郭 華,趙仙先,張曉娟,張 潔,呂 磊

循證醫(yī)學(xué)研究已經(jīng)證實(shí),吸煙獨(dú)立于高血壓、糖尿病、年齡等,是一個(gè)非常重要的冠心病危險(xiǎn)因素,與冠心病患者的預(yù)后存在負(fù)線性關(guān)系[1]。近年研究特別提出,吸煙對(duì)血管內(nèi)皮炎性微環(huán)境的影響,同時(shí)越來越多的證據(jù)顯示,動(dòng)脈粥樣硬化性疾病是一種以動(dòng)脈慢性炎癥性改變和內(nèi)皮功能不全為特點(diǎn)的疾病[2]。而在內(nèi)皮功能不全的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)研究中,較少涉及以血管內(nèi)皮炎性微環(huán)境改變?yōu)樘攸c(diǎn)的動(dòng)物模型。本研究旨在探討煙草側(cè)流煙霧對(duì)大鼠主動(dòng)脈炎性微環(huán)境和內(nèi)皮功能的影響,以及是否可通過側(cè)流煙霧暴露建立以炎性微環(huán)境變化為特點(diǎn)的大鼠內(nèi)皮功能損傷模型,并用于以后的實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物與分組 30只健康SD大鼠,8 w左右大小,體重200～250 g(由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,SCXK軍2012-0014),隨機(jī)分成3組,對(duì)照組6只(C組),短期煙霧影響組12只,長(zhǎng)期煙霧影響組12只；造模期間,將短期組隨機(jī)平均分兩個(gè)亞組,即：短期暴露組(S組)和短期暴露并恢復(fù)組(S+R組),長(zhǎng)期組也分為兩亞組,即：長(zhǎng)期暴露組(L組)和長(zhǎng)期暴露并恢復(fù)組(L+R組)。

1.2方法

1.2.1煙草側(cè)流煙霧暴露 按林邦和等[3]的方法自制2個(gè)煙草側(cè)流煙霧染毒箱(100 cm×60 cm×40 cm)。實(shí)驗(yàn)用煙為常見的商品煙(大豐收牌,焦油含量 13 mg/支,尼古丁含量 1 mg/支,安徽煙草公司)。將短期和長(zhǎng)期暴露組各12只同時(shí)放入染毒箱內(nèi)(3 h/次,10根/次,2次/d)。連續(xù)4 w后,將短期組處死6只,另外6只放入對(duì)照組箱內(nèi)2 w后處死。而長(zhǎng)期組12只大鼠繼續(xù)暴露4 w,然后處死其中6只,剩余6只放入對(duì)照組箱內(nèi)2 w后處死。對(duì)照組除箱內(nèi)無點(diǎn)燃的香煙外,其他條件與實(shí)驗(yàn)組相同,10 w后處死。

1.2.2血液動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的測(cè)量 在處死大鼠之前,測(cè)量各組的尾動(dòng)脈血壓、心率；在測(cè)量的前1 d,通過訓(xùn)練盡量使大鼠適應(yīng)儀器及環(huán)境,采用無創(chuàng)鼠尾尾套加壓阻斷法對(duì)平靜且清醒的大鼠進(jìn)行測(cè)量。每只大鼠測(cè)量5次,每次間隔約5 min,取平均值。

1.2.3離體主動(dòng)脈環(huán)內(nèi)皮依賴的主動(dòng)脈舒張?jiān)囼?yàn) 在每個(gè)實(shí)驗(yàn)的時(shí)間點(diǎn),將需要實(shí)驗(yàn)的大鼠通過腹腔內(nèi)注射水合氯醛(400 mg/kg)麻醉后,快速斷頭處死大鼠,迅速取出約4 cm長(zhǎng)的胸主動(dòng)脈,取2 cm于液氮中凍存用于測(cè)量炎性因子、NO及eNOs含量,剩余的主動(dòng)脈用于內(nèi)皮依賴性血管舒張功能的測(cè)定。將上述大鼠胸主動(dòng)脈放入4 ℃并持續(xù)通以95%O2+5%CO2混合氣體的Krebs緩沖液(NaCl 118 mmol/L,KCl 4.75 mmol/L,NaHCO325 mmol/L,MgSO41.2 mmol/L,CaCl22 mmol/L,KH2PO41.2 mmol/L,葡萄糖11 mmol/L,pH=7.4)中,切割成長(zhǎng)3 mm左右的血管環(huán),并放入含Krebs緩沖液器官浴槽中。在維持37 ℃的條件下,并持續(xù)通以95%O2+5%CO2混合氣體,一端固定,一端通過張力換能器連接PowerLab數(shù)據(jù)記錄系統(tǒng)。調(diào)節(jié)血管環(huán)的基礎(chǔ)最佳張力至1.8 g,并平衡60 min,期間每15 min換液1次。預(yù)先通過去甲腎上腺素(PE 1 μmol/L)收縮主動(dòng)脈,待其收縮張力達(dá)到最大限度后,依次加入不同濃度的乙酰膽堿(ACh,10-8～10-4mol/L)或硝普鈉(10-8～10-4mol/L),記錄每一濃度下主動(dòng)脈環(huán)的舒張程度(以舒張百分比計(jì)量),并繪制劑量反應(yīng)曲線[4-5]。

1.2.4主動(dòng)脈NO含量測(cè)定 組織中的NO化學(xué)性質(zhì)活潑,易于分解代謝,單純測(cè)量NO結(jié)果差異較大。因此,以測(cè)量NO的最終代謝產(chǎn)物NOx(亞硝酸鹽NO2-與硝酸鹽NO3之和)來反映體內(nèi)NO水平。將部分大鼠主動(dòng)脈放入含有蛋白抑制劑的無菌磷酸鹽中,在4 ℃的條件下以12 000g離心10 min。取上清液,嚴(yán)格遵循說明書操作步驟,利用NO試劑盒(南京碧云天生物公司),用分光光度儀在540 nm處測(cè)定,根據(jù)公式計(jì)算NOx含量。

1.2.5eNOs含量測(cè)定 采用Western blot法測(cè)定iNOS和eNOS表達(dá)水平。取胸主動(dòng)脈組織用冷TBS洗滌2～3次,置于勻漿器中,加RIPA裂解液提取蛋白,用BCA法進(jìn)行蛋白定量。在蛋白樣品中其體積5倍的蛋白上樣緩沖液,煮沸5 min、冷卻,離心后取上清,進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜。室溫下將轉(zhuǎn)好的膜置于脫色搖床上,用5%的脫脂牛奶封閉1 h,加入一抗eNOS(稀釋度1∶2000,美國(guó)Anbo Bio公司),4 ℃過夜；TBST漂洗3次,5 min/次；加二抗(稀釋度1∶3000,美國(guó)Anbo Bio公司),室溫30 min后,用TBST在室溫下脫色搖床上洗3次,5 min/次。將A和B 兩種試劑在離心管中等體積混合,將膜蛋白面朝上與此混合液充分接觸1～2 min后,去盡殘液,包好,放入X光片夾中曝光。將膠片進(jìn)行掃描存檔,Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。

1.2.6主動(dòng)脈炎性因子的mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用熒光定量PCR法測(cè)定主動(dòng)脈中炎性因子(ICAM-1、TNFα、IL-1β)的mRNA。用標(biāo)準(zhǔn)Trizol(美國(guó)Sigma-Aldrich)法提取目標(biāo)因子的總RNA。隨后用反轉(zhuǎn)錄方法(FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒,上海天根)反轉(zhuǎn)4 μg的總RNA到40 μl cDNA體系中,再用β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行調(diào)節(jié),使cDNA的起始量達(dá)到一致。依據(jù)上海捷瑞生物工程有限公司提供的方法進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(表1),實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)根據(jù)THUNDERBIRD SYBR?qPCR Mix(TOYOBO日本)和Applied Biosystems Step OneTM(ABI 美國(guó))實(shí)驗(yàn)手冊(cè),基于SYBR green擴(kuò)增方法進(jìn)行試驗(yàn)。

表1 引物設(shè)計(jì)

表2 煙草側(cè)流煙霧對(duì)大鼠血壓、心率的影響(n=6)

表3 各組主動(dòng)脈中NOx、炎性因子mRNA和eNOs蛋白的比較(n=6)

2 結(jié)果

2.1血液動(dòng)力學(xué)變化 吸入側(cè)流煙霧組大鼠尾動(dòng)脈血壓較對(duì)照組有明顯升高(P<0.05)。短期組在停止吸入煙霧2 w后,升高的血壓明顯下降,與對(duì)照組無明顯差異(P>0.05)；而長(zhǎng)期吸煙組即使停止煙霧干預(yù)2 w,血壓仍較高。見表2。

2.2各組(ACh)誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性血管舒張功能的變化 除了S+R組外,其他吸入煙霧組的胸主動(dòng)脈環(huán)對(duì)ACh誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)受損明顯,ACh所致的最大舒張比正常對(duì)照組下降了28.74%(P<0.01)；短期吸入煙霧組戒煙2 w,可明顯改善胸主動(dòng)脈的內(nèi)皮依賴性舒張,且與對(duì)照組無明顯差異(P>0.05)。但長(zhǎng)期吸入煙霧后戒煙不能改善其舒張功能。L組與S組比較,L組舒張百分比下降幅度較S組高(P<0.05)。見圖1。

圖1 不同濃度ACh對(duì)各組主動(dòng)脈內(nèi)皮依賴的血管舒張反應(yīng)的影響

2.3各組NO含量比較 吸入煙霧組主動(dòng)脈NOx的含量低于對(duì)照組,其中以L和L+R組降低最為明顯,S組次之,提示這3組NO含量較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)；雖然S+R組主動(dòng)脈中NO含量也偏低,但與對(duì)照組無明顯差異(P>0.05)。見表3。

2.4各組主動(dòng)脈中eNOs蛋白表達(dá)的變化 吸入煙霧組主動(dòng)脈eNOs蛋白表達(dá)最高,順序依次為S+R、S、L+R、L,其中以L、L+R、S組與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),而S+R組與對(duì)照組無明顯差異(P>0.05)。見表3、圖2。

2.5各組中主動(dòng)脈炎性因子mRNA的變化 L、L+R、S組其ICAM-1、TNFα、IL-1β的mRNA水平較C和C+R組明顯升高(P<0.05)；隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng),其炎性因子逐漸升高(P<0.05)。L組和L+R組之間炎性因子水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而S+R組與C組相比,TNFα和IL-1β無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表3。

圖2 各組Western blot eNOs蛋白表達(dá)

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的病理生理變化初始于血管內(nèi)皮功能不全。煙草煙霧中含有大約4300種化學(xué)成分。其中大部分如可誘發(fā)血管的炎癥環(huán)境、提升氧化應(yīng)激、促進(jìn)血小板聚集、抑制纖維蛋白原溶解、擾亂脂質(zhì)代謝、激活RAS系統(tǒng)等,這些作用相互影響,并產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大效應(yīng),引起血管內(nèi)皮功能不全,最終導(dǎo)致血管粥樣硬化性疾病[6]。近年研究特別提出,吸煙對(duì)血管內(nèi)皮炎性環(huán)境有影響,而且認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化本質(zhì)上是一種以慢性炎癥性改變和內(nèi)皮功能不全為特點(diǎn)的疾病[7-8]。煙草的復(fù)雜而綜合的多因子作用機(jī)制,以及可誘發(fā)炎性微環(huán)境改變的特點(diǎn)很難被其他動(dòng)物模型所模擬。因此,本研究的另一個(gè)目的就是將暴露于煙草側(cè)流煙霧中作為干預(yù)因素,制造以炎性微環(huán)境改變?yōu)樘攸c(diǎn)的內(nèi)皮功能不全動(dòng)物模型,用于以后的研究工作。

血管活化的炎性環(huán)境主要表現(xiàn)在炎性標(biāo)志物的升高[9]。ICAM-1、TNFα、IL-1β是近年研究中已證實(shí)的炎性標(biāo)志物[10]。在炎性環(huán)境的刺激下,這些因子明顯升高,它們可增加循環(huán)血液中白細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附力,促使白細(xì)胞從血管中向內(nèi)皮組織中趨化聚集；吸引單核細(xì)胞滲透入動(dòng)脈內(nèi)膜,造成局部的微炎性改變[11]；增加炎性細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞之間的黏附力；影響急性蛋白的合成,同時(shí)可以促進(jìn)放大炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng),從而損傷內(nèi)皮細(xì)胞,破壞內(nèi)皮的完整性,影響內(nèi)皮功能[12]。在本研究中,隨著煙草煙霧暴露的時(shí)間延長(zhǎng),其ICAM-1、TNFα、IL-1β的mRNA明顯升高,而短期組經(jīng)戒煙恢復(fù)后,其炎性因子有明顯下降,TNFα甚至可基本恢復(fù)至正常對(duì)照組水平。但是長(zhǎng)期暴露組停止煙草煙霧暴露后,其炎性因子無明顯改變。提示煙草煙霧確實(shí)可引起血管的炎性微環(huán)境改變,誘發(fā)炎性因子表達(dá)增加,且具有時(shí)間依賴性的損害特點(diǎn)。且在一定的時(shí)間范圍內(nèi),煙草造成的損害可經(jīng)戒煙而改善。

內(nèi)皮功能主要由NO的產(chǎn)量和生物活性,以及血管內(nèi)皮的完整性來體現(xiàn)[13]。NO由血管內(nèi)皮經(jīng)eNOs酶催化L-精氨酸而產(chǎn)生,越來越多的數(shù)據(jù)證實(shí),eNOs/NO通路異常是導(dǎo)致NO生物活性減少最主要的原因。而在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,以內(nèi)皮依賴的血管舒張功能來反映血管的內(nèi)皮功能已被廣泛接受[14]。在本研究中,無論短期還是長(zhǎng)期暴露于煙草側(cè)流煙霧中的大鼠,其主動(dòng)脈的NO產(chǎn)量、eNOs表達(dá)均較正常對(duì)照組明顯降低。相對(duì)于對(duì)照組,煙霧暴露組其內(nèi)皮依賴的血管舒張功能明顯受損,同時(shí)血壓也明顯升高。這些結(jié)果提示,暴露于煙草側(cè)流煙霧中,無論是在微觀水平還是宏觀水平,都有大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮功能異常的表現(xiàn)。而且隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng),長(zhǎng)期吸煙比短期吸煙對(duì)內(nèi)皮功能損害進(jìn)一步加重,似乎表現(xiàn)出一種時(shí)間依賴性的特點(diǎn)。但是在短期吸煙組中,經(jīng)過停止吸煙一段時(shí)間后,其主動(dòng)脈內(nèi)皮功能受損的指標(biāo)基本可恢復(fù)至未吸煙的狀態(tài)下,而長(zhǎng)期吸煙組無論是否停止吸煙,其主動(dòng)脈內(nèi)皮功能的損害很難恢復(fù)。提示在一定的時(shí)間范圍內(nèi),煙草煙霧造成的血管損害,可通過停止接觸煙霧而逆轉(zhuǎn)。同時(shí)也提示,在以后的研究中,如果吸入煙草側(cè)流煙霧引起內(nèi)皮功能不全的模型制造成功后,若要觀察某些干預(yù)因素對(duì)其的作用,最好使用暴露8 w以上的模型,避免出現(xiàn)假陰性結(jié)果的可能。

綜上所述,將大鼠暴露于煙草側(cè)流煙霧中,無論短期還是長(zhǎng)期,都可誘發(fā)大鼠主動(dòng)脈炎性微環(huán)境改變和內(nèi)皮功能不全,導(dǎo)致其血管動(dòng)力學(xué)的改變；如果要將此類動(dòng)物模型用于以后的實(shí)驗(yàn)研究,應(yīng)盡量采用長(zhǎng)期(8 w以上)暴露的大鼠模型,避免由于大鼠機(jī)體自身調(diào)節(jié)恢復(fù)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)有效性。

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