吳紅彥， 鄧健男， 李海龍， 楊植媛， 邱家權(quán)， 夏 琦

(1.甘肅中醫(yī)學(xué)院， 甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、甘肅省中藥新產(chǎn)品創(chuàng)制工程實(shí)驗(yàn)室， 甘肅 蘭州 730000)

老年性癡呆，又稱阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)，是一種病程隱匿、緩慢的神經(jīng)退行性疾病?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，AD的發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，現(xiàn)AD的發(fā)病機(jī)制學(xué)說已經(jīng)達(dá)到十余種[1-2]。在其眾多的病因?qū)W說中，氧化應(yīng)激學(xué)說占據(jù)著主導(dǎo)地位[3]。中醫(yī)目前多將此病歸于“神呆”范疇。認(rèn)為其病位在腦，與心、肝、腎功能失調(diào)關(guān)系密切[4]。發(fā)病以內(nèi)因?yàn)橹鳎瑲?、血、痰、瘀纏結(jié)為患。腦髓空虛，氣血不足致心神失養(yǎng)，屬本虛標(biāo)實(shí)之疾[5]?，F(xiàn)有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究也印證了從肝脾論治的可行性[6-9]。本次實(shí)驗(yàn)分別參考王亞利[10]、曲喜英[11]等的，建立AD兩種經(jīng)典的體外模型，運(yùn)用肝脾腎同治的黑逍遙散(逍遙散+熟地黃)含藥血清干預(yù)AD體外模型，以期進(jìn)一步闡釋黑逍遙散治療AD的機(jī)理。

1 材料與儀器

SPF級(jí)大鼠40只，雌性，體重(200±20)g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院科研動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。黑逍遙散各組藥材均由甘肅中醫(yī)院藥房提供，LDH、T-SOD、MDA試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供，批號(hào)：20110928。DMEM培養(yǎng)基由sigma公司提供，批號(hào)：20120430。Aβ25-35淀粉肽由上海強(qiáng)耀生物科技有限公司提供，批號(hào)：20120405；雙氧水批號(hào)：121109。PC-12細(xì)胞由上海中科院生物研究所提供。Benchmark plus連續(xù)波長酶標(biāo)儀(上海新振儀器設(shè)備有限公司)，倒置顯微鏡(日本奧林巴斯光學(xué)株式會(huì)社，型號(hào)：IX71)。

2 方法

3 結(jié)果

3.1 不同濃度黑逍遙散含藥血清對(duì)兩種造模方法PC12細(xì)胞活力的影響 與空白對(duì)照組比較，淀粉肽溶液(20μmol/L)模型組細(xì)胞存活率顯著降低，差異有顯著意義(P<0.05)；與模型組比較，各個(gè)給藥組細(xì)胞存活率有顯著提高，差異有顯著意義(P<0.05)。(見表1)

表1 黑逍遙散含藥血清對(duì)淀粉肽(20μmol/L)造模各組細(xì)胞存活率的影響

與空白對(duì)照組比較，H2O2溶液(300μmol/L)模型組細(xì)胞存活率顯著降低，差異有顯著意義(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組細(xì)胞存活率明顯提高，差異具有顯著意義(P<0.05)。(見表2)

表2 300μmol/L的H2O2溶液造模組測試PC12細(xì)胞存活率的影響

3.2 不同濃度的黑逍遙散對(duì)兩種造模方法PC12細(xì)胞T-SOD、LDH酶活性及MDA含量的影響 與空白對(duì)照組比較，淀粉肽溶液(20μmol/L)模型組T-SOD酶、LDH酶活性顯著下降，MDA含量顯著升高，2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，各組細(xì)胞溶液T-SOD酶、LDH酶活性顯著增強(qiáng)，MDA含量顯著降低(P<0.05)。當(dāng)不同濃度的黑逍遙散含藥血清作用于PC12細(xì)胞后，與血清組比較，10%濃度含藥血清細(xì)胞組T-SOD酶、LDH酶活性顯著增強(qiáng)，MDA含量顯著降低(P<0.05)。(見表3)

表3 淀粉肽(20μmol·L-1)干預(yù)72h后對(duì)PC12細(xì)胞的酶學(xué)指標(biāo)影響

3.3 與空白對(duì)照組比較，H2O2(300μmol/L)模型組T-SOD酶、LDH酶活性顯著下降，MDA含量顯著升高，2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，各組細(xì)胞溶液T-SOD酶、LDH酶活性顯著增強(qiáng)，MDA含量顯著降低(P<0.05)。當(dāng)不同濃度的黑逍遙散含藥血清作用于PC12細(xì)胞后，與血清組比較，10%濃度含藥血清細(xì)胞組T-SOD酶、LDH酶活性顯著增強(qiáng)，MDA含量顯著降低(P<0.05)。(見表4)

表4 H2O2(300μmol/L)干預(yù)16H對(duì)PC12的酶學(xué)影響

4 討論

AD有三大病理特征：老年斑、神經(jīng)元大量丟失、神經(jīng)纖維纏結(jié)。已經(jīng)有文獻(xiàn)表明[3，12]，氧化應(yīng)激與AD的三大病理特征都有著密切關(guān)系：Aβ淀粉肽主要來自于Aβ肽的碳端蛋氨酸殘基，后者能產(chǎn)生過氧化物并促進(jìn)氧化反應(yīng)，還可使可溶性Aβ淀粉肽變成不溶性淀粉肽，導(dǎo)致老年斑的產(chǎn)生；自由基能攻擊不飽和脂肪酸，造成膜結(jié)構(gòu)的損傷，破壞核酸，引起蛋白質(zhì)表達(dá)異常，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡；自由基還會(huì)引起鈣離子超載，導(dǎo)致蛋白磷酸酶與蛋白酶比例失調(diào)，從而引起tau蛋白異常磷酸化，進(jìn)一步形成神經(jīng)纖維纏結(jié)。超氧化物歧化酶(SOD)是機(jī)體內(nèi)清除自由基的重要酶之一，催化自由基的歧化反應(yīng)，其活性直接反映出機(jī)體清除自由基的能力；在細(xì)胞受損時(shí)，乳酸脫氫酶(LDH)由細(xì)胞內(nèi)流出，其濃度的高低，反映出細(xì)胞受損的程度；丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過氧化物的終端產(chǎn)物，可間接反映細(xì)胞受損程度，在神經(jīng)細(xì)胞壞死中，AD的發(fā)生發(fā)展過程中，占有重要位置。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，Aβ25-35淀粉肽(20μmol/L)與H2O2(300μmol/L)誘導(dǎo)的PC12損傷的模型組細(xì)胞存活率均顯著降低，差異具有顯著意義(P<0.05)：與兩組模型組比較，各個(gè)給藥組細(xì)胞T-SOD、LDH活性顯著升高，MDA含量顯著降低，差異具有顯著意義(P<0.05)。

黑逍遙散方中組成藥物看：當(dāng)歸、白術(shù)、茯苓、甘草有效成分阿魏酸、雙白術(shù)內(nèi)酯、茯苓多糖、異甘草素、甘草總黃酮有不同程度的抗氧化、抗衰老、提高記憶力等作用[13-17]，熟地具有雌性激素樣作用，可能對(duì)癡呆有一定影響。史佳琳等[18]發(fā)現(xiàn)地黃寡糖預(yù)孵育能提高細(xì)胞存活率、減少LDH滲漏，從而減輕谷氨酸對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損害程度。董榕等[19]發(fā)現(xiàn)柴胡注射液則能使噪音組迅速升高的T-SOD、MDA含量接近正常組，能明顯增加小鼠正確反應(yīng)次數(shù)(P<0.01)，結(jié)合本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果黑逍遙散顯示的抗氧化能力，這些也都為黑逍遙散治療AD提供了藥理學(xué)基礎(chǔ)。

本次實(shí)驗(yàn)通過兩個(gè)比較經(jīng)典的AD體外模型實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，黑逍遙散均能顯著地提高機(jī)體T-SOD，LDH的生物活性，降低MDA含量，這也表明黑逍遙散治療AD的功效可能與提高機(jī)體抗氧化能力密切相關(guān)。

參考資料：

[1]張均田.神經(jīng)元-突觸丟失與老年癡呆[J].神經(jīng)藥理學(xué)報(bào)，2011，1(1)：1-15.

[2]Lewczuk P，Esselmann H，Bibl M，et al.Tau protein phosphorylated at threonine 18l in CSF as neurochemical biomarker in Alzheimer’s disease：original data and review of the literature[J].Mol Neuresci，2004，23(2)：115-22.

[3]于德紅，魏朝良，包永明，等.阿爾茨海默病與氧化應(yīng)激[J].生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2006，23(5)：1142-1144.

[4]李康銘，唐 農(nóng).老年性癡呆中醫(yī)病因病機(jī)研究進(jìn)展[J].光明中醫(yī)，2012，27(9)：1926-1928.

[5]傅喆暾，黃寶康.補(bǔ)腎中藥防治老年癡呆癥研究進(jìn)展[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2003，23(1)：32-34.

[6]瞿禮萍，曾 南，盧陸飛，等.逍遙散對(duì)小鼠記憶力的影響[J].中藥藥理與臨床，2008，24(6)：1-3.

[7]吳紅彥，王彩霞.黑逍遙散對(duì)AD小鼠學(xué)習(xí)記憶及抗氧化能力的影響[A].甘肅中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，27(1)：9-11.

[8]吳紅彥，王虎平，王彩霞.黑逍遙散對(duì)老年性癡呆的防治作用及其機(jī)制研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2011，22(4)：921-913.

[9]吳紅彥，王虎平.從肝脾論治老年性癡呆及逍遙散對(duì)老年癡呆模型小學(xué)習(xí)記憶能力、中樞膽堿能神經(jīng)元活性的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，5(16)：190-192.

[10]王亞利，宋天保，路明，等.Aβ誘導(dǎo)PC-12細(xì)胞凋亡建立阿爾茨海默病細(xì)胞模型[J].西安醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，23(2)：129-132.

[11]曲喜英，祝其鋒.復(fù)方丹參注射液對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用[J].中國新藥雜志，2005，14(11)：1284-1288.

[12]卓燁燁，張漢霆，徐江平.氧化應(yīng)激與阿爾采末病[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2010，26 (4)：435-437.

[13]金蓓蓓，陳 勤，陳慶林.阿魏酸對(duì)擬癡呆小鼠學(xué)習(xí)記憶和海馬膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達(dá)的影響[J].激光生物學(xué)報(bào)，2011，20(4)：484-489.

[14]馮 星，王正濂，林永成，等.雙白術(shù)內(nèi)酯對(duì)Aβ1-40致癡呆模型大鼠的作用[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2009，25(7)：949-951.

[15]金 惠，趙英博，江 維，等.茯苓藥理作用及臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J].湖北中醫(yī)雜志，2008，30(4)：59-61.

[16]朱敏娟，楊 靜.異甘草素對(duì)丙泊酚致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的影響[J].數(shù)理醫(yī)藥學(xué)雜志，2011，24(2)：170-172.

[17]葉懷義，龔賦嵐，尚 明.甘草黃酮抗衰老作用的研究[J].哈爾濱商業(yè)大學(xué)報(bào)，2004，20(1)：93-97.

[18]史佳琳，楊 菁，徐新利，等.地黃寡糖對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元損傷的影響[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2009，25(3)：357-361.

[19]董 榕，劉伲娜，昊同智，等.柴胡注射液對(duì)噪音所致學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠的改善作用及機(jī)制[J].中國行為醫(yī)學(xué)科學(xué)，2007，16(12)：1074-1076.