馬驍驍　楊侃　晁天柱　薛慧慧　鄧倩云　常雪瑩　周宇荀

摘要：目的：構(gòu)建攜帶增強(qiáng)綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein， EGFP）和miR-505基因的慢病毒載體。方法：采用PCR方法從pcDNATM6.2-GW/ EmGFP-miR-505表達(dá)載體質(zhì)粒擴(kuò)增出miR-505 shRNA基因編碼區(qū)173bp、175、171bp片段，通過限制性酶切、T4DNA連接酶連接，分別將miR-505 shRNA基因插入慢病毒表達(dá)載體FUGW與L26Fsy（1.1）GW中，構(gòu)建成重組載體FUGW-miR-505-3p/5p/nc與Fsy-miR-505-3p/5p/nc。脂質(zhì)體介導(dǎo)下將慢病毒重組載體轉(zhuǎn)染至HEK 293T細(xì)胞，通過EGFP觀察轉(zhuǎn)染效率，RT-PCR方法檢測miR-505的表達(dá)量。結(jié)果：熒光顯微鏡下觀測到HEK 293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染后有較強(qiáng)綠色熒光；RT-PCR顯示轉(zhuǎn)染FUGW-miR-505-3p/5p與Fsy-miR-505-3p/5p的HEK 293T細(xì)胞中對應(yīng)miR-505-3p/5p明顯升高。結(jié)論：成功構(gòu)建帶有EGFP和miR-505-3p/5p/nc shRNA基因的慢病毒表達(dá)載體。

關(guān)鍵詞：miR-505；慢病毒載體；HEK293T細(xì)胞；瞬時轉(zhuǎn)染；RT-PCR

中圖分類號：R34 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A 文章編號： 1674-0432（2014）-04-24-3

miRNA（MicroRNA）是近年來備受關(guān)注的一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，長度為21～25個核苷酸，由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)約70～90個堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成，通過與其目標(biāo)mRNA分子的3端非編碼區(qū)域（3'UTR）互補(bǔ)配對使其目標(biāo)mRNA分子的翻譯受到抑制[1～3]。自從1993年第一個miRNA被報道以來，人們發(fā)現(xiàn)miRNAs幾乎參與了所有重要的生物學(xué)過程的調(diào)控[4]，miRNAs的異常表達(dá)與人類多種疾病相關(guān)[5]。迄今為止，700多種已被鑒定出來的人源性miRNAs調(diào)控了人類1/3以上基因的表達(dá)。

慢病毒為一類逆轉(zhuǎn)錄病毒的總稱，與其他逆轉(zhuǎn)錄病毒載體相比，慢病毒載體主要有以下幾個優(yōu)點(diǎn)：其一，慢病毒載體既可以轉(zhuǎn)染處于有絲分裂活躍期的細(xì)胞，又可以轉(zhuǎn)染分裂緩慢及處于分裂終末期的細(xì)胞[6]；其二，由慢病毒載體攜帶整合入宿主基因組的目的基因?qū)D(zhuǎn)錄沉默作用有較強(qiáng)的抵抗能力，在體外培養(yǎng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)中，由慢病毒載體攜帶導(dǎo)入的目的基因可以在宿主細(xì)胞中得到長期而穩(wěn)定的表達(dá)；其三，慢病毒載體可以兼容多個轉(zhuǎn)錄啟動子，包括細(xì)胞特異性啟動子和在基因組中普遍存在的管家基因的啟動子；其四，經(jīng)過改建后的慢病毒載體可以容納約10kb左右的外源基因，因此大多數(shù)的cDNA都能被克隆入慢病毒載體。慢病毒載體的上述優(yōu)點(diǎn)使其成為體內(nèi)和體外基因轉(zhuǎn)移的一種有效工具，目前慢病毒也被廣泛地應(yīng)用于表達(dá)microRNA的研究中[7]。

泛素啟動子UBC為人和小鼠細(xì)胞的組成型啟動子，包含多種轉(zhuǎn)錄因子，且具有泛素系統(tǒng)本身的特性，與常用的病毒啟動子相比，其細(xì)胞來源的特性以及組成型表達(dá)的特點(diǎn)可能使它們更加適合驅(qū)動外源基因在哺乳動物細(xì)胞中的高效表達(dá)[8]。另外，大鼠SynaptinI （突觸蛋白I）啟動子（FsyI）是在神經(jīng)元中特異表達(dá)的啟動子。

為提高本研究所用miR-505在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)的特異性，選用UBC作為啟動子的慢病毒載體FUGW與大鼠SynaptinI 的慢病毒載體L26Fsy（1.1）GW，構(gòu)建能高效表達(dá)miR-505的慢病毒載體，旨在為進(jìn)一步的研究打好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

pcDNATM6.2-GW/ EmGFP-miR-505-3p/5p過表達(dá)質(zhì)粒，ASF/SF2過表達(dá)載體（上海invitrogen公司）；載體質(zhì)粒FUGW、L26Fsy（1.1）GW由中科院上海神經(jīng)所惠贈；PCR引物、測序（上海生工）；EcoRI酶、BamHI等核酸內(nèi)切酶、klenow大片段、去磷酸化酶、T4 DNA連接酶（大連寶生物工程有限公司）；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α（上海天根化工有限公司）；無內(nèi)毒素小量質(zhì)粒抽提試劑盒、中量質(zhì)粒抽提試劑盒（上海生工）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（MBI Fermentas 公司，美國）；陽離子脂質(zhì)體lipofectamineTM2000（上海invitrogen公司）；HEK293T細(xì)胞（本實(shí)驗(yàn)室保存）；DMEM高糖培養(yǎng)基、opti-MEM培養(yǎng)基、FBS（Hyclone，美國），PBS、胰酶（上海寧盛生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 miR-505慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定

首先利用以下一對引物：

PcDNA-left：5'CCGGAATTCAGTGGATCCTGGAGGCTTG

EcoRI BamHI

PcDNA-right：5'CCGGAATTCCAGATCTGGGCCATTTGTTC

EcoRI BglII

采用PCR方法將帶有側(cè)翼的miR-505-3p/5p/nc的shRNA基因從pcDNATM6.2-GW/ EmGFP-miR-505載體質(zhì)粒（以下簡稱pcDNA-miR-505）擴(kuò)增得到分別包含miR-505-3p，miR-505-5p及miR-505-nc（有相似結(jié)構(gòu)但無關(guān)序列的對照組）的shRNA基因。1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，純化回收，EcoRI酶切，再次純化。

EcoRI酶切FUGW和L26Fsy（1.1）GW（以下簡稱Fsy）空載體成線性化，分別與miR-505 shRNA基因片段4oC過夜連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，經(jīng)菌落PCR篩選出插入目的基因的重組質(zhì)粒，試劑盒法提取質(zhì)粒，鑒于FUGW、Fsy空載體序列含有單一BamHI酶切位點(diǎn)，miR-505目的基因片段在5'端也含有一個BamHI酶切位點(diǎn)，進(jìn)行BamHI酶切檢測目的基因插入的方向和拷貝數(shù)，測序確認(rèn)后，得到表達(dá)載體。將連接正確的重組載體命名為FUGW-miR-505-3p、FUGW-miR-505-3p、FUGW-miR-505-nc（簡稱FUGW-miR-505-3p/5p/nc），F(xiàn)sy-miR-505-3p、Fsy-miR-505-3p、Fsy-miR-505-nc（簡稱Fsy-miR-505-3p/5p/nc）。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

1.2.2.1細(xì)胞傳代培養(yǎng) HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%的FBS和1%的青鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)箱中37℃，5% CO2，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。

1.2.2.2脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染 采用脂質(zhì)體法將pcDNA-miR-505-3p/5p/nc與構(gòu)建成功的重組載體FUGW-miR-505-3p/5p/nc，F(xiàn)sy-miR-505-3p/5p/nc分別轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞。

實(shí)驗(yàn)前將HEK293T細(xì)胞以5×105/孔密度接種于12孔板。轉(zhuǎn)染前2小時將DMEM高糖培養(yǎng)基換成opti-MEM培養(yǎng)基，待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為單層并處于對數(shù)中期，融合度選擇為70%～80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。12孔板各孔轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒與脂質(zhì)體Lipofectamine2000分別為2微克和4微升，轉(zhuǎn)染步驟按脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說明書操作。轉(zhuǎn)染后6小時更換成含有4%青鏈霉素的正常DMEM高糖培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞置培養(yǎng)箱37℃，5%CO2孵育48小時。48小時，Trizol法提取12孔板細(xì)胞的總mRNA。

1.2.3 RT-PCR法檢測miR-505-3p/5p含量 采用Trizol法抽提的總mRNA，具體操作按照說明書進(jìn)行，以總RNA為模板，以下列特異引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到各目的基因的cDNA。

逆轉(zhuǎn)錄引物：miR-505-3p：5'GCGTCTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACGCAGAAAACCA

GC，

miR-505-5p：5'GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGT

ATTCGCACTGGATACGACAACATCAATA，

m16基因：5'GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT

TCGCACTGGATACGACCGCCAA

逆轉(zhuǎn)錄步驟按試劑盒說明書操作。制備的cDNA稀釋5倍作為模板，進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)，miR-505-3p基因上游引物：GCGAGCACCGTCAACACT，下游引物：TGGTGTCGTGGAGTCGGC，

miR505-5p基因上游引物：GCCCGGGAGCCAGGAAG，下游引物：CAGGGTCCGAGGTATTCGCAC，

m16基因上游引物：CGCGCTAGCAGCACGTAAAT，下游引物：GTGCAGGGTCCGAGGT。95oC變性2s，62℃退火延伸32s，共反應(yīng)40個循環(huán)，分析溶解曲線。 △Ct=Ct（miR-505-3p/5p/nc）-Ct（m16），△△Ct=△Ct（miR-505-3p/5p）-△Ct（miR-505-nc）表示miR-505-3p/5p的表達(dá)，2-△△Ct表示實(shí)驗(yàn)組與對照組miR-505表達(dá)量差異。

1.3 統(tǒng)計方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均值+標(biāo)準(zhǔn)差表示，依SPSS10.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 miR-505慢病毒重組載體的鑒定

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳示分別在173bp、175bp、171bp左右有特異擴(kuò)增條帶，與預(yù)期相符，產(chǎn)物單一，說明引物特異性較好（圖1）。

菌落PCR產(chǎn)物1%的瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)3種特異性條帶，分別于：208bp、416bp、624bp左右（圖2），說明目的小片段插入載體上的拷貝數(shù)不同，分別為1、2、3。

根據(jù)載體與目的片段上BamHI酶位點(diǎn)位置，BamHI酶切可以鑒定插入片段的方向。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果示，對于插入一個拷貝的重組載體來說，770bp左右處出現(xiàn)特異性條帶為正向插入，反之913bp處出現(xiàn)特異性條帶為反向插入。而對于插入兩拷貝的重組載體也顯示出兩種情況：770bp、161bp處同時出現(xiàn)條帶，913bp與161bp處同時出現(xiàn)條帶，前者為兩拷貝都正向插入，后者則為兩拷貝都反向插入（圖3）。

選取正向插入的重組載體進(jìn)行測序，結(jié)果與GenBank中提供的序列一致，證明載體構(gòu)建成功（圖4）。

以FUGW-miR-505-3p為例，構(gòu)建成功的載體圖譜如圖5。

2.2 miR-505對HEK293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞后48小時，于熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，三組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中都有EGFP綠色熒光表達(dá)有差異，組內(nèi)綠色熒光表達(dá)相差不大。其中FUGW組表達(dá)熒光強(qiáng)度最高，pcDNA組次之，F(xiàn)sy組最弱，（圖6）。

2.3 RT-PCR檢測細(xì)胞中miR-505表達(dá)水平

抽提總RNA，RT-PCR結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染48小時時，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA-miR-505-3p、FUGW-miR-505-3p與Fsy-miR-505-3p的細(xì)胞中miR-505-3p明顯增高，miR-505-5p幾乎無變化（圖7A，p<0.05）。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA-miR-505-5p、FUGW-miR-505-5p與Fsy-miR-505-5p的細(xì)胞中miR-505-5p也明顯增高，miR-505-3p幾乎無變化（圖7B，p<0.05），說明構(gòu)建的表達(dá)載體能實(shí)現(xiàn)microRNA的過表達(dá)。

3 討論

miR-505位于小鼠X染色體X：57647578-57647667處，ATP11C基因的第一和第二個外顯子之間的第一個內(nèi)含子中，對于其生物學(xué)功能的研究目前還處于起步階段。2010年，Verduci L等發(fā)現(xiàn)miR-505能通過作用于其靶標(biāo)ASF/SF2（可變剪接因子）發(fā)揮調(diào)控小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的增殖和衰老/凋亡的作用[9]。Karni R等發(fā)現(xiàn)在許多細(xì)胞中轉(zhuǎn)染ASF/SF2可以激活mTOR部分信號通路[10]。Yamamoto Y等在研究腫瘤多藥抗性時，發(fā)現(xiàn)miR-505是一個新的腫瘤抑制miRNA，與其呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的蛋白Akt3，與mTOR通路上的AKT屬于同一基因家族[11]。因此miR-505極有可能通過調(diào)控mTOR信號通路發(fā)揮其生物學(xué)功能，而mTOR通路是目前分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)，它能整合細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的信號，起到調(diào)控細(xì)胞代謝，生長，增殖和存活等過程的中心調(diào)控者的作用，mTOR通路的改變與多種疾病相關(guān)[12]。

在細(xì)胞水平對小RNA進(jìn)行研究，可采用合成的雙鏈siRNA或者構(gòu)建在表達(dá)載體上的shRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行。由于有些類型細(xì)胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效果差，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)的siRNA半衰期短，體外合成siRNA對基因表達(dá)的抑制作用通常是短暫的，因而使其應(yīng)用受到較大的限制[13]。

采用事先在體外構(gòu)建能夠表達(dá)shRNA的載體， 然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄shRNA，不但使脂質(zhì)體有效轉(zhuǎn)染的細(xì)胞種類增加，而且對基因表達(dá)抑制效果也不遜色于體外合成siRNA，在長期穩(wěn)定表達(dá)載體的細(xì)胞中，甚至可以發(fā)揮長期阻斷基因表達(dá)的作用[14]。

本實(shí)驗(yàn)成功將miR-505的基因片段克隆到具有神經(jīng)元特異性的慢病度真核表達(dá)載體中，并通過瞬時轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染構(gòu)建的慢病毒載體在HEK293T細(xì)胞中EGFP熒光表達(dá)，實(shí)時定量PCR結(jié)果也表明HEK293T細(xì)胞中能高表達(dá)miR-505，證明構(gòu)建載體成功?？傊?，我們將利用構(gòu)建成功的慢病毒表達(dá)載體對miR-505的功能進(jìn)行更加深入的研究，對miR-505調(diào)控的靶基因以及其他小分子RNA之間是否存在功能上的關(guān)聯(lián)進(jìn)行深入研究，以期進(jìn)一步闡明miR-505的功能。

參考文獻(xiàn)

[1] Doench J G，Sharp P A.Specificity of microRNA target selection in translational[J].Genes Dev，2004，18（5）：504-511.

[2] Brennecke J，Stark A，Russell R B，et al.Principles of microRNA-target recognition[J].PLoS Biol，2005，3（3）：e85-e85.

[3] Lewis B P，Burge C B，Bartel D P.Conserved seed pairing，often flanked by adenosines，indicates that thousands od human genes are microRNA targets[J].Cell，2005，120（1）：15-20.

[4] Bartel DP.MicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，and function[J].Cell，2004，116（2）：281-297.

[5] Ambros V，朱萬渠.MicroRNAs與疾病和發(fā)育[J].生命科學(xué)，2010，22（3）：29-31.

[6] Cockrell AS，Kafri T.Gene delivery by lentivirus vectors[J].Mol Biotechnol，2007，36（3）：184-204.

[7] Dittgen T，Nimmerjahn A，Komai S，Licznerski P，Waters J，Margrie TW，Helmchen F，Denk W， Brecht M，and Osten P.Lentivirus-based genetic manipulations of cortical neurons and their optical and electrophysiological monitoring invivo[J].Proc.Natl ac sci USA，2004，101（18）：206-211.

[8] 趙慧，鄭文嶺，崔東，馬文麗.泛素啟動子的研究進(jìn)展[J].廣東醫(yī)學(xué)，2003，24（12）：1376-1377.

[9] Verduci，L，Simili M，Rizzo M，Mercatanti A，Evangelista M et al.MicroRNA （miRNA）-mediated Interaction between Leukemia/ Lymphoma-related Factor （LRF） and Alternative splicing factor/splicing factor 2（ASF/SF2） affects mouse embryonic fibroblast senescence and apoptosis[J].Biol Chem，2010，285（39）：551-563.

[10] Karni R，Hippo Y，Lowe SW，Krainer AR.The splicing-factor oncoprotein SF2/ASF activates mTORC1.[J].Proc Natl Acad Sci USA.，2008，105（40）：15323-15327.

[11] Yamamoto Y，Yoshioka Y，Minoura K，Takahashi R，Takeshita F et al.An integrative genomic analysis revealed the relevance of microRNA and gene expression for drug-resistance in human breast cancer cells[J].Mol Cancer，2011，10（135）：39551-39563.

[12] Mathieu Laplante，David M，Sabatini.mTOR signaling at a glance[J].Cell Sci，2009， 122（20）：3589-3594.

[13] Kim VN. RNA interference in functional genomics and medicine[J].J Korean Med Sci， 2003，18（3）：309-318.

[14] SuiG，Soohoo C，Affarel B，et al.RNA interference in functional genomics and medicine [J].Proc Natl A cad Sci USA，2002，99（8）：5515-5520.

作者簡介：馬驍驍，東華大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)研究所，碩士研究生，研究方向：分子遺傳學(xué)；周宇荀，東華大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)研究所，副教授，研究方向：醫(yī)學(xué)分子遺傳學(xué)。

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2014-3-11 10：20：32

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/22.1186.S.20140311.1020.002.html

在細(xì)胞水平對小RNA進(jìn)行研究，可采用合成的雙鏈siRNA或者構(gòu)建在表達(dá)載體上的shRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行。由于有些類型細(xì)胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效果差，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)的siRNA半衰期短，體外合成siRNA對基因表達(dá)的抑制作用通常是短暫的，因而使其應(yīng)用受到較大的限制[13]。

采用事先在體外構(gòu)建能夠表達(dá)shRNA的載體， 然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄shRNA，不但使脂質(zhì)體有效轉(zhuǎn)染的細(xì)胞種類增加，而且對基因表達(dá)抑制效果也不遜色于體外合成siRNA，在長期穩(wěn)定表達(dá)載體的細(xì)胞中，甚至可以發(fā)揮長期阻斷基因表達(dá)的作用[14]。

本實(shí)驗(yàn)成功將miR-505的基因片段克隆到具有神經(jīng)元特異性的慢病度真核表達(dá)載體中，并通過瞬時轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染構(gòu)建的慢病毒載體在HEK293T細(xì)胞中EGFP熒光表達(dá)，實(shí)時定量PCR結(jié)果也表明HEK293T細(xì)胞中能高表達(dá)miR-505，證明構(gòu)建載體成功?？傊覀儗⒗脴?gòu)建成功的慢病毒表達(dá)載體對miR-505的功能進(jìn)行更加深入的研究，對miR-505調(diào)控的靶基因以及其他小分子RNA之間是否存在功能上的關(guān)聯(lián)進(jìn)行深入研究，以期進(jìn)一步闡明miR-505的功能。

參考文獻(xiàn)

[1] Doench J G，Sharp P A.Specificity of microRNA target selection in translational[J].Genes Dev，2004，18（5）：504-511.

[2] Brennecke J，Stark A，Russell R B，et al.Principles of microRNA-target recognition[J].PLoS Biol，2005，3（3）：e85-e85.

[3] Lewis B P，Burge C B，Bartel D P.Conserved seed pairing，often flanked by adenosines，indicates that thousands od human genes are microRNA targets[J].Cell，2005，120（1）：15-20.

[4] Bartel DP.MicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，and function[J].Cell，2004，116（2）：281-297.

[5] Ambros V，朱萬渠.MicroRNAs與疾病和發(fā)育[J].生命科學(xué)，2010，22（3）：29-31.

[6] Cockrell AS，Kafri T.Gene delivery by lentivirus vectors[J].Mol Biotechnol，2007，36（3）：184-204.

[7] Dittgen T，Nimmerjahn A，Komai S，Licznerski P，Waters J，Margrie TW，Helmchen F，Denk W， Brecht M，and Osten P.Lentivirus-based genetic manipulations of cortical neurons and their optical and electrophysiological monitoring invivo[J].Proc.Natl ac sci USA，2004，101（18）：206-211.

[8] 趙慧，鄭文嶺，崔東，馬文麗.泛素啟動子的研究進(jìn)展[J].廣東醫(yī)學(xué)，2003，24（12）：1376-1377.

[9] Verduci，L，Simili M，Rizzo M，Mercatanti A，Evangelista M et al.MicroRNA （miRNA）-mediated Interaction between Leukemia/ Lymphoma-related Factor （LRF） and Alternative splicing factor/splicing factor 2（ASF/SF2） affects mouse embryonic fibroblast senescence and apoptosis[J].Biol Chem，2010，285（39）：551-563.

[10] Karni R，Hippo Y，Lowe SW，Krainer AR.The splicing-factor oncoprotein SF2/ASF activates mTORC1.[J].Proc Natl Acad Sci USA.，2008，105（40）：15323-15327.

[11] Yamamoto Y，Yoshioka Y，Minoura K，Takahashi R，Takeshita F et al.An integrative genomic analysis revealed the relevance of microRNA and gene expression for drug-resistance in human breast cancer cells[J].Mol Cancer，2011，10（135）：39551-39563.

[12] Mathieu Laplante，David M，Sabatini.mTOR signaling at a glance[J].Cell Sci，2009， 122（20）：3589-3594.

[13] Kim VN. RNA interference in functional genomics and medicine[J].J Korean Med Sci， 2003，18（3）：309-318.

[14] SuiG，Soohoo C，Affarel B，et al.RNA interference in functional genomics and medicine [J].Proc Natl A cad Sci USA，2002，99（8）：5515-5520.

作者簡介：馬驍驍，東華大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)研究所，碩士研究生，研究方向：分子遺傳學(xué)；周宇荀，東華大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)研究所，副教授，研究方向：醫(yī)學(xué)分子遺傳學(xué)。

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2014-3-11 10：20：32

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/22.1186.S.20140311.1020.002.html

在細(xì)胞水平對小RNA進(jìn)行研究，可采用合成的雙鏈siRNA或者構(gòu)建在表達(dá)載體上的shRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行。由于有些類型細(xì)胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效果差，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)的siRNA半衰期短，體外合成siRNA對基因表達(dá)的抑制作用通常是短暫的，因而使其應(yīng)用受到較大的限制[13]。

采用事先在體外構(gòu)建能夠表達(dá)shRNA的載體， 然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄shRNA，不但使脂質(zhì)體有效轉(zhuǎn)染的細(xì)胞種類增加，而且對基因表達(dá)抑制效果也不遜色于體外合成siRNA，在長期穩(wěn)定表達(dá)載體的細(xì)胞中，甚至可以發(fā)揮長期阻斷基因表達(dá)的作用[14]。

本實(shí)驗(yàn)成功將miR-505的基因片段克隆到具有神經(jīng)元特異性的慢病度真核表達(dá)載體中，并通過瞬時轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染構(gòu)建的慢病毒載體在HEK293T細(xì)胞中EGFP熒光表達(dá)，實(shí)時定量PCR結(jié)果也表明HEK293T細(xì)胞中能高表達(dá)miR-505，證明構(gòu)建載體成功?？傊?，我們將利用構(gòu)建成功的慢病毒表達(dá)載體對miR-505的功能進(jìn)行更加深入的研究，對miR-505調(diào)控的靶基因以及其他小分子RNA之間是否存在功能上的關(guān)聯(lián)進(jìn)行深入研究，以期進(jìn)一步闡明miR-505的功能。

參考文獻(xiàn)

[1] Doench J G，Sharp P A.Specificity of microRNA target selection in translational[J].Genes Dev，2004，18（5）：504-511.

[2] Brennecke J，Stark A，Russell R B，et al.Principles of microRNA-target recognition[J].PLoS Biol，2005，3（3）：e85-e85.

[3] Lewis B P，Burge C B，Bartel D P.Conserved seed pairing，often flanked by adenosines，indicates that thousands od human genes are microRNA targets[J].Cell，2005，120（1）：15-20.

[4] Bartel DP.MicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，and function[J].Cell，2004，116（2）：281-297.

[5] Ambros V，朱萬渠.MicroRNAs與疾病和發(fā)育[J].生命科學(xué)，2010，22（3）：29-31.

[6] Cockrell AS，Kafri T.Gene delivery by lentivirus vectors[J].Mol Biotechnol，2007，36（3）：184-204.

[7] Dittgen T，Nimmerjahn A，Komai S，Licznerski P，Waters J，Margrie TW，Helmchen F，Denk W， Brecht M，and Osten P.Lentivirus-based genetic manipulations of cortical neurons and their optical and electrophysiological monitoring invivo[J].Proc.Natl ac sci USA，2004，101（18）：206-211.

[8] 趙慧，鄭文嶺，崔東，馬文麗.泛素啟動子的研究進(jìn)展[J].廣東醫(yī)學(xué)，2003，24（12）：1376-1377.

[9] Verduci，L，Simili M，Rizzo M，Mercatanti A，Evangelista M et al.MicroRNA （miRNA）-mediated Interaction between Leukemia/ Lymphoma-related Factor （LRF） and Alternative splicing factor/splicing factor 2（ASF/SF2） affects mouse embryonic fibroblast senescence and apoptosis[J].Biol Chem，2010，285（39）：551-563.

[10] Karni R，Hippo Y，Lowe SW，Krainer AR.The splicing-factor oncoprotein SF2/ASF activates mTORC1.[J].Proc Natl Acad Sci USA.，2008，105（40）：15323-15327.

[11] Yamamoto Y，Yoshioka Y，Minoura K，Takahashi R，Takeshita F et al.An integrative genomic analysis revealed the relevance of microRNA and gene expression for drug-resistance in human breast cancer cells[J].Mol Cancer，2011，10（135）：39551-39563.

[12] Mathieu Laplante，David M，Sabatini.mTOR signaling at a glance[J].Cell Sci，2009， 122（20）：3589-3594.

[13] Kim VN. RNA interference in functional genomics and medicine[J].J Korean Med Sci， 2003，18（3）：309-318.

[14] SuiG，Soohoo C，Affarel B，et al.RNA interference in functional genomics and medicine [J].Proc Natl A cad Sci USA，2002，99（8）：5515-5520.

作者簡介：馬驍驍，東華大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)研究所，碩士研究生，研究方向：分子遺傳學(xué)；周宇荀，東華大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)研究所，副教授，研究方向：醫(yī)學(xué)分子遺傳學(xué)。

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2014-3-11 10：20：32

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