楊雪清，張雅林

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 植保資源利用與病蟲害防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌712100；2 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，遼寧 沈陽 110866)

蘋果蠹蛾(Cydiapomonella(L.))是對全世界溫帶地區(qū)的蘋果(MalusdomeaticaBorkhausern (Rosaceae))和梨(PyruscommunisL. (Rosaceae))危害最嚴(yán)重的害蟲之一[1-5]，也是我國重要的檢疫性入侵生物。蘋果蠹蛾幼蟲蛀食果肉和果心，并取食種子，嚴(yán)重時(shí)蛀果率可達(dá)80%以上。同時(shí)，它將黑褐色的蟲糞沿著蛀道排出至果子表皮，影響果品品質(zhì)，嚴(yán)重時(shí)造成落果，對果品產(chǎn)業(yè)造成巨大損失[6-7]。

目前，國內(nèi)外對蘋果蠹蛾的防治仍主要采用化學(xué)藥劑，伴隨而來的是十分嚴(yán)重的抗藥性問題[1-5]。國內(nèi)外對蘋果蠹蛾的研究主要集中在殺蟲劑的田間、室內(nèi)毒力以及對解毒酶活性的影響等方面[1-5]，而有關(guān)殺蟲劑對蘋果蠹蛾解毒酶基因mRNA表達(dá)水平影響的研究甚少，對于內(nèi)參基因的選擇更是無明確的標(biāo)準(zhǔn)。激動蛋白(actin) 是真核細(xì)胞中最豐富的蛋白質(zhì)，β-actin因其穩(wěn)定表達(dá)的特點(diǎn)，在分子生物學(xué)研究中常被作為內(nèi)參基因。然而，近年來的許多研究表明，目前使用較多的內(nèi)參基因均存在不穩(wěn)定性，在生物體不同發(fā)育階段、體外不同處理?xiàng)l件下，其表達(dá)量變化較大[8-10]。本研究以蘋果蠹蛾為試蟲，通過RT-PCR及RACE技術(shù)克隆得到β-actin基因的cDNA全長，并采用實(shí)時(shí)定量PCR和半定量PCR方法，對蘋果蠹蛾不同發(fā)育階段以及殺蟲劑處理后β-actin基因mRNA的表達(dá)情況進(jìn)行了探討，以明確β-actin基因是否可以作為內(nèi)參基因應(yīng)用于蘋果蠹蛾抗藥性分子機(jī)制的研究中。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試 蟲 蘋果蠹蛾幼蟲采自新疆喀什疏勒縣(東經(jīng)76.05°，北緯 39.24°)蘋果園，在新疆塔里木大學(xué)農(nóng)業(yè)部阿拉爾作物有害生物科學(xué)觀測試驗(yàn)站室內(nèi)以人工飼料飼養(yǎng)至第5代，飼養(yǎng)溫度為(25±1) ℃，相對濕度為(40±5)%，光周期為16 h光照/8 h黑暗。

1.1.2 藥 劑 毒死蜱和高效氯氟氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品，購自阿拉丁試劑(Aladdin，上海)公司，將其分別溶于丙酮配制成200和1.56 mg/mL的母液，備用。

1.2 試蟲處理

取蘋果蠹蛾1～5齡幼蟲、蛹、成蟲(蛹和成蟲區(qū)別雌雄)于液氮中迅速冷凍，-80 ℃保存?zhèn)溆茫?齡幼蟲饑餓10 h后，分別點(diǎn)滴1 μL 12.5 mg/mL毒死蜱和 0.195 mg/mL高效氯氟氰菊酯于前胸背部，并以相同方法點(diǎn)滴丙酮作為對照，放入人工飼料飼養(yǎng)，于處理后12，24，36，48，60 h分別取樣，液氮冷凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 蘋果蠹蛾總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

參照RNAiso Plus試劑盒(Takara，大連)說明，提取蘋果蠹蛾總RNA，用凝膠電泳及多功能酶標(biāo)儀M200 PRO(Switzerland，Tecan) 檢測總RNA的純度和濃度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas，加拿大)的說明，將RNA反轉(zhuǎn)錄合成用于擴(kuò)增β-actin基因保守區(qū)和全長的cDNA模板。

5′RACE和3′RACE模板分別按Clontech (Takara)公司SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的操作步驟合成。 Real-Time PCR模板選用Takara公司的PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser(perfect Real Time)試劑盒合成。

1.4 β-actin基因的克隆與測序

試驗(yàn)所用引物見表1，由上海桑尼生物科技有限公司合成。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中粘蟲(Mythimnaseparate(Walker)，登錄號GQ856238.1)、粉紋夜蛾(Trichoplusiani，登錄號JF303662.1)、煙草天蛾(Manducasexta，登錄號AJ519536.1) 和家蠶(Bombyxmori，登錄號NM00112625.4)等物種的β-actin氨基酸序列，利用在線工具CODEHOP[11]設(shè)計(jì)1對兼并引物CpActinS和CpActinAS(表1)，用于擴(kuò)增β-actin基因保守區(qū)。PCR 反應(yīng)在C100 型PCR儀 (Bio-rad，美國)上進(jìn)行，反應(yīng)體系為25 μL： 2×TaqMasterMix(康為世紀(jì)，北京)12.5 μL、上下游引物(10 μmol/L)各1 μL、cDNA模板2 μL、ddH2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；然后94 ℃ 變性50 s，55 ℃退火50 s，72℃延伸1 min，循環(huán)35次；最后72℃ 延伸7 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1% 瓊脂糖凝膠電泳中分離，回收約1 000 bp的單一條帶，TA克隆至pMD 19-T 載體(Takara)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB平板上篩選，挑取陽性克隆送至上海桑尼生物科技有限公司測序。

根據(jù)蘋果蠹蛾β-actin基因保守區(qū)序列，分別設(shè)計(jì)特異性3′ RACE 引物(CpActin3F1和CpActin3F2)及5′ RACE引物(CpActin5R1和CpActin5R2)，與試劑盒提供的引物UPM(表1)配對，分別用于擴(kuò)增β-actin基因3′和5′非編碼區(qū)(3′-UTR，5′-UTR)。3′ RACE和5′ RACE擴(kuò)增均采用巢式PCR進(jìn)行，反應(yīng)體系為25 μL：2×TaqMasterMix 12.5 μL、上下游引物(10 μmol/L) 各1 μL、cDNA模板2 μL、ddH2O 8.5 μL。第1輪PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 延伸7 min。將第1輪PCR產(chǎn)物稀釋10倍用作第2輪擴(kuò)增的模板，第2輪擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 反應(yīng)7 min。PCR產(chǎn)物的電泳、回收、克隆及測序同上。

將測序所得保守區(qū)、3′-UTR和5′-UTR 3個(gè)片段的序列用DNAstar 7.1 中的Seqman軟件拼接后獲得蘋果蠹蛾β-actin基因全長cDNA序列。根據(jù)拼接所得序列設(shè)計(jì)引物F和R(表1)，用于蘋果蠹蛾β-actin基因全長的擴(kuò)增。以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增蘋果蠹蛾β-actin基因全長cDNA，反應(yīng)體系為：2×TaqMasterMix 12.5 μL、上下游引物(10 μmol/L) 各1 μL、cDNA模板2 μL、ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 反應(yīng)7 min。PCR產(chǎn)物的電泳、回收、克隆及測序同上。

表1 試驗(yàn)中用到的引物

1.5 生物信息學(xué)分析

采用NCBI (The National Center for Biotechnology Information)在線工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行β-actin核酸和蛋白質(zhì)序列同源性分析；通過http://pfam.janelia.org/服務(wù)器對蛋白質(zhì)的功能基序進(jìn)行預(yù)測；運(yùn)用ProtParam軟件在線工具(http://expasy.org/tools/protparam.html)預(yù)測蛋白質(zhì)中氨基酸的組成、分子質(zhì)量和等電點(diǎn)；跨膜區(qū)分析采用TMPRED在線工具(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)；運(yùn)用SignalP 3.0[12]預(yù)測蛋白質(zhì)中可能存在的信號肽；采用PredictProtein服務(wù)器上的SABLE在線工具(https://www.predictprotein.org/)預(yù)測蛋白二級結(jié)構(gòu)。

1.6 不同發(fā)育階段及殺蟲劑處理后蘋果蠹蛾β-actin基因mRNA表達(dá)的檢測

1.6.1 半定量PCR 反應(yīng)體系為20 μL：cDNA (稀釋5倍)0.6 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.2 μL，2×TaqMasterMix 10 μL，ddH2O 9 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s，共29個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行重復(fù)，以不加cDNA模板作為陰性對照。

1.6.2 實(shí)時(shí)定量PCR 首先構(gòu)建β-actin基因擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線，以5倍等比稀釋5～6個(gè)濃度梯度的cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR(Real-Time quantitative PCR，RT-qPCR)，理想的標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2應(yīng)接近1，擴(kuò)增效率90%～105%?；诖耍囼?yàn)最終確立的反應(yīng)體系為20 μL： cDNA (稀釋5倍) 0.6 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.2 μL，2×UltraSYBR Mixture 10 μL(康為世紀(jì))，ddH2O 9 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min，以實(shí)現(xiàn)熱啟動酶的活化；接著進(jìn)行40個(gè)循環(huán)兩步法反應(yīng)，程序?yàn)椋?5 ℃ 15 s，55 ℃ 1 min；擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后為溶解曲線部分，程序?yàn)橐?.5 ℃/s的速度從55 ℃升溫至95 ℃。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行重復(fù)，以不加cDNA模板作為陰性對照。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用IBM的SPSS Statistics 12軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果蠹蛾β-actin基因的克隆

根據(jù)蘋果蠹蛾近緣種的β-actin 氨基酸序列設(shè)計(jì)的兼并引物PCR擴(kuò)增得到長度978 bp的保守區(qū)序列A(圖1)，Blast比對表明，該片段與NCBI數(shù)據(jù)庫中大多數(shù)昆蟲的β-actin序列一致性高達(dá)96%以上，可以確定所得序列為蘋果蠹蛾β-actincDNA片段。根據(jù)所得保守區(qū)片段序列設(shè)計(jì)5′ RACE 和3′ RACE特異性引物，擴(kuò)增分別獲得長度為253 bp的5′-UTR和368 bp的3′-UTR片段(圖1)。

圖1 蘋果蠹蛾β-actin基因PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果

通過Seqman軟件將分段克隆獲得的保守區(qū)、5′-UTR、3′-UTR 3個(gè)片段序列拼接，得到1 466 bp的蘋果蠹蛾β-actin基因cDNA全長。在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行β-actin基因全長PCR擴(kuò)增，結(jié)果獲得了1 466 bp的蘋果蠹蛾β-actin全長基因(圖1)。對其測序后，將序列提交至GenBank，獲得的登錄號為KC832921。

2.2 蘋果蠹蛾β-actin基因的生物信息學(xué)分析

開放閱讀框在線預(yù)測工具(ORF Finder，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html) 預(yù)測的β-actin基因ORF全長為1 131 bp，起始密碼子位于第102～104位核苷酸，終止密碼子TAA位于第1 230～1 232位核苷酸，共編碼376個(gè)氨基酸殘基組成的β-actin蛋白質(zhì)(圖2)。該基因5′-UTR的長度為67 bp，3′-UTR的長度為268 bp。3′-UTR中存在典型的加尾信號AATAAA，以及Poly A尾巴。將推導(dǎo)的氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中用在線工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對，結(jié)果表明，蘋果蠹蛾與絕大多數(shù)昆蟲β-actin氨基酸同源性均在99%以上，而與斑點(diǎn)鈍眼蜱(登錄號：AAS55945.1)、蠅蛹金小蜂(登錄號：NP-001157191.1) 等昆蟲的氨基酸一致性可達(dá)100%，說明β-actin基因在昆蟲中高度保守。同時(shí)可以確定該序列為蘋果蠹蛾cDNA全長序列，編碼1個(gè)完整的β-actin 蛋白質(zhì)。

用ProtParam軟件在線工具對推導(dǎo)蛋白質(zhì)中氨基酸的組成、分子質(zhì)量和等電點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明，該蛋白質(zhì)由376個(gè)氨基酸殘基組成(圖2)，分子質(zhì)量為41.793 7 ku，分子式為C1852H2906N492O562S23，等電點(diǎn)為5.29。使用TMPRED在線工具預(yù)測跨膜區(qū)，結(jié)果表明，該蛋白有2個(gè)跨膜區(qū)，分別位于第131～147位和338～356位(圖2)。該預(yù)測結(jié)果與前人的結(jié)果[10,13]一致。SignalP 3.0預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該蛋白質(zhì)中無信號肽。通過PredictProtein服務(wù)器上的SABLE對該蛋白質(zhì)中的功能位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明，該蛋白具有Actin蛋白家族的典型識別特征(圖2)，分別為54～64位的YVGDEAQSKRG，357～364位的WISKQEYD，105～117位的LLTEAPLNPKANR。另外，該蛋白還存在6種類型特定功能位點(diǎn)(圖2)，包括1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)(13～16：NGSG)，1個(gè)依賴cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)(336～339：RKYS)，5個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)(61～63：SKR，67～69：TLK，146～148：SGR，195～197：TER，325～327：TMK)，4個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)(78～81：TNWD，203～205：TTAE，235～237：SSLE，359～362：SKQE)，2個(gè)酪蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)(192～199：KILTERGY，211～219：RDIKEKLCY)，8個(gè)N-豆蔻?；稽c(diǎn)(14～19：GSGMCK，43～48：GVMVGM，49～54：GQKDSY，75～80：GIVTNW，159～164：GVSHTV，246～251：GQVITI，269～274：GMEACG，344～349：GSILAS)。預(yù)測的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中，α-螺旋占30.9%，β-折疊占18.6%，無規(guī)則卷曲占50.5%。

2.3 蘋果蠹蛾不同發(fā)育階段及殺蟲劑處理后β-actin的表達(dá)量分析

通過引物QS和QAS，半定量PCR檢測在不同發(fā)育階段蘋果蠹蛾的cDNA模板中均擴(kuò)增到約150 bp的單一片段 (圖3-A)。瓊脂糖凝膠電泳條帶的亮度表明，β-actinmRNA表達(dá)水平在不同發(fā)育階段蘋果蠹蛾體內(nèi)均相對恒定，無明顯差異。

以QS和QAS為引物進(jìn)行Real-Time PCR反應(yīng)，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2為0.995，擴(kuò)增效率達(dá)95%，表明所使用的引物具有較好的特異性，反應(yīng)體系和條件良好，可以準(zhǔn)確地用于定量檢測。Real-Time PCR結(jié)果表明，蘋果蠹蛾不同發(fā)育階段 (圖3-B)以及殺蟲劑毒死蜱和高效氯氟氰菊酯(圖4)處理后，β-actin基因的mRNA表達(dá)相對穩(wěn)定，Ct值無顯著性差異 (P>0.05)。

圖3 不同發(fā)育階段蘋果蠹蛾β-actin基因mRNA的表達(dá)量

3 討 論

本研究克隆得到了1 466 bp的蘋果蠹蛾β-actin基因的cDNA全長，其中包括67 bp的5′-UTR，268 bp的3′-UTR，1 131 bp的ORF，編碼376個(gè)氨基酸，這與其他物種的β-actinORF大小一致。理想的內(nèi)參基因在生物體不同組織及不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量應(yīng)當(dāng)在恒定的水平內(nèi)，且不會受試驗(yàn)處理的影響[14]。

半定量PCR和qPCR是基因表達(dá)研究的重要技術(shù)。然而，qPCR由于儀器及技術(shù)的原因，往往存在一些非預(yù)見性的問題，半定量PCR的結(jié)果則更為直觀、穩(wěn)定[15]。本研究中，半定量PCR與qPCR結(jié)果表現(xiàn)出高度的一致性，因?yàn)槎叩幕驹硎且恢碌?。本研究采用?shí)時(shí)定量PCR和半定量PCR 2種技術(shù)對蘋果蠹蛾不同發(fā)育階段β-actin基因mRNA的表達(dá)情況進(jìn)行了探討，結(jié)果表明，不同發(fā)育階段間β-actin基因mRNA的表達(dá)水平無明顯差異，說明蘋果蠹蛾β-actin基因在發(fā)育過程中具有較好的穩(wěn)定表達(dá)性。為了進(jìn)一步評估蘋果蠹蛾β-actin作為內(nèi)參基因的可能性，本研究用點(diǎn)滴法處理4齡幼蟲，分析了殺蟲劑處理對蘋果蠹蛾幼蟲β-actin基因mRNA表達(dá)水平的影響，結(jié)果表明，2種殺蟲劑處理12～60 h后，β-actin的表達(dá)水平均相對穩(wěn)定，無明顯改變，說明蘋果蠹蛾β-actin可以作為可靠的內(nèi)參基因應(yīng)用，為今后研究蘋果蠹蛾抗藥性的分子機(jī)制，以及以β-actin作為內(nèi)參基因檢測蘋果蠹蛾其他靶基因mRNA表達(dá)水平的研究奠定了基礎(chǔ)。

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