李玲玲，張 偉，杜 蕊，宋玲珍，柴學軍，胡新德，陳樹林，趙善廷

(1 西北農(nóng)林科技大學 動物醫(yī)學院，陜西 楊凌 712100；2 Institute of Anatomy and Cell Biology,University of Freiburg,Freiburg 79104,Germany)

運動是生命細胞的基本特征之一。對大多數(shù)細胞而言，其運動能力離不開肌動蛋白、肌球蛋白以及一些調(diào)節(jié)蛋白對微絲和微管的調(diào)節(jié)作用。肌動蛋白解聚因子(Actin depolymerizing factor，ADF)/Cofilin家系成員之一的絲切蛋白(Cofilin)，是普遍存在于真核生物中的一種低分子質(zhì)量的肌動蛋白結(jié)合蛋白，它通過結(jié)合和剪切F-肌動蛋白(F-actin)，改變F-actin骨架結(jié)構(gòu)，發(fā)揮調(diào)節(jié)細胞定向運動的功能，在細胞趨化、遷移中發(fā)揮關鍵作用[1-4]。Cofilin的活性通過磷酸化、去磷酸化、磷酸肌醇化、pH改變等方式進行調(diào)節(jié)，其中磷酸化與去磷酸化是Cofilin響應胞內(nèi)外刺激信號改變最重要的調(diào)節(jié)方式。Cofilin失活可引發(fā)多種疾病，如癌癥、阿爾茲海默癥、局部缺血性腎病等[5]。

哺乳動物cofilin基因有2種亞型：cofilin-1和cofilin-2，分別編碼不同的蛋白。cofilin-1 (cfl1)在多種非肌肉組織中表達，特別是在腦和肝臟中；而cofilin-2主要在肌肉組織中表達。研究發(fā)現(xiàn)，ADF-/-敲除小鼠胚胎可以成活[6]，并完成正常的胚胎發(fā)育，而cfl1-/-敲除小鼠胚胎不能正常成活，胚胎于9.5 d死亡[7]。cfl1-/-腦特異性敲除小鼠的大腦皮層細胞遷移和細胞周期均受到影響，表明在小鼠胚胎發(fā)育過程中大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的遷移離不開cfl1的調(diào)節(jié)作用[8]。

研究表明，Cofilin N端第3位絲氨酸磷酸化后，使Cofilin無法與肌動蛋白結(jié)合，失去解聚功能[9]；相反，p-Cofilin去磷酸化使Cofilin活化[10]。第3位絲氨酸突變?yōu)镾3A可使Cofilin不被磷酸化，始終處于活化狀態(tài)；S3E或S3D的突變則使Cofilin類磷酸化，Cofilin始終保持失活狀態(tài)[11]。

體外試驗表明，Cofilin過表達[12-13]或Cofilin Ser 3位點點突變可引起細胞運動障礙[14- 15]，但Cofilin-1 (Cfl1)及其Ser 3位點磷酸化在神經(jīng)元遷移中的作用機制仍不清楚。為了進一步研究Cfl1在神經(jīng)元遷移中的作用機制，本試驗以小鼠的cfl1基因為研究對象，經(jīng)點突變技術(shù)，構(gòu)建Cfl1的野生型、持續(xù)活化型和持續(xù)失活型真核表達載體，通過細胞轉(zhuǎn)染和mRNA半定量檢測,體外觀察其表達情況，并利用活體原位電轉(zhuǎn)的方法在雞胚脊髓神經(jīng)元中檢測其表達情況，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材 料

昆白系小鼠，購自中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學實驗動物中心；種雞蛋購自陜西楊凌種雞廠；大腸桿菌感受態(tài)細胞Trans5α、克隆載體pEASY-T1 Simple、Trans2K DNA Marker、Trans5K DNA Marker，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒，購自Promega公司；Platinum?TaqDNA Polymerase High Fidelity、M-MLV cDNA合成試劑盒、LipofectamineTM2000、Trizol試劑、Rabbit-anti-GFP、Donkey-anti-rabbit-488、Goat-anti-mouse-568，均購自Invitrogen Life Technologies；胎牛血清，購自Hyclone公司；D-MEM/F-12、Opti-MEM，購自Gibco公司；TRITC-conjugated Phalloidin、DAPI，購自Millipore公司；Anti-Myc Tag Monoclonal Antibody，購自Santa Cruz公司。CHO細胞系、pCAG-MCS-myc和pCAG-EGFP載體為本實驗室保存；引物合成(PAGE純化方式)及測序工作由生工生物(上海)有限公司完成。

1.2 小鼠cfl1基因的克隆與分析

1.2.1 小鼠cfl1基因的克隆 根據(jù)小鼠cfl1基因的CDS區(qū)序列(GenBank序列號NM_007687)，用DNAMan軟件設計包括整個基因閱讀框的特異性引物F/P1和R/P1(表1)。取成年小鼠大腦組織提取RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得總cDNA，以該cDNA為模板進行PCR擴增，PCR反應體系為：2×TaqPCR StarMix 10 μL，F(xiàn)/P1 0.75 μL，R/P1 0.75 μL，cDNA 5 μg，用ddH2O補足25 μL。反應程序如下：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，共32個循環(huán)；68 ℃后延伸5 min。將擴增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后回收目的條帶，與pEASY-T1 Simple載體于室溫下連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞Trans5α，經(jīng)菌液PCR、酶切及測序鑒定后保留陽性克隆，將其命名為pEASY-T1-cfl1。

表 1 試驗用所引物及其序列

1.2.2 不同物種cfl1基因編碼蛋白的生物信息學分析 通過NCBI(Bethesda，MD,USA,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公共數(shù)據(jù)庫查找不同物種Cofilin蛋白的氨基酸序列，并利用UniPro (http://www.uniprot.org/)獲得氨基酸序列的主要結(jié)構(gòu)域和關鍵位點信息，通過DNAman version 5.2.2 (Lynnon Biosoft Company，USA)進行多序列比對分析。

1.3 cfl1基因真核表達載體的構(gòu)建

采用經(jīng)引物引入點突變的方法，參考靶基因cfl1的閱讀框，用DNAMan軟件設計3條上游引物，依次為F/P2、F/P3、F/P4(表1)，分別用于野生型、活化型和失活型Cfl1 3種真核表達載體的構(gòu)建。F/P2、F/P3、F/P4 3條上游引物的5′端引入EcoRⅠ酶切位點，同時加保護性堿基(Kozak序列)以增強目的片段的轉(zhuǎn)錄；下游引物為公用的R/P，其5′端引入BglⅡ酶切位點，同時補加堿基以防止移碼突變。以1.2.1節(jié)構(gòu)建的質(zhì)粒pEASY-T1-cfl1為模板，利用高保真聚合酶進行PCR擴增。用EcoRⅠ和BglⅡ?qū)厥盏哪康钠魏驼婧吮磉_載體pCAG-MCS-myc雙酶切，回收的目的條帶經(jīng)T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建pCAG-cfl1(wt)-myc(pCAG-cfl1-wt)、pCAG-cfl1(S3A)-myc(pCAG-cfl1-S3A)和pCAG-cfl1(S3D)-myc(pCAG-cfl1-S3D)3種真核表達載體(圖1)。轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞Trans5α，經(jīng)菌液PCR、EcoRⅠ/BglⅡ雙酶切及測序鑒定后保留相應陽性克隆。

1.4 小鼠cfl1在細胞中表達的半定量分析

1.4.1 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將CHO細胞接種到含體積分數(shù)10%胎牛血清和青鏈霉素 (100 U/mL 青霉素、100 U/mL 鏈霉素)的DMEM/F12((DMEM與F12體積比為1∶1)培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)皿置于37 ℃、體積分數(shù)5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞融合度達到70%～90%時，參照LipofectamineTM2000的使用說明，用pCAG-MCS-myc、pCAG-cfl1-wt、pCAG-cfl1-S3A和pCAG-cfl1-S3D轉(zhuǎn)染細胞，以未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的正常CHO細胞作為對照(Control)。

1.4.2 Cfl1 mRNA表達量的半定量RT-PRC分析 將真核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的CHO細胞培養(yǎng)24 h后提取總RNA，備用。設計半定量引物F/P5和R/P5(表1)，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參基因，檢測重組質(zhì)粒的表達能力。以總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，反應體系為：總RNA 2.5 μg，5×Reaction Buffer 4 μL,OligodT 2 μL，10 mmol/L dNTPs 1 μL，RNase Inhibitor 1 μL，RT-Enzmye 1 μL，用DEPC水補足20 μL體系。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，進行目的片段的擴增，反應體系為：2×TaqPCR StarMix 10 μL，F(xiàn)/P5 0.75 μL，R/P5 0.75 μL，cDNA 5 μg，用ddH2O補足25 μL體系。反應程序如下：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)；68 ℃后延伸5 min。取PCR產(chǎn)物20 μL進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳。

圖 1 pCAG-cfl1-myc真核表達載體的構(gòu)建原理

1.4.3 細胞爬片的免疫熒光染色 制備CHO細胞爬片，待細胞融合度達到25%～40%時，根據(jù)LipofectamineTM2000使用說明用pCAG-cfl1的3種真核表達載體轉(zhuǎn)染CHO細胞，24 h后，爬片經(jīng)40 g/L多聚甲醛固定、體積分數(shù)0.1% Triton X-100透化、體積分數(shù)1% BSA封閉，各步間漂洗用0.1 mol/L PBS。F-actin經(jīng)TRITC-conjugated Phalloidin (體積比1∶4 000)室溫染色2 h，經(jīng)PBS漂洗后，用DAPI (體積比1∶500)標記細胞核。用抗熒光淬滅劑(Dako)將漂洗后的爬片固定在載玻片上，晾干后置于結(jié)構(gòu)照明顯微鏡Axio Observer Z1(蔡司)下，觀察重組質(zhì)粒在細胞中的表達情況。

1.5 小鼠cfl1基因在雞胚脊髓中的表達

1.5.1 pCAG-cfl1的雞胚活體原位電轉(zhuǎn) 在37 ℃、相對濕度65%條件下對種蛋進行孵化，在胚胎發(fā)育第3天(E3)取出雞胚，側(cè)面開直徑2～3 cm大小的孔，在體視顯微鏡下，使用毛細管注射針將pCAG-cfl1的3種質(zhì)粒分別與pCAG-EGFP按4∶1體積比配制的工作液0.1～0.5 μL準確注射到脊髓腔，將針狀電極置脊椎兩側(cè)，確保電極與組織之間有一定空隙，使用BTX ECM830電轉(zhuǎn)儀進行電轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)電壓18 V，每次電擊60 ms，間隔100 ms，電脈沖6次，整個過程在無菌操作工作臺內(nèi)完成，以pCAG-EGFP轉(zhuǎn)染脊髓作為對照(Control)。轉(zhuǎn)染后3 d取出，在顯微鏡下觀察結(jié)果，電轉(zhuǎn)部位呈現(xiàn)綠色熒光者(綠色熒光蛋白GFP的顏色)視為陽性。

1.5.2 雞胚切片的制備 在倒置體視顯微鏡下觀察陽性表達的胚胎。在倒置體視顯微鏡下，用尖頭鑷子劃破卵黃膜，取出整個胚胎，轉(zhuǎn)移至4 ℃多聚甲醛中，在搖床上固定3 d，取出組織，吸干液體，用40 g/L瓊脂糖包埋， 注意方向，頭朝上，確定好位置，在Leica全自動振蕩切片機上連續(xù)切片，切片厚度為80 μm，置于含體積分數(shù)0.1% NaN3的0.1 mol/L 磷酸緩沖液(PB)中于4 ℃下保存。

1.5.3 組織切片的免疫熒光染色 將組織切片從4 ℃冰箱中取出，用0.1 mol/L PB漂洗3次，用Anti-Myc Tag Monoclonal Antibody、Rabbit-anti-GFP 4 ℃過夜孵育組織切片，PB漂洗后，分別用Donkey-anti-rabbit-488、Goat-anti-mouse-568 4 ℃過夜孵育。經(jīng)PB漂洗后，用DAPI(體積比1∶500)標記細胞核。用抗熒光淬滅劑(Dako)將漂洗后的組織切片固定在載玻片上，晾干后置于結(jié)構(gòu)照明顯微鏡Axio Observer Z1下，觀察重組質(zhì)粒在神經(jīng)元中的表達情況。

1.6 統(tǒng)計分析

將轉(zhuǎn)染后的組織切片經(jīng)免疫熒光染色后，在結(jié)構(gòu)照明顯微鏡Axio Observer Z1下拍照。在照片中熒光較強的部位選取200 μm×200 μm大小的面積，通過ImgeJ對轉(zhuǎn)染神經(jīng)元進行計數(shù)。利用GraphPad Prism 5.0軟件對轉(zhuǎn)染神經(jīng)元的統(tǒng)計數(shù)據(jù)進行t檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同物種Cfl1蛋白的氨基酸序列比對

小鼠Cfl1蛋白是由166個氨基酸編碼的蛋白質(zhì)。氨基酸多序列比對結(jié)果見圖2。

圖 2 不同物種Cofilin-1 (Cfl1)蛋白的氨基酸序列比對結(jié)果

圖2顯示，小鼠與人類Cfl1蛋白的氨基酸序列同源性為98.8%，與原雞的Cfl1蛋白的氨基酸序列同源性為81.3%，與非洲爪蟾Cfl1蛋白的氨基酸序列同源性為77.3%。不同物種的Cfl1蛋白肌動蛋白和肌球蛋白的結(jié)合區(qū)域相似度較高，關鍵區(qū)域的保守性較高，如與Cfl1磷酸化狀態(tài)相關的S3位點以及核定位信號 K30-K34等。

2.2 cfl1基因重組真核表達載體的鑒定

經(jīng)PCR擴增，獲得cfl1的CDS序列，構(gòu)建出pEASY-T1-cfl1重組克隆質(zhì)粒。以構(gòu)建的pEASY-T1-cfl1重組克隆質(zhì)粒為模板，利用加有酶切位點和特定位點點突變的引物進行PCR擴增，獲得cfl1的不同突變體(Cfl1-wt、Cfl1-S3A、Cfl1-S3D)，其經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)大約520 bp的片段(圖3-A)，與預期條帶大小相符。用EcoRⅠ和BglⅡ雙酶切回收產(chǎn)物和pCAG-MCS-myc，依次構(gòu)建真核重組表達載體pCAG-cfl1-wt、pCAG-cfl1-S3A和pCAG-cfl1-S3D，限制性酶切產(chǎn)物中均出現(xiàn)了5 200 bp左右的載體骨架和500 bp左右的插入片段(圖3-B)，與預期結(jié)果一致。真核重組表達載體的測序結(jié)果顯示，本試驗成功構(gòu)建了Cfl1野生型的表達載體pCAG-cfl1-wt及Cfl1的磷酸化及去磷酸化突變載體pCAG-cfl1-S3D和pCAG-cfl1-S3A。野生型Cfl1的第3個氨基酸是絲氨酸(S)，密碼子是UCU；Cfl1的類磷酸化突變體第3位是天冬氨酸(D)，密碼子是GAU；Cfl1的去磷酸化突變體第3位是丙氨酸(A)，密碼子是GCU(圖3-C)。

圖 3 cfl1基因重組真核表達載體的構(gòu)建與區(qū)分

2.3 cfl1基因重組質(zhì)粒在CHO細胞中的表達檢測

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細胞24 h后，提取總RNA，利用半定量RT-PCR檢測構(gòu)建質(zhì)粒表達的強弱。由圖4-A可以看出，對照組細胞與轉(zhuǎn)染空載體pCAG-MCS-myc的Cfl1 mRNA表達無明顯差異；處理組pCAG-cfl1-wt、pCAG-cfl1-S3A和pCAG-cfl1-S3D的Cfl1 mRNA表達均比轉(zhuǎn)染pCAG-MCS-myc的細胞強。采用GraphPad Prism 5.0軟件對采集到的灰度值進行分析，其結(jié)果與半定量RT-PCR結(jié)果一致。由圖4-B可知，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的CHO細胞中，Cfl1 mRNA表達量較對照明顯升高，說明轉(zhuǎn)染的能夠表達Cfl1的質(zhì)粒正確表達了Cfl1蛋白；同時，轉(zhuǎn)染pCAG-cfl1-wt與pCAG-cfl1-S3A的CHO細胞對Cfl1 mRNA表達無顯著差異，而轉(zhuǎn)染pCAG-cfl1-S3D的CHO細胞對Cfl1 mRNA的表達較pCAG-cfl1-wt和pCAG-cfl1-S3A明顯增強。

將轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的CHO細胞爬片進行免疫熒光染色，用Anti-Myc Tag Monoclonal Antibody對重組質(zhì)粒表達的融合蛋白進行標記，觀察到重組質(zhì)粒在CHO細胞中可正常表達，且融合蛋白的表達量較高(圖4-C)。

圖 4 cfl1基因重組質(zhì)粒在CHO細胞中的表達

用TRITC-conjugated Phalloidin對F-actin進行標記，正常CHO細胞呈不規(guī)則形，胞體較大，胞漿豐富，輪廓清楚，細胞核卵圓形，位于胞質(zhì)中央，細胞密集時呈長梭形，無偽足或偽足較少，細胞稀疏時伸出偽足，標記的F-actin位于細胞質(zhì)及偽足中(圖5-a，b)。在轉(zhuǎn)染pCAG-cfl1-wt的CHO細胞中，偽足均勻分布在細胞周圍，且F-actin較長(圖5-c)；在標記myc后，可觀察到重組質(zhì)粒所表達的融合蛋白分散在細胞核周圍，且存在點狀分布，在細胞周圍的偽足中均有分布，大部分與F-actin重合[16](圖5-d)。在轉(zhuǎn)染pCAG-cfl1-S3A的細胞中，可觀察到細胞周圍的微絲呈簇狀分布(圖5-e)，且分布位置集中在融合蛋白表達較強的部位(圖5-f)；而在轉(zhuǎn)染pCAG-cfl1-S3D的細胞中，轉(zhuǎn)染細胞的微絲分布無明顯變化(圖5-g,h)，其對肌動蛋白的影響有待進一步研究。

圖 5 Cfl1超表達對CHO細胞肌動蛋白(F-actin)的影響

2.4 cfl1基因重組質(zhì)粒在雞胚脊髓中的表達檢測

對采集的GFP陽性材料進行切片，在體視顯微鏡下挑出綠色熒光表達較強的切片進行免疫熒光染色，在倒置熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果均檢測到了構(gòu)建質(zhì)粒的表達(圖6-A)，其中對照組熒光染色圖為轉(zhuǎn)染等濃度pCAG-EGFP的雞胚脊髓圖。為了驗證構(gòu)建質(zhì)粒在神經(jīng)元中表達的高效性，利用ImgeJ對所選區(qū)域目的質(zhì)粒表達陽性的神經(jīng)元進行計數(shù)，采用GraphPad Prism 5.0軟件對采集到的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，t檢驗結(jié)果表明，在所選取的相同面積內(nèi)，pCAG-cfl1-wt、pCAG-cfl1-S3A和pCAG-cfl1-S3D與等濃度GFP轉(zhuǎn)染神經(jīng)元的個數(shù)無明顯差異 (圖6-B)，證明了重組質(zhì)粒在神經(jīng)元中表達的高效性。

3 討 論

Cofilin是肌動蛋白結(jié)合蛋白，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的肌動蛋白解聚因子。在小鼠胚胎發(fā)育第10天(E10)，cfl1開始在神經(jīng)管中表達，從胚胎發(fā)育第13天(E13)開始，cfl1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達明顯增強，一直維持到小鼠出生，然后有所下降[7-8]，而胚胎發(fā)育第13天至小鼠出生正是大腦神經(jīng)元產(chǎn)生和遷移的時期，這表明cfl1與神經(jīng)元遷移有著密切的關系。cfl1基因敲除會導致胚胎發(fā)育嚴重異常，所有胚胎都在胚胎發(fā)育中后期死亡(E10～E19)，胚胎發(fā)育障礙的主要表現(xiàn)之一是神經(jīng)管未閉合，神經(jīng)系統(tǒng)不能發(fā)育[17]，表明cfl1對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育至關重要。

圖 6 cfl1基因重組質(zhì)粒在雞胚脊髓神經(jīng)元中的表達

然而，cfl1在體內(nèi)神經(jīng)系統(tǒng)中的研究相對困難，導致了cfl1在神經(jīng)元遷移中的作用機制尚不明確。為此，筆者在試驗中采用了活體原位電轉(zhuǎn)基因技術(shù)。它能夠?qū)⒅亟M質(zhì)粒轉(zhuǎn)入神經(jīng)元中，是體內(nèi)研究功能基因的有效方法之一。在電轉(zhuǎn)過程中，由于質(zhì)粒帶負電荷使其向正極方向移動，可瞬時進入細胞，利用表達載體自身的系統(tǒng)進行蛋白質(zhì)的合成，能夠很直觀地檢測目的蛋白的表達情況以及對轉(zhuǎn)染細胞的影響。該方法為進一步研究Cofilin-1在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中對神經(jīng)元遷移的影響提供了技術(shù)保障。

此外，Cofilin是普遍存在于真核細胞的一種肌動蛋白結(jié)合蛋白，當外源轉(zhuǎn)染能夠表達Cofilin的重組質(zhì)粒時，必須保證能夠有效地區(qū)分內(nèi)、外源Cofilin。因此，本試驗中使用了帶有常規(guī)抗原標簽c-Myc的真核表達載體pCAG-MCS-myc作為載體骨架。c-Myc是一種常用的短肽標簽，不僅有利于對重組蛋白檢測，而且不會影響目的蛋白的理化性質(zhì)[18]。根據(jù)這一點，經(jīng)免疫熒光染色即可區(qū)分外源表達的Cofilin蛋白。

經(jīng)過CHO細胞轉(zhuǎn)染和雞胚脊髓電擊轉(zhuǎn)染的檢測，證明本研究所構(gòu)建的pCAG-cfl1-wt、pCAG-cfl1-S3A和pCAG-cfl1-S3D 3種真核表達載體在體外和體內(nèi)都能夠高效表達，為進一步探討Cofilin-1對神經(jīng)元的調(diào)控機制奠定了基礎。

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