之間的為表達(dá)無(wú)顯著差異的基因，位于最上層基線之上的為上調(diào)基因，位于最下層基線之下的為下調(diào)基因

2.5生物學(xué)信息分析 依熒光素大腸癌伴肝轉(zhuǎn)移原發(fā)灶間質(zhì)/不伴肝轉(zhuǎn)移大腸癌癌灶間質(zhì)比值(倍數(shù)變化)>2.0或<0.5的數(shù)據(jù)項(xiàng)差異表達(dá)，共篩選出1948條基因發(fā)生差異表達(dá)，其中上調(diào)的有1266條，下調(diào)的有682條，將這些基因按基因本體論分析分子功能進(jìn)行分類，發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)基因與細(xì)胞分化、酶活性調(diào)節(jié)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及基因轉(zhuǎn)錄、翻譯調(diào)節(jié)等有關(guān)。按通路分析，發(fā)現(xiàn)這些差異基因主要參與細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用、局部黏附、細(xì)胞黏附分子、抗原過(guò)程和呈遞、細(xì)胞因子間相互作用、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β信號(hào)通路等通路。

2.6實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)驗(yàn)證結(jié)果 基因Periostin、IGF-2在肝轉(zhuǎn)移的大腸癌間質(zhì)中均高表達(dá)，基因PGC、CCL21在肝轉(zhuǎn)移的大腸癌間質(zhì)中均低表達(dá)。表3顯示各基因的引物和產(chǎn)物。上述結(jié)果與基因芯片的表達(dá)結(jié)果是一致的(表4)，說(shuō)明基因芯片結(jié)果可靠。

表3 引物列表

GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶；Periostin：骨膜蛋白； IGF-2：胰島素樣生長(zhǎng)因子2； PGC：過(guò)氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子；CCL21：趨化因子配體21

表4 樣品的待測(cè)基因相對(duì)含量表

mT:有肝轉(zhuǎn)移的大腸癌間質(zhì)組織；T：無(wú)肝轉(zhuǎn)移的大腸癌間質(zhì)組織；mT/T代表基因的相對(duì)比值 GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶;Periostin：骨膜蛋白;IGF2：胰島素樣生長(zhǎng)因子;PGC：過(guò)氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子;CCL21：趨化因子配體21

3 討 論

人類的大部分惡性腫瘤都起源于上皮細(xì)胞，在正常情況下，起源于上皮細(xì)胞層的惡性腫瘤與起支持作用的間質(zhì)細(xì)胞被基底膜分隔。長(zhǎng)期以來(lái)學(xué)者們都認(rèn)為上皮細(xì)胞惡性腫瘤只與上皮細(xì)胞相關(guān)，其治療方案也只針對(duì)上皮細(xì)胞本身。然而惡性腫瘤的進(jìn)展不僅有上皮細(xì)胞的癌癥相關(guān)變化，作為腫瘤生長(zhǎng)微環(huán)境的間質(zhì)細(xì)胞在上皮細(xì)胞腫瘤的進(jìn)展中也起了重要的作用[4]。目前上皮與間質(zhì)細(xì)胞在腫瘤進(jìn)展中的相互作用主要有兩種學(xué)說(shuō)：一種是間質(zhì)細(xì)胞首先發(fā)生異常進(jìn)而導(dǎo)致上皮細(xì)胞的變異，另一種是變異的上皮細(xì)胞通過(guò)旁分泌的方式引起間質(zhì)的腫瘤相關(guān)變化[5]。間質(zhì)中存在著多種細(xì)胞：由內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、周皮細(xì)胞組成的脈管系統(tǒng)為組織輸送氧氣及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[6]，由趨化因子及細(xì)胞因子募集的炎性細(xì)胞及免疫細(xì)胞同時(shí)有致癌和抑癌作用[7]，在腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移過(guò)程中，間質(zhì)中處于靜息狀態(tài)的纖維母細(xì)胞變?yōu)榛罨睦w維母細(xì)胞，是上皮與間質(zhì)旁分泌信號(hào)通路的主要調(diào)控者[8]。

本研究結(jié)合激光捕獲纖維切割和基因芯片兩種技術(shù)篩選出了與大腸癌肝轉(zhuǎn)移相關(guān)的腸癌間質(zhì)基因共1948條，分別為1266條上調(diào)基因及682條下調(diào)基因。這些基因與細(xì)胞分化、酶活性調(diào)節(jié)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞因子間相互作用等相關(guān)。并通過(guò)實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)驗(yàn)證基因芯片結(jié)果，證實(shí)基因芯片結(jié)果可靠。

研究表明，在乳腺癌[9]、前列腺癌[10]、Wilms瘤[11]中 IGF-2雙等位基因不僅在腫瘤細(xì)胞高表達(dá)，與腫瘤鄰接的組織中也有一定程度的表達(dá)，這些研究提示在腫瘤的進(jìn)展過(guò)程中，IGF-2基因不僅于上皮細(xì)胞中高表達(dá)，間質(zhì)細(xì)胞可能也會(huì)出現(xiàn)高表達(dá)。關(guān)華鶴[12]研究表明大腸癌組織和癌旁正常組織均出現(xiàn)IGF-2高表達(dá)，且大腸癌中IGF-2的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。這表明IGF-2與結(jié)直腸癌的肝轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，本研究顯示伴有肝轉(zhuǎn)移的大腸癌間質(zhì)中IGF-2表達(dá)顯著高于不伴肝轉(zhuǎn)移大腸癌間質(zhì)，提示IGF-2于間質(zhì)中高表達(dá)是大腸癌肝轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)因素，其機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

Bao等[13]研究發(fā)現(xiàn)Periostin基因在80%的原發(fā)結(jié)腸癌組織中表達(dá)，并在所有肝轉(zhuǎn)移灶組織中表達(dá)，且肝轉(zhuǎn)移灶中Periostin基因的表達(dá)遠(yuǎn)高于原發(fā)結(jié)腸癌組織，這表明Periostin基因高表達(dá)與結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移有密切聯(lián)系。Kikuchi等[14]通過(guò)免疫組化和電鏡證實(shí)Periostin由結(jié)腸腺周間質(zhì)和結(jié)腸癌相關(guān)的間質(zhì)細(xì)胞分泌。這些研究提示間質(zhì)中Periostin基因高表達(dá)與大腸癌肝轉(zhuǎn)移有著密切的聯(lián)系，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)證了這一點(diǎn)，也進(jìn)一步說(shuō)明Periostin確實(shí)是在間質(zhì)中表達(dá)的基因。

Liang等[15]將PGC-1α基因?qū)胄∈箝g質(zhì)細(xì)胞，使該基因于間質(zhì)高表達(dá)，發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入PGC-1α基因后間質(zhì)線粒體形成與清除氧自由基的作用增強(qiáng)，這提示PGC-1基因于間質(zhì)中的表達(dá)情況也影響著腫瘤的預(yù)后，且PGC-1基因表達(dá)下降的致癌作用可能與其降低細(xì)胞能量代謝有關(guān)。目前研究發(fā)現(xiàn)PGC-1的低表達(dá)存在于人結(jié)腸癌、前列腺癌、乳腺癌組織中[16-18]。然而，間質(zhì)中PGC-1基因的表達(dá)情況與大腸癌肝轉(zhuǎn)移目前未見(jiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果提示PGC-1在大腸癌肝轉(zhuǎn)移原發(fā)灶間質(zhì)中低表達(dá)，表明PGC-1在大腸癌發(fā)生，發(fā)展中可能有抑癌作用，還需進(jìn)一步研究。

Yousefieh等[19]發(fā)現(xiàn)，使小鼠前列腺癌間質(zhì)高表達(dá)CCL21基因，利用CCL21的趨化功能，使樹(shù)突狀細(xì)胞、T細(xì)胞等免疫細(xì)胞聚集于腫瘤間質(zhì)可以抑制腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移，其中樹(shù)突狀細(xì)胞作用于記憶性T細(xì)胞和初始T細(xì)胞，使其變?yōu)榫哂行?yīng)的T細(xì)胞，可以直接殺死腫瘤細(xì)胞。Mumtaz等[20]于2008的研究顯示，大腸癌患者體內(nèi)的CCL21較正常人呈明顯的低水平表達(dá)狀態(tài)?？梢酝茢?，大腸癌間質(zhì)中CCL21基因的表達(dá)必然和肝轉(zhuǎn)移有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)利用基因芯片篩選到的大腸癌肝轉(zhuǎn)移間質(zhì)差異表達(dá)基因中CCL21與不伴肝轉(zhuǎn)移腸癌間質(zhì)相比低水平表達(dá)，提示CCL21有望成為大腸癌肝轉(zhuǎn)移診斷及免疫治療的分子標(biāo)志物。

本研究聯(lián)合應(yīng)用激光顯微切割與基因芯片技術(shù)成功構(gòu)建大腸癌肝轉(zhuǎn)移間質(zhì)差異表達(dá)基因，并用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)驗(yàn)證了基因芯片的準(zhǔn)確性。以上多個(gè)差異表達(dá)基因，在以往大腸癌肝轉(zhuǎn)移發(fā)生機(jī)制研究中報(bào)道較少，其在大腸癌肝轉(zhuǎn)移中的明顯高表達(dá)或低表達(dá)，說(shuō)明它們?cè)诖竽c癌肝轉(zhuǎn)移癌變過(guò)程中可能起了較大作用，至于其具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。下一步研究將從基因組、蛋白質(zhì)組水平上對(duì)重點(diǎn)基因進(jìn)行大樣本檢測(cè)，以確定大腸癌肝轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵分子機(jī)制、診斷和治療靶點(diǎn)。

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