陳培珍，林志鑾，胡燕萍

(1.武夷學(xué)院 福建省高校綠色化工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；福建 武夷山 354300；2.武夷學(xué)院 生態(tài)與資源工程學(xué)院；福建 武夷山 354300)

桂花(OsmanthusfragransLour.)又名木樨、金栗、九里香，為木犀科屬植物，是我國(guó)珍貴的花卉.具有很高的食用和藥用價(jià)值，能治多痰咳嗽、腸風(fēng)血痢、牙痛口臭、食欲不振、閉經(jīng)腹痛[1].研究表明：桂花富含蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物及多種氨基酸，維生素和微量元素等成分，是不可多得的“全營(yíng)養(yǎng)食品”[2].此外桂花中還蘊(yùn)藏著豐富的黃酮類(lèi)化合物.對(duì)優(yōu)化桂花總黃酮提取工藝的研究已有很多報(bào)道[3-7]，但是提取工藝條件對(duì)總黃酮活性保持的影響尚未見(jiàn)報(bào)道.

本文采用正交試驗(yàn)法探討不同的提取工藝對(duì)桂花總黃酮得率及抗氧化作用的影響，旨在選取既能很好保持桂花總黃酮的生物活性又能提高桂花總黃酮得率的提取工藝，從而為桂花總黃酮產(chǎn)品及其他總黃酮產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

丹桂由福建浦城木犀園營(yíng)養(yǎng)食品有限公司提供，經(jīng)武夷學(xué)院生物工程專(zhuān)業(yè)李國(guó)平授教鑒定后，自然曬干后，烘至恒重備用.

蘆丁、亞硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、無(wú)水乙醚、無(wú)水乙醇、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、抗壞血酸(Vc)、BTH均是分析純.

1.2 主要儀器

UV-2550型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津).SYC-15型超級(jí)恒溫水浴鍋(南京桑力電子設(shè)備)；WG900CSL123-K6型微波爐(格蘭仕)；BSA224S電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 桂花黃酮的提取工藝流程

取桂花若干，粉碎過(guò)0.301 nm孔徑篩，在索氏脂肪提取器中用無(wú)水乙醚回流2 h脫去脂肪、色素等，至無(wú)色為止.取出，60 ℃鼓風(fēng)干燥12 h，將乙醚烘干至恒重.準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5 g預(yù)處理后的桂花粉末于微波反應(yīng)器中，按一定料液比，加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇，連接好回流裝置.按一定微波功率、微波時(shí)間反應(yīng)，停止后取出反應(yīng)物，減壓抽濾，取上清液定容于50 mL容量瓶便得到桂花總黃酮提取物.

1.3.2 單因素試驗(yàn)以桂花黃酮得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)

試驗(yàn)的主要目的是探討能較好保持桂花黃酮的生物活性又能提高桂花黃酮得率的提取工藝，依據(jù)前人的試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)有可能影響黃酮生物活性的因素再進(jìn)行討論[8-11].因此選取乙醇體積分?jǐn)?shù)，料液比，浸提時(shí)間，微波功率等因素，依據(jù)各因素水平和提取條件提取桂花黃酮，考察這些因素對(duì)黃酮得率及抗氧化作用的影響，以確定正交試驗(yàn)的因素水平.每處理重復(fù)3次，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果.

各因素水平分布如下：微波功率分別采用180、360、540、720、900 W 5個(gè)水平，浸提時(shí)間分別采用1、2、3、4、5 min 5個(gè)水平，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別采用50%、55%、60%、65%、70% 5個(gè)水平進(jìn)行單因素試驗(yàn).料液比分別采用1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50并對(duì)提取次數(shù)分析.研究溫度、時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)4個(gè)因素對(duì)桂花黃酮提取率的影響.

1.3.3 黃酮的得率計(jì)算

測(cè)得桂花總黃酮提取物吸光度，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程按(1)式計(jì)算桂花總黃酮得率[12].

(1)

式中Y為蘆丁的吸光值；V1為桂花總黃酮粗提物溶液的體積；V2為顯色溶液的體積；m為桂花粉末的質(zhì)量.

1.3.4 自由基清除和抗氧化能力的測(cè)定

管中依次加入6.5×10-5mol/L DPPH溶液2.5 mL和體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇1.5 mL，總體積為4.0 mL，混勻20 min后，于1 cm比色皿中測(cè)定吸光度A(517 nm)，記為A0；加入6.5×10-5mol/L的DPPH溶液2.5 mL和1.5 mL待測(cè)試樣溶液,測(cè)定值記為As；加入2.5 mL體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇和1.5 mL待測(cè)試樣溶液，測(cè)定值記為Ar.按(2)式計(jì)算DPPH自由基清除率.

(2)

式中As為DPPH溶液加待測(cè)試樣溶液的吸光度;A0為DPPH溶液加乙醇的吸光度;Ar為待測(cè)試樣溶液加乙醇的吸光度.

1.3.5 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)的因素和水平，采用微波輔助提取桂花黃酮和DPPH法對(duì)桂花總黃酮提取液進(jìn)行評(píng)價(jià)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析，確定桂花黃酮的最佳提取工藝.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 微波時(shí)間對(duì)桂花黃酮的提取率影響

由圖1可知，微波時(shí)間從1 min到2 min總黃酮的得率從15.08%增加到17.65%；微波時(shí)間2 min到5 min總黃酮得率從17.65%降到16.24%.因此，微波反應(yīng)時(shí)間以2 min為宜.

2.1.2 微波功率對(duì)桂花黃酮的提取率影響

由圖2可知，微波功率從180 W增加到360 W總黃酮的得率從16.20%增加到16.78%，超過(guò)360 W時(shí)總黃酮得率反而降低.為此，微波功率為360 W為佳.

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)桂花黃酮的提取率影響

由圖3可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)從40%增加到60%，得率從15.66%增至17.94%.乙醇體積分?jǐn)?shù)進(jìn)一步增大，得率不再增加，反而逐漸減少，乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，得率為16.34%，體積分?jǐn)?shù)再增加得率下降趨于平緩.其可能原因是較高體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液極性差，影響到對(duì)桂花細(xì)胞的擊穿等作用.綜合考慮桂花總黃酮得率和生產(chǎn)成本，選取60%體積分?jǐn)?shù)的乙醇為提取溶劑.

2.1.4 料液比對(duì)桂花黃酮的提取率影響

由圖4可知，料液比從30 mL/g增加到40 mL/g的階段，提取率從16.24%增加至17.75%.在40 mL/g的料液比時(shí)，得率達(dá)到最大，而后得率又下降.隨著料液比的增大總黃酮的溶出率增大，但同時(shí)也增大了桂花中其他物質(zhì)的溶出導(dǎo)致溶液變黏而不利于總黃酮的提取.因此，綜合考慮提取效率、生產(chǎn)成本及總黃酮進(jìn)一步處理，確定微波法提取總黃酮物質(zhì)料液比選擇35 mL/g.

2.2 正交試驗(yàn)

2.2.1 正交試驗(yàn)分析

在單因素的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)的因素和水平，A為料液比，B為乙醇濃度，C為微波時(shí)間，D為微功率.采用微波輔助提取桂花黃酮和DPPH法對(duì)桂花總黃酮提取液進(jìn)行評(píng)價(jià)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，確定桂花黃酮的最佳提取工藝.具體實(shí)驗(yàn)見(jiàn)表1～2.

表1 正交試驗(yàn)的因素及水平

表2 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 極差分析

針對(duì)正交試驗(yàn)分別以桂花總黃酮得率和桂花總黃酮對(duì)DPPH清除率進(jìn)行極差分析.由表3中極差R分析可知，各因素影響桂花總黃酮得率的大小順序是C>D>A>B，其中微波時(shí)間是主要的影響因素.正交結(jié)果和單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合.正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示第2組桂花總黃酮得率較高為18.18%，最佳工藝提取條件為A1B2C2D2，即提取料液比為1∶35，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，微波反應(yīng)時(shí)間為2 min，微波功率為360 W.

表3 總黃酮得率的極差分析 %

由表4中極差R分析可知，桂花總黃酮對(duì)DPPH自由基(DPPH·)清除率的影響因素為D>C>B>A，其中微波功率和微波時(shí)間為主要因素.在微波反應(yīng)時(shí)間1～3 min、微波功率180～540 W、料液比1∶35～1∶45以及乙醇體積分?jǐn)?shù)55% ～ 65%條件下，桂花總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除和得率的影響基本一致.在此提取條件下桂花總黃酮清除DPPH自由基的活性沒(méi)有受到影響.

表4 總黃酮對(duì)DPPH·清除率的極差分析 %

2.3 桂花總黃酮、Vc、BHT清除DPPH自由基

由圖5可知，在相同的加入量情況下桂花總黃酮對(duì)DPPH自由基明顯優(yōu)于BHT，劣于Vc.從90 μg增加到450 μg對(duì)1.031 mg的DPPH清除率從37.11%增加到80.39%，540～900 μg清除率的增加相當(dāng)緩慢，僅從82.22%增加到90.74%.

3 結(jié)語(yǔ)

1) 乙醇體積分?jǐn)?shù)，微波時(shí)間和微波功率過(guò)高都不利于桂花總黃酮的提取率和生物活性的保持.

2) 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示第2組桂花總黃酮得率較高為18.18%，最佳工藝提取條件為A1B2C2D2，即提取料液比為1∶35，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，微波反應(yīng)時(shí)間為2 min，微波功率為360 W.

3) 在此條件下桂花總黃酮清除DPPH自由基的活性沒(méi)有受到影響，在相同的加入量情況下桂花總黃酮對(duì)DPPH自由基清除率明顯優(yōu)于BHT，低于Vc.

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