宮頸癌發(fā)病率居婦科惡性腫瘤之首,中晚期患者死亡率較高[1],尋找高效低毒的藥物具有重要的臨床意義。研究證實,多種人類腫瘤包括宮頸癌均高表達(dá)過氧化物酶體增殖物活化受體γ(peroxisome proliferators-activated receptor γ, PPARγ)[2]。PPAR激動劑噻唑烷二酮類化合物曲格列酮(Troglitazone, TGZ)除用于治療糖尿病外,還具有潛在的抗腫瘤作用,且其不良反應(yīng)相對較小[3]。p27是一種廣譜細(xì)胞周期蛋白激酶CDK的抑制劑,其表達(dá)異常導(dǎo)致多種腫瘤的異常增殖[4]。p27基因很少發(fā)生突變,其表達(dá)調(diào)控主要發(fā)生在蛋白降解水平,S期激酶相關(guān)蛋白2(skp2)可通過促進(jìn)對蛋白的泛素化降解,從而在多種腫瘤增殖中發(fā)揮重要的作用[5]。研究表明在多種腫瘤中,skp2表達(dá)的異常增高與腫瘤惡性程度及預(yù)后有關(guān)。在肝細(xì)胞癌等腫瘤中發(fā)現(xiàn)[6],曲格列酮可通過調(diào)控p27表達(dá),抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程。

本研究以宮頸癌SiHa細(xì)胞株為研究對象,觀察曲格列酮對體外培養(yǎng)的宮頸癌SiHa細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,并對其分子機(jī)制進(jìn)行初步探討,觀察skp2、p27在曲格列酮抗宮頸癌細(xì)胞增殖過程中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 曲格列酮終濃度溶于二甲亞砜(DMSO),-20 ℃保存。Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)),四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)液(BIOSHARP公司),pcDNA3.1-Myc 載體質(zhì)粒、pcDNA3.1-Myc-skp2表達(dá)質(zhì)粒由南京凱基生物科技發(fā)展有限公司合成,p21、p27、cyclinE1及skp2蛋白抗體購自santa cruz公司。倒置顯微鏡(Olympus公司,日本),SW-CJ-1FD型超凈工作臺(蘇州凈化),酶標(biāo)儀(BIO-RAD公司),流式細(xì)胞儀(FACS Calibur Becton-Dickinson)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 宮頸癌SiHa細(xì)胞株(由南京醫(yī)科大學(xué)藥理研究室惠贈)置于含10%胎牛血清高糖型DMEM培養(yǎng)基(含10 U/L青霉素和100 mg鏈霉素,Hyclone公司)中,于37 ℃,5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2～3 d換液1次。細(xì)胞分為空白對照組、曲格列酮藥物實驗組(100、200、400 μg/ml)。

1.3 細(xì)胞增殖檢測 細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(5×103個細(xì)胞/孔),檢測24、48、72 h時細(xì)胞增殖情況。每孔加入MTT(5 mg/ml),培養(yǎng)4 h后各孔加入DMSO孵育30 min,微量振蕩器振蕩10 min使結(jié)晶物充分溶解,酶標(biāo)儀在490 nm波長下檢測每孔的吸光度(OD)值,設(shè)3個復(fù)孔,細(xì)胞生長抑制率(%)=(陰性組OD值-實驗組OD值)/陰性組OD值×100%。

1.4 細(xì)胞周期測定 SiHa細(xì)胞(2×105個/ml)接種于6 cm培養(yǎng)皿培養(yǎng)12 h,換DMEM 培養(yǎng)液(0.5% FBS)培養(yǎng)24 h以周期同步化。曲格列酮(400 mg/ml)作用24、48、72 h后,收集細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液,70% 冷乙醇固定,4 ℃過夜,PBS洗去固定液,加 RNaseA 20 μl、37 ℃ 孵育30 min,加碘化丙啶(propidium iodide,PI)染液冰浴30 min,300目篩網(wǎng)過濾后調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/ml,上流式細(xì)胞儀檢測。

1.5 細(xì)胞凋亡率檢測 采用Annexin V-FITC染色法檢測細(xì)胞凋亡,細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(1×105個細(xì)胞/孔),分別檢測24、48、72 h時細(xì)胞凋亡率。0.25%胰酶(不含EDTA)消化收集細(xì)胞,PBS洗滌2次后離心(2000 r/min,5 min)，收集并懸浮細(xì)胞至流式管,加入5 μl Annexin V-FITC混勻,再加入PI 5 μl混勻;室溫、避光反應(yīng)15 min，流式細(xì)胞儀檢測(Ex=488 nm;Em=530 nm)。

1.6 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 按Lipofectamin2000說明書進(jìn)行,細(xì)胞接種于24孔板,貼壁后繼續(xù)培養(yǎng)至50%～80%密度時進(jìn)行轉(zhuǎn)染實驗;質(zhì)粒DNA、脂質(zhì)體分別加入無血清培養(yǎng)基中,再將兩者混勻室溫孵育30 min,加入培養(yǎng)皿各孔細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染后24 h更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.7 Western blot檢測p21、skp2、p27蛋白的表達(dá) 細(xì)胞棄培養(yǎng)液,預(yù)冷PBS洗3次,RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞內(nèi)蛋白,BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量,用8%SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳分離,轉(zhuǎn)PVDF膜。封閉液室溫封閉1 h,按適當(dāng)比例加入一抗,4 ℃孵育過夜,TBST 洗3次,按1∶3000的稀釋倍數(shù)加入辣根酶標(biāo)記的二抗,室溫孵育1 h,TBST 洗3次,用ECL顯色并曝光于X膠片,Image J軟件的圖像分析儀分析。

2 結(jié)果

2.1 曲格列酮對SiHa細(xì)胞增殖的影響

2.1.1 曲格列酮抑制宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖:與對照組相比,SiHa細(xì)胞加入曲格列酮24 h后,藥物組可見細(xì)胞增殖受到抑制,其中200 μg/ml和400 μg/ml組的生長抑制作用明顯增強(qiáng)(P<0.05);藥物作用48、72 h時,曲格列酮各組均可見到細(xì)胞抑制率明顯增加(P<0.05),提示曲格列酮抑制SiHa細(xì)胞增殖,隨著藥物濃度及作用時間的增加,其生長抑制作用明顯增強(qiáng),呈時間和濃度依賴性。見圖1。

注：與對照組比較，*P<0.05圖1 不同濃度曲格列酮藥物對宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖抑制作用

2.1.2 流式細(xì)胞術(shù)分析曲格列酮對宮頸癌SiHa細(xì)胞周期的影響:曲格列酮(400 mg/ml)作用于宮頸癌SiHa細(xì)胞0、24、48、72 h時,處于G0/G1期的檢測細(xì)胞數(shù)分別為48.58%、52.96 %、54.83%、69.02%,而G2期和S期的細(xì)胞數(shù)目則相應(yīng)減少。見圖2。

2.2 曲格列酮對SiHa細(xì)胞凋亡的影響 曲格列酮(0、100、200、400 μg/ml)作用于宮頸癌SiHa細(xì)胞后,流式細(xì)胞儀檢測顯示24 h總凋亡率分別為2.7%、3.8%、3.7%、6.7%,48 h后凋亡率為3.0%、5.7%、4.3%、5.5%,72 h后凋亡率為4.4%、5.9%、6.1%、7.0%,各時間點及劑量點之間比較,未見顯著差異(P>0.05)。

圖2 曲格列酮對人宮頸癌SiHa細(xì)胞周期的影響

2.3 曲格列酮抑制SiHa細(xì)胞增殖的機(jī)制研究

2.3.1 曲格列酮對p21、p27表達(dá)的影響:PPARγ及其配體可通過細(xì)胞周期依賴性激酶抑制素(CKI)抑制細(xì)胞增殖。因而,本研究對400 mg/ml濃度曲格列酮作用于SiHa細(xì)胞0、24、48、72 h后p21、p27的表達(dá)水平進(jìn)行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),p21在SiHa細(xì)胞中表達(dá)較弱,并且隨作用時間延長,其表達(dá)呈現(xiàn)微弱增強(qiáng);而400 mg/ml濃度曲格列酮作用24 h后p27蛋白表達(dá)即出現(xiàn)顯著增高,隨時間延長表達(dá)水平逐漸增高。曲格列酮對p27、skp2蛋白表達(dá)的影響:前面實驗檢測曲格列酮作用于SiHa細(xì)胞后,p27表達(dá)顯著增高,skp2參與p27蛋白表達(dá)調(diào)控,因而,進(jìn)一步檢測 p27、skp2在曲格列酮(400 mg/ml)作用后的表達(dá)變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)濃度為400 mg/ml曲格列酮作用于SiHa細(xì)胞0、24、48、72 h后,p27與skp2的表達(dá)呈現(xiàn)明顯相反趨勢。見圖3。

圖3 曲格列酮對p21、p27、skp2蛋白表達(dá)的影響(GAPDH為內(nèi)參)

2.3.2 skp2過表達(dá)對曲格列酮提高p27表達(dá)水平及抑制細(xì)胞周期進(jìn)程的影響：由于曲格列酮作用于SiHa細(xì)胞后p27、skp2表達(dá)呈明顯相反趨勢，為了驗證p27、skp2蛋白在曲格列酮調(diào)節(jié)細(xì)胞周期中的作用，構(gòu)建pcDNA3.1、pcDNA3.1-skp2表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞。skp2表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，p27明顯下調(diào)。曲格列酮(400 mg/ml)作用于轉(zhuǎn)染pcDNA3.1細(xì)胞后，p27表達(dá)水平隨時間延長逐漸升高，skp2表達(dá)呈相反趨勢；而作用于轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-skp2表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞后，前面p27蛋白表達(dá)上調(diào)現(xiàn)象消失。見圖4，5。

圖4 skp2表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞后p27、skp2表達(dá)(GAPDH為內(nèi)參)

注:圖A為pcDNA3.1-Myc空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染;圖B為pcDNA3.1-skp2表達(dá)質(zhì)粒圖5 pcDNA3.1-Myc空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及pcDNA3.1-skp2表達(dá)質(zhì)粒(GAPDH為內(nèi)參)

為進(jìn)一步驗證曲格列酮對轉(zhuǎn)染skp2細(xì)胞周期的影響,流式細(xì)胞儀實驗結(jié)果顯示,曲格列酮(400 mg/ml)作用于skp2表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的SiHa細(xì)胞0、24、48 h后,G1/S期比例為49.4%,52.15%和52.96%,細(xì)胞周期的抑制作用明顯減弱。

3 討論

PPAR是一類由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子亞型,屬于Ⅱ型核受體超家族,其生物學(xué)功能復(fù)雜,參與調(diào)節(jié)脂類、糖代謝、炎癥反應(yīng)、腫瘤細(xì)胞分化及凋亡等過程,其中PPARγ及其激動劑目前研究最為廣泛。噻唑烷二酮類化合物曲格列酮,是一種人工合成的PPARγ激動劑,最初作為胰島素增敏劑用于糖尿病研究,后來發(fā)現(xiàn)其不僅可以調(diào)節(jié)糖脂代謝作用,還具有抗動脈粥樣硬化、抑制炎癥反應(yīng)、抑制血糖效應(yīng)等生物學(xué)活性[7-8]。近年來研究證明,PPARγ 激動劑對多種腫瘤細(xì)胞具有誘導(dǎo)抑制分化及抗腫瘤作用[9]。

3.1 曲格列酮抑制宮頸癌細(xì)胞生長增殖 本研究顯示,曲格列酮對宮頸癌細(xì)胞生長具有明顯抑制作用,且呈時間和劑量依賴性。在胃癌的研究中[10],曲格列酮均顯示了良好的抗腫瘤增殖作用,與本研究結(jié)果一致。惡性腫瘤生物學(xué)行為包括失控性增殖生長及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,無限增殖能力與細(xì)胞周期失調(diào)及抗凋亡有關(guān)。我們用不同濃度曲格列酮作用于宮頸癌細(xì)胞,細(xì)胞未見明顯核皺縮、邊聚的細(xì)胞凋亡形態(tài)特征。我們對細(xì)胞周期進(jìn)行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn):400 mg/L曲格列酮作用后,宮頸癌細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例顯著增高,S期及G2期比例明顯下降, 并呈現(xiàn)明顯的時間依賴性,提示曲格列酮作用后,細(xì)胞可能發(fā)生G1/S期阻滯進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。

3.2 曲格列酮通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期而非凋亡途徑抗宮頸癌增殖的機(jī)制 本研究首次發(fā)現(xiàn),曲格列酮通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期而非凋亡途徑對宮頸癌SiHa腫瘤細(xì)胞具有抗增殖作用。與本研究結(jié)果不同,近期Chen等[11]在宮頸癌Hela細(xì)胞的研究顯示,曲格列酮的抗腫瘤效應(yīng)與凋亡途徑有關(guān),并與p53泛素化密切相關(guān),TGZ-PPAR-γ-p53信號通路在TGZ促調(diào)亡中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用。由于不同宮頸癌細(xì)胞系之間存在組織病理學(xué)、基因表達(dá)的差異,Hela細(xì)胞為p53基因突變型,而SiHa細(xì)胞為p53基因野生型,p53基因在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)及凋亡過程中均發(fā)揮重要作用,其基因型差異會造成生物學(xué)行為不同,未來可擴(kuò)大研究以進(jìn)一步明確或發(fā)現(xiàn)與之相關(guān)的基因表達(dá)變化及信號通路?？傊?研究提示曲格列酮在不同腫瘤細(xì)胞中具有抗腫瘤增殖作用,其作用途徑可能存在差異。

既往研究表明人宮頸癌組織存在p27表達(dá)下調(diào)現(xiàn)象,并與宮頸癌的預(yù)后呈明顯相關(guān)性,而p27作為細(xì)胞周期重要抑制素,其主要在G1/S轉(zhuǎn)換期發(fā)揮作用,因此,我們用不同濃度曲格列酮作用于宮頸癌細(xì)胞,并檢測p27蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示曲格列酮顯著提高細(xì)胞p27的表達(dá)水平,并呈明顯的劑量依賴性。由于在腫瘤細(xì)胞中,p27 mRNA水平相對恒定,p27蛋白水平調(diào)節(jié)主要發(fā)生在蛋白質(zhì)降解水平[12]。p27蛋白活性及降解與該蛋白的磷酸化、泛素化降解有關(guān)。skp2是p27泛素化降解的重要因素,在多種腫瘤中,存在skp2表達(dá)上調(diào),從而下調(diào)p27水平實現(xiàn)細(xì)胞的增殖[13]。因此,我們又進(jìn)一步檢測了skp2、p27表達(dá)相關(guān)性,結(jié)果顯示曲格列酮作用于細(xì)胞后skp2、p27水平呈現(xiàn)相反趨勢,曲格列酮顯著提高細(xì)胞p27表達(dá)水平,提示曲格列酮可能通過skp2調(diào)節(jié) p27的表達(dá)。宮頸癌SiHa細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和skp2表達(dá)質(zhì)粒后, Western blot檢測發(fā)現(xiàn),skp2過表達(dá)后,曲格列酮提高細(xì)胞p27蛋白表達(dá)作用被明顯抵消,提示曲格列酮可能主要通過抑制skp2表達(dá)從而提高p27的表達(dá)水平。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),skp2過表達(dá)后,曲格列酮對細(xì)胞周期進(jìn)程抑制作用消失。以上研究說明,曲格列酮可能是通過下調(diào)skp2,進(jìn)而上調(diào)G1/S期重要的細(xì)胞周期素p27的表達(dá),產(chǎn)生對SiHa細(xì)胞的G1/S周期的阻滯作用。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),曲格列酮體外具有明顯抑制宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖作用,其機(jī)制可能通過抑制skp2表達(dá),從而提高細(xì)胞p27蛋白水平實現(xiàn)。

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