李冬梅，張金娜，劉俊峰，施雪華

(哈爾濱工業(yè)大學 市政環(huán)境工程學院,城市水資源和水環(huán)境國家重點實驗室,黑龍江 哈爾濱 150090)

原子力顯微鏡是近年來較為重要的表面成像技術的進展之一，其原理[1-2]是利用激光束的偏轉(zhuǎn)法，將針尖制作在一個對微弱力極為敏感的V形的微懸臂上，微懸臂的另一端固定，使針尖趨近樣品表面并與表面輕輕接觸，由于針尖尖端原子與樣品表面原子之間存在著微弱的排斥力，當針尖進行掃描時，可通過反饋系統(tǒng)控制壓電陶瓷管伸縮來保持原子間的作用力恒定，帶有針尖的微懸臂將隨著樣品表面的起伏而顫動，利用光學監(jiān)測方法得到樣品表面形貌的信息。

原子力顯微鏡已經(jīng)在許多科研領域得到了廣泛的應用，包括微生物細胞的形態(tài)觀察[3-5]、生物大分子的結構觀察及生理生化過程分析[6-9]、化學材料的表面特征分析[10-11]。目前針對原子力顯微鏡系統(tǒng)成像的儀器參數(shù)優(yōu)化獲得高質(zhì)量圖像的研究相對較少，本文通過比較研究細菌的成像條件，優(yōu)化AFM系統(tǒng)的儀器操作參數(shù)，以期為原子力顯微鏡在環(huán)境微生物樣品的觀察過程中提供一定的參考依據(jù)。

1 材料方法

1.1 材料和儀器

目標菌株：本試驗采用的細菌菌株是從污泥中分離獲得的具有反硝化功能的菌株S。

實驗儀器：美國維易科公司Bioscope型號原子力顯微鏡(AFM)系統(tǒng)，探針型號為RTESP，彈性系數(shù)40 N/m；日本Olympus公司BX51型號光學顯微鏡。

1.2 樣品預處理

(1) 樣品收集：取液體培養(yǎng)中處于對數(shù)生長期的菌株S 1mL放于1.5 mL離心管中，5 000 r/min離心10 min，并棄去上清。

(2) 樣品純化：利用1×PBS 將樣品離心沖洗3 次。

(3) 樣品固定：加入200 μL、2.5%的戊二醛溶液，混勻后固定3 h。

(4) 載玻片清洗：將載玻片放入重鉻酸鉀洗液中浸泡過夜后，用蒸餾水沖洗3次，再用超純水沖洗3次，放置架上，于無菌操作臺中自然風干后備用。

(5) 上樣：在無菌操作臺中用微量移液器取10 μL固定后的菌液滴于載玻片中央，用接種環(huán)均勻涂布后自然風干。

(6) 光學顯微鏡觀察：將上樣風干后的載玻片放于光學顯微鏡下進行觀察，確定待觀察菌株的相對位置。

(7) 原子力顯微鏡觀察：調(diào)整原子力顯微鏡的成像條件進行菌株的形態(tài)觀察。

1.3 成像條件確定

利用原子力顯微鏡進行菌株的形態(tài)學表征，需要對原子力顯微鏡的成像條件進行優(yōu)化。細菌形態(tài)觀察的主要影響條件包括掃描頻率、掃描力及信號反饋信號的積分常數(shù)。本文采用輕敲模式，比較研究上述3個條件對細菌成像的影響。

2 結果與討論

2.1 不同掃描頻率對成像結果的影響

原子力顯微鏡系統(tǒng)中的掃描頻率決定圖像的掃描速度，頻率越高，探針在樣品表面的移動速度越快，對于表面結構復雜的細菌樣品來說，其表面的細微結構就很容易被忽略，得到的圖像信息相對較少而且也不夠清晰；頻率越慢，則探針在樣品表面的移動速度越慢，得到的圖像越清晰且圖像信息也相對完整，但耗時較長，增加了探針的磨損程度。因此，對于不同的樣品，應該采取不同的掃描頻率。

以菌株S為例，分別以0.2、0.5、1、1.5、2 Hz 5種掃描頻率進行細菌成像，并且固定其電壓輸出值為1 mv左右，積分常數(shù)/比例常數(shù)為0.6/0.8，得到細菌圖像見圖1。從成像結果可知，當頻率為1.5 Hz和2 Hz時，細菌圖像邊緣模糊變形，不能清晰顯示細菌圖像；而當頻率為0.2、0.5、1 Hz時，可以從圖片有半部分的相位像進行觀察分析，可以看出頻率為1 Hz時，其相位像表面較為粗糙；考慮到掃描時間過長會加快探針的磨損程度，應該選擇0.5 Hz作為菌株S的掃描速度。

圖1 5種掃描頻率的細菌圖像

2.2 不同掃描力對成像結果的影響

在原子力顯微鏡系統(tǒng)中掃描力的表現(xiàn)形式為輸出的電壓值，電壓值越大，探針對樣品的作用力越小。反之，電壓值越小，探針對樣品的作用力越大，探針跟蹤樣品越好，但需要注意，探針對樣品的力越大，越容易損傷樣品。在圖像觀察過程中，輸出的電壓是一個即時變化參數(shù)，需要根據(jù)兩條曲線是否相同進行不斷調(diào)整，以保證圖像宏觀的完整性且不易發(fā)生變形.

以菌株S為例，在2 Hz的掃描頻率積分常數(shù)/比例常數(shù)為0.6/0.8的條件下，固定其電壓輸出值為1.002 V時的效果如圖5所示，可以看出圖像發(fā)生變形，而及時調(diào)整電壓輸出值使trace、retrace曲線相趨近，此時的電壓輸出值為1.106 mV，效果見圖2，雖然相位像的效果較輸出電壓為1.002 mV 較為粗糙，但是菌體的效果圖并不發(fā)生變形，宏觀上圖像的信息較為完整。

圖2 掃描力為1.106 mV的細菌圖像

2.3 不同積分常數(shù)對成像結果的影響

原子力顯微鏡系統(tǒng)中的積分常數(shù)對探針探測的反饋信號進行數(shù)字到圖像轉(zhuǎn)換的效果有影響，如圖3所示。選擇合適的積分常數(shù)才能將圖像的三維結構顯示出來，積分常數(shù)越小，其圖像的立體結構較差，體現(xiàn)為平面圖像變形，如圖3(a)所示；積分常數(shù)越大，圖像的立體結構較強，但同時也會增加干擾信號，干擾信號在相位像中會體現(xiàn)出來，如圖3(d)所示；當控制積分常數(shù)/比例常數(shù)為0.4/0.6時，菌株S的邊緣效果與積分常數(shù)/比例常數(shù)為0.6/0.8時相比較為模糊。因此，獲得菌株S的最佳成像效果的積分常數(shù)/比例常數(shù)應為0.6/0.8。

圖3 不同的積分常數(shù)的細菌圖像

3 結論

原子力顯微鏡在環(huán)境微生物樣品的形態(tài)學鑒定及觀察中的應用越來越廣泛，本文針對原子力圖像觀察菌株樣品過程中的儀器參數(shù)調(diào)控進行了比較研究，具有一定的參考價值。結果表明：控制掃描頻率為0.5 Hz時獲得的圖像清晰度高；控制積分常數(shù)/比例常數(shù)為0.6/0.8時，原子力顯微鏡系統(tǒng)可以實現(xiàn)從數(shù)字到圖像最佳轉(zhuǎn)換，圖像的三維效果好，且背景的干擾信號較小；掃描力的控制體現(xiàn)在系統(tǒng)的電壓輸出值，該值的最佳數(shù)值應根據(jù)trace曲線和retrace曲線的變化即時調(diào)節(jié)，使二者趨于重合的電壓值即為最適掃描力。

[1] 張德添,何昆,張颯，等.原子力顯微鏡發(fā)展近況及其應用[J].現(xiàn)代儀器,2002(3):6-9.

[2] 劉歲林,田云飛,陳紅，等.原子力顯微鏡原理與應用技術[J].現(xiàn)代儀器,2006(6):9-12.

[3] kasas S，Ikai A.A method for anchoring round shaped cells for atomic force microscope imaging[J].Biophys J,1995,68:1678-1680.

[4] 王衛(wèi),曾柏全,龍小山，等.原子力顯微技術在貫徹微生物表面形態(tài)中的應用[J].微生物學雜志,2007,27(4):87-90.

[5] 齊浩,劉穎,莊樂南，等.細胞的原子力顯微鏡最佳成像條件研究[J].光子學報,2007,36(1):138-143.

[6] Yang Yuxiao,Wang Yongfeng,Xiong Kaili,et al.Study of the key technology of optical fiber biosensor[J].Acta Photonica Sinica,2005,34(1):121-125.

[7] Mizuta R,Iwai K,Shigeno M,et al.Molecular visualization of immunoglobulin swetch region RNA/DNA complex by atomic force microscope[J].J Biol Chem,2003,278:4431-4434.

[8] Tiner W J Sr,Potaman V N,Sinden R R.The structure of intramolecular triplex DNA:atomic forcemicroscopy study[J].J Mol Biol,2001,314:353-357.

[9] 汪新文,白春禮,朱傳風.DNA原子力顯微鏡成像方法研究[J].生物物理學報,1996,12(3):538-543.

[10] 林晶,閻永貴,陳光章,等.應用原子力顯微鏡研究硫酸鹽還原菌對A3鋼的腐蝕[J].中國腐蝕與防護學報,2007,27(2):70-73.

[11] Jones D A,Amy P S.A themodynamic interpretation of microbiolog cally influenced corrosion[J].Corrosion,2002,58(8)：638-645.