姜 玲，劉雅莉,婁 倩，焦淑珍，權永輝

(西北農(nóng)林科技大學 a旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室，b林學院，c園藝學院,陜西 楊凌 712100)

葡萄風信子(Muscaribotryoides)是天門冬科葡萄風信子屬的一種多年生草本觀花地被植物，其因開較為稀少的藍紫色花而深受人們喜愛。植物的花色是多種因子共同作用的結(jié)果,但絕大多數(shù)植物的花色是由細胞中的特定花色素而決定?；ㄉ氐暮铣芍饕?類基因的調(diào)控，一類是結(jié)構(gòu)基因，負責編碼花色素生物合成的催化酶；另一類是調(diào)節(jié)基因，其編碼的轉(zhuǎn)錄因子可應答外界刺激，調(diào)控基因時空表達[1]。在調(diào)控色素合成的因子中，以對MYB轉(zhuǎn)錄因子的研究最為廣泛，目前報道的幾乎所有的花色素合成途徑都受到MYB轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[2]。

MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，它廣泛參與植物色素合成、細胞分化與發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導以及抗逆抗病等次生代謝過程的調(diào)控[3]。根據(jù)DNA結(jié)合功能域中不完全重復序列數(shù)目的不同，MYB轉(zhuǎn)錄因子可分為3個亞族(1R、2R和3R)[3-4]：有1個重復的MYB類似蛋白被稱為MYB1R，有2個重復的為R2R3-MYB，有3個重復的為MYB3R[2]。在MYB轉(zhuǎn)錄因子中，R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物的調(diào)控中起著重要的作用。自Paz-Ares等[5]從植物中分離到第1個MYB轉(zhuǎn)錄因子以來，大量 MYB 類因子被分離和鑒定[6]。近年來，科研人員在蘋果[7-8]、龍膽[9]、百合[10]等植物中也克隆和鑒定出色素合成相關的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子，而關于葡萄風信子色素合成的調(diào)節(jié)基因及其功能的研究還未見報道。本研究從葡萄風信子中克隆出1個MYB轉(zhuǎn)錄因子基因，并對其進行生物信息學和表達模式分析，以期為明確該基因在葡萄風信子花發(fā)育過程中的調(diào)控作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

以開藍色花的葡萄風信子品種‘亞美尼亞’(Muscariarmeniacum)為試驗材料，試驗種球采自西安植物園，種植于西北農(nóng)林科技大學人工氣候室。將葡萄風信子花發(fā)育過程分為4個時期(S1.未著色，S2.開始著色，S3.完全著色未開放，S4.完全著色開放)，并分別采集這4個時期的花及根、莖、葉組織，用液氮冷凍處理后，于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

PrimeScript RT reagent kit 試劑盒、SMARTerTMRACE cDNA擴增試劑盒、實時定量PCR試劑盒SYBR Premix ExTaqTMⅡ和克隆載體pMD19-T vector均購于大連TaKaRa公司；RNA快速提取試劑盒購于北京百泰克公司；DNA回收試劑盒購于TIANGEN公司；Matchmaker System 3酵母雜交試劑盒購于Clontech公司。PCR擴增引物的合成與擴增產(chǎn)物序列測定由北京奧科生物技術有限公司完成。

1.2 方 法

1.2.1 植物各組織總RNA的提取 根據(jù)RNA快速提取試劑盒說明書提取葡萄風信子不同組織的RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量，于-80 ℃冰箱中保存，以備后期RACE擴增和實時定量分析用。

1.2.2 葡萄風信子MYB基因全長序列的克隆 前期,本課題組對葡萄風信子轉(zhuǎn)錄組進行了測序，目的是通過篩選獲得與葡萄風信子花發(fā)育相關的轉(zhuǎn)錄因子基因。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，將篩選出的葡萄風信子MYB基因暫命名為MaMYB1。為了獲得MaMYB1基因全長，用該基因的已知序列(轉(zhuǎn)錄組測序獲得)設計特異性引物(表1)，參考SMARTerTMRACE cDNA擴增試劑盒說明書，準備3′-RACE-Ready cDNA和5′-RACE-Ready cDNA進行PCR反應。3′RACE的反應體系為25 μL，其中PCR-Grade water 17.25 μL,10×Advantage 2 PCR Buffer 2.5 μL,dNTP Mix 0.5 μL,50×Advantage 2 Polymerase Mix 0.5 μL,將其混合液渦旋混勻，瞬時離心；在混合液中加入3′-RACE-Ready cDNA 1.25 μL，GSP引物(MaMYB1-3′RACE) 0.5 μL以及UPM引物2.5 μL。5′ RACE末端的擴增體系同3′ RACE端擴增體系，模板為5′-RACE-Ready cDNA，GSP引物為MaMYB1-5′ RACE。5′ RACE和3′ RACE擴增程序均為94 ℃變性30 s，67 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸2 min，25個循環(huán)。對3′ RACE和5′ RACE的擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳后回收測序。用seqman軟件將得到的序列與已知的EST序列(轉(zhuǎn)錄組測序獲得)進行拼接，查找拼接后序列的開放讀碼框，在開放閱讀框兩端設計引物(MaMYB1-F-S和MaMYB1-F-A)，PCR擴增MaMYB1基因cDNA的全長。PCR反應體系為：10×Buffer 2.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L) 2 μL，MaMYB1-F-S 1 μL，MaMYB1-F-A 1 μL，Taq酶 0.25 μL，ddH2O 17.25 μL。擴增程序為：94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。對擴增產(chǎn)物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳后回收測序。

表1 MaMYB1基因克隆及表達分析所用引物

1.2.3MaMYB1基因序列分析 用ORFfinder在線分析MaMYB1基因的開放閱讀框，并推測該基因所編碼的氨基酸序列，分析蛋白質(zhì)分子質(zhì)量大小及等電點；用Mega 5.0軟件對其進行系統(tǒng)進化分析；利用DNAman軟件對MaMYB1蛋白序列與已知的部分MYB蛋白序列進行比對分析。用Blastp(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)將推測的蛋白序列與NCBI上的同源序列進行比對。

1.2.4MaMYB1基因的轉(zhuǎn)錄激活活性分析 用帶有酶切位點的引物pGBKT7-M-S和pGBKT7-M-A(表1)將MaMYB1克隆進pGBKT7載體中，構(gòu)建pGBKT7-MaMYB1載體；同時擴增GAL4基因，克隆到pGBKT7載體中作陽性對照。將上述重組質(zhì)粒和空載體PGBKT7轉(zhuǎn)化酵母AH109感受態(tài)細胞，然后涂布于一缺培養(yǎng)基(SD/-Trp)上，30 ℃培養(yǎng)3 d。將于SD/-Trp培養(yǎng)基上生長的轉(zhuǎn)化子劃線接種于含有X-α-gal的三缺培養(yǎng)基(SD/-Trp-His-Ade)中，通過顯色情況檢測其轉(zhuǎn)錄激活活性。

1.2.5MaMYB1基因的表達特性分析 以葡萄風信子Actin基因為內(nèi)參基因，設計其特異引物Actin-S和Actin-A(表1)。根據(jù)MaMYB1序列設計定量引物MaMYB1-RT-S 和MaMYB1-RT-A(表1)。參照PrimeScript RT reagent kit操作說明，將葡萄風信子‘亞美尼亞’的根、莖、葉以及不同發(fā)育時期(S1，S2，S3，S4)花的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應體系為:5×PrimeScript Buffer 4 μL,PrimeScript RT Enzyme 1 μL,Oligo dT Prime 1 μL,Random 6 mers 1 μL,加入1 000 ng 的RNA，然后加入Rnase Free dH2O至總體積為20 μL。反應條件為：37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s。以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，參考SYBR Premix ExTaqTMⅡ操作說明，在BIO-RAD Cycler IQ5熒光定量PCR儀上進行實時熒光定量PCR。其反應體系為：SYBR Premix ExTaq10 μL,上、下游引物各0.8 μL，模板cDNA 1 μL，加水至總體積為20 μL。反應程序為94 ℃ 30 s；94 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，45個循環(huán)，每個反應重復3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 MaMYB1全長序列的獲得

3′ RACE結(jié)果在約 1 kb處有一條帶(圖1-A)，而5′ RACE在約2 kb和500 bp各有一條帶(圖1-B)，其中2 kb處的條帶為非特異擴增產(chǎn)物。將1 kb和500 bp處的片段與原有的EST序列拼接在一起，獲得一條長953 bp的序列，利用ORF finder軟析分析其開放閱讀框，根據(jù)開放閱讀框兩端序列設計引物，經(jīng)PCR擴增獲得一條長約750 bp的序列(圖1-C)。

2.2 MaMYB1基因編碼蛋白的生物信息學分析

利用ORFfinder軟件對MaMYB1基因序列進行分析，發(fā)現(xiàn)其開放閱讀框長750 bp，編碼249個氨基酸，其蛋白分子質(zhì)量約為27.7 ku，等電點為9.3。推測該基因編碼的部分氨基酸序列如圖2所示。MaMYB1與部分已知的R2R3-MYB蛋白氨基酸序列的比對結(jié)果(圖2)表明，在該序列N端有2個典型的MYB結(jié)構(gòu)域(R2和R3)，該結(jié)構(gòu)域與部分已報道的MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域有很高的相似性，在R2結(jié)構(gòu)域中，從推測的第17個氨基酸開始每隔19個氨基酸就有1個色氨酸殘基；在R3結(jié)構(gòu)域中，第1個色氨酸被苯丙氨酸取代，之后每隔18個氨基酸就有1個色氨酸殘基；在此R3結(jié)構(gòu)域內(nèi)，還存在1個與BHLH蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)域[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R，而在與原花青素和花青素合成相關的MYB轉(zhuǎn)錄因子中該結(jié)構(gòu)域是一常見特征[11-15]。因此可以推斷克隆的轉(zhuǎn)錄因子為典型的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子。將序列提交NCBI Blastp 發(fā)現(xiàn)，其蛋白序列與可可樹(Theobromacacao)MYB蛋白的相似性為63%，與蘋果(Malusdomestica)和黃瓜(Cucumissativus)MYB蛋白的相似性均為64%。將MaMYB1與其他物種的MYB蛋白進行進化分析，結(jié)果(圖3)表明，MaMYB1與玉米的ZmP1 以及擬南芥的MYB12關系較近。

圖1 葡萄風信子MYB基因的RACE-PCR以及CDNA全長電泳結(jié)果

圖2 MaMYB1蛋白部分序列與其他已知MYB序列的比對

圖3 MaMYB1與 其他MYB蛋白的系統(tǒng)分析

2.3 MaMYB1的轉(zhuǎn)錄激活活性分析

將篩選的轉(zhuǎn)化子在一缺培養(yǎng)基和三缺培養(yǎng)基上培養(yǎng)，結(jié)果(圖4)顯示，陰性對照只能在一缺培養(yǎng)基(SD/-Trp)上生長，不能在三缺培養(yǎng)基(SD/-Trp-His-Ade)上生長，說明其無轉(zhuǎn)錄激活活性； 而pGBKT7-MaMYB1轉(zhuǎn)化子同陽性對照在一缺和三缺培養(yǎng)基上都能生長，并能使轉(zhuǎn)化子在X-α-gal存在的情況下顯色變藍。此結(jié)果證明，MaMYB1轉(zhuǎn)錄因子具有轉(zhuǎn)錄激活活性。

2.4 MaMYB1在葡萄風信子中的組織表達譜

利用實時定量PCR對MaMYB1在不同組織中的表達情況進行分析，結(jié)果(圖5)表明，在葡萄風信子根、莖、葉以及花組織中都檢測到MaMYB1的表達，其中以花中的表達量較高。MaMYB1的表達量隨花發(fā)育過程的推進呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，在剛開始著色(S2)表達量最高；從S1到S2期，MaMYB1的表達量顯著增加，S2期表達量約是S1期表達量的9倍?？梢奙aMYB1在花組織中高表達，且在花的不同發(fā)育時期表達量差異顯著，推測該基因可能在花中起調(diào)控作用。

3 討 論

轉(zhuǎn)錄因子也稱反式作用因子，是能夠與基因啟動子區(qū)域中的順式作用元件發(fā)生特異性作用的DNA結(jié)合蛋白，它們之間以及與其他相關蛋白之間的相互作用可激活或抑制某些基因的轉(zhuǎn)錄[16]。其中R2R3-MYB型轉(zhuǎn)錄因子作為MYB蛋白最大的一類，主要參與植物花青苷的代謝調(diào)節(jié)[17]。

圖4 MaMYB1的轉(zhuǎn)錄激活活性分析

本研究結(jié)果表明，MaMYB1基因與已知的R2R3-MYB有很高的同源性。此外，有報道指示，調(diào)節(jié)花色素生物合成的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子與BHLH轉(zhuǎn)錄因子密切相關[18-19]，如玉米的ZmC1和BHLH[20]，矮牽牛的AN2 MYB與AN1/JAF13 BHLHs[21]，以及金魚草的ROSEA1、 ROSEA2與VENOSA MYBs等[22]。這些MYB轉(zhuǎn)錄因子都需要與BHLH形成二聚體的形式來發(fā)揮其調(diào)節(jié)功能。而MaMYB1基因的R3結(jié)構(gòu)域內(nèi)也存在著1個與BHLH蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，由此可推斷，MaMYB1在起調(diào)控功能的時候，可能需要與BHLH蛋白結(jié)合，才能更好地起到轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的作用，但該轉(zhuǎn)錄因子是否與花色素的合成調(diào)控有關，還有待進一步研究。

此外，學者們在對R2R3-MYB結(jié)構(gòu)的研究中發(fā)現(xiàn)，在R2R3區(qū)域外存在1個與調(diào)節(jié)花色素相關的結(jié)構(gòu)域KPRPR[S/T][F/L][2，23]。但是從單子葉植物中克隆到的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子，如文心蘭的OgMYB1[24]、蝴蝶蘭的PsUMYB6[25]以及玉米的ZmC1都未發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)域，表明在單子葉和雙子葉植物中，與色素調(diào)節(jié)相關的MYB轉(zhuǎn)錄因子存在著一定的差異[26]。本研究結(jié)果顯示，在MaMYB1氨基酸序列中未發(fā)現(xiàn)KPRPR[S/T]結(jié)構(gòu)域。

調(diào)節(jié)類黃酮合成的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子有不同的亞族，如矮牽牛的AN2、擬南芥的PAP1、PAP2和TT2，它們在花、果實、種子和內(nèi)果皮的花色素和原花色素的生物合成中起著重要作用。玉米的ZmC1、P1以及擬南芥的MYB11、MYB12 和MYB111基因有著相似的功能，它們與幼苗和內(nèi)果皮的黃酮醇和鞣紅物質(zhì)的合成有關[9]。 本研究結(jié)果表明， MaMYB1與玉米P1 和擬南芥MYB12的關系較近，說明MaMYB1對類黃酮的合成可能有調(diào)節(jié)作用。

實時定量PCR分析結(jié)果表明，MaMYB1基因在花中的表達量高于其他組織，且在花發(fā)育過程中表達量有顯著變化，因此可以推測，MaMYB1主要在花中發(fā)揮表達調(diào)控功能。

根據(jù)本研究結(jié)果，筆者推測MaMYB1基因可能在葡萄風信子的花中發(fā)揮調(diào)控功能，且有可能與類黃酮的合成相關。下一步的研究是構(gòu)建該基因的表達載體，通過轉(zhuǎn)化模式植物，進一步探究其在生物體中的調(diào)控功能。

[參考文獻]

[1] 馬春雷,姚明哲,王新超,等.茶樹2個MYB轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆與表達分析 [J].林業(yè)科學,2012,48(3):31-37.

Ma C L,Yao M Z,Wang X C,et al.Cloning and expression of two MYB transcription factors in tea plant (Camelliasinensis) [J].Scientia Silvae Sinicae,2012,48(3):31-37.(in Chinese)

[2] Stracke R,Werber M,Weisshaar B.The R2R3-MYB gene family inArabidopsisthaliana[J].Curr Opin Plant Biol,2001,4:447-456.

[3] Jin H,Martin C.Multifunctionality and diversity within the pl-antMYB-gene family [J].Plant Mol Biol,1999,41:577-585.

[4] Rosinski J A,Atchley W R.Molecular evolution of the Myb family of transcription factors:Evidence for polyphyletic origin [J].J Mol Evol,1998,46:74-83.

[5] Paz-Ares J,Ghosal D,Wienand U,et al.The regulatory c1 locus of encodes a protein with homology to myb proto-oncogene products and with structural similarities to transcriptional activators [J].EM-BO J,1987,6(12):3553-3558.

[6] Loguerico L L,Zhang J Q,Wilkins T A.Differential regulation of six novel MYB-domain genes defines two distinct expression patterns in allotetraploid cotton (GossypiumhirsutumL.) [J].Mol Gen Genet,1999,261(4/5):660-671.

[7] Ban Y,Honda C,Hatsuyama Y,et al.Isolation and functional analysis of a MYB transcription factor gene that is a key regulator for the development of red coloration in apple skin [J].Plant and Cell Physiology,2007,48:958-970.

[8] Espley R V,Hellens R P,Putterill J,et al.Red colouration in apple fruit is due to the activity of the MYB transcription factor,MdMYB10 [J].The Plant Journal,2007,49:414-427.

[9] Nakatsuka T,Haruta K S,Pitaksutheepong C,et al.Identification and characterization of R2R3-MYB and bHLH transcription factors regulating anthocyanin biosynthesis in gentian flowers [J].Plant and Cell Physiology,2008,49:1818-1829.

[10] Yamagishi M,Shimoyamada Y,Nakatsuka T,et al.Two R2R3-MYB genes,homologs of petunia AN2,regulate anthocyanin biosyntheses in flower tepals,tepal spots and leaves of asiatic hybrid Lily [J].Plant and Cell Physiology,2010,51:463-474.

[11] Grotewold E,Sainz M B,Tagliani L,et al.Identiflcation of the residues in the Myb domain of maize C1 that specify the interaction with the bHLH cofactor R [J].Proc Natl Acad Sci USA,2000,97:13579-13584.

[12] Baudry A,Heim M A,Dubreucq B,et al.TT2,TT8,and TTG1 synergistically specify the expression of BANYULS and proanthocyanidin biosynthesis inArabidopsisthaliana[J].Plant J,2004,39:366-380.

[13] Zimmermann I M,Heim M A,Weisshaar B,et al.Comprehensive identiflcation ofArabidopsisthalianaMYB transcription factors interacting with R/B-like bHLH proteins [J].Plant J,2004,40:22-34.

[14] Dubos C,Stracke R,Grotewold E,et al.MYB transcription factors inArabidopsis[J].Trends Plant Sci,2010,15:573-581.

[15] Hichri I,Barrieu F,Bogs J,et al.Recent advances in the transcriptional regulation of the flavonoid biosynthetic pathway [J].J Exp Bot,2011,62:2465-2483.

[16] 張椿雨,龍 艷,馮 吉,等.植物基因在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控及其生物學意義 [J].遺傳,2007,29(7):793-799.

Zhang C Y,Long Y,Feng J,et al.Transcriptional regulation of plant genes and its significance in biology [J].Heredites(Beijing),2007,29(7):793-799.(in Chinese)

[17] 許志茹,李春雷,崔國新,等.植物花青素合成中的MYB蛋白 [J].植物生理學通訊,2008,44(3):597-604.

Xu Z R,Li C L,Cui G X,et al.MYB protein of anthocyanin biosynthesis in plant [J].Plant Physiology Communications,2008,44(3):597-604.(in Chinese)

[18] Mol J J,Schafer E,Weiss D.Signal perception,transduction,and gene expression involved in anthocyanin bio-synthesis [J].Crit Rev Plant Sci,1996,15:525-557.

[19] Winkel-Shirley B.Flavonoid biosynthesis:A colourful model for genetics,biochemistry,cell biology,and biotechnology [J].Plant Physiol,2001,126:485-493.

[20] Goff S A,Cone K C,Chandler V L.Functional analysis of the transcriptional activator encoded by the maize B gene:Evidence for a direct functional interaction between two classes of regulatory proteins [J].Genes Dev,1992,6:864-875.

[21] Goodrich J,Carpenter R,Coen E S.A common gene regulates pigmentation pattern in diverse plant species [J].Cell,1992,68:955-964.

[22] Mol J,Grotewold E,Koes R.How genes paint flowers and seeds [J].Trends Plant Sci,1998,3:212-217.

[23] Peel G J,Pang Y,Modolo L V,et al.The LAP1 MYB transcription factor orchestrates anthocyanidin biosynthesis and glycosylation in Medicago [J].Plant J,2009,59:136-149.

[24] Chiou C Y,Yeh K W.Differential expression of MYB gene (OgMYB1) determines color patterning in floral tissue of Oncidium Gower Ramsey [J].Plant Mol Biol,2008,66:379-388.

[25] Ma H,Pooler M,Griesbach R.Anthocyanin regulatory/structural gene expression in Phalaenopsis [J].J Am Soc Hortic Sci,2009,134:88-96.

[26] Albert N W,Arathoon S,Collette V E,et al.Activation of anthocyanin synthesis inCymbidiumorchids:Variability between known regulators [J].Plant Cell,Tissue and Organ Culture,2009,100:355-360.