伍小紅,袁亞宏,岳田利
(1 西北政法大學(xué) 經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院,陜西 西安 710063;2 西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,陜西 楊凌 712100)
展青霉素(Patulin)是青霉屬、曲霉屬、裸囊菌屬和絲衣霉屬中某些真菌的次生代謝產(chǎn)物[1],具有致畸、致癌和致突變作用[2]。展青霉素在霉?fàn)€的果蔬及其制品中均有發(fā)現(xiàn),且在蘋(píng)果汁、葡萄汁中表現(xiàn)很穩(wěn)定[3]。目前,展青霉素的控制方法主要有物理吸附、輻照處理、微波處理、添加食品添加劑處理、生物處理等方法[4-5]。簡(jiǎn)單的物理吸附法對(duì)溶液中的展青霉素具有一定的吸附去除作用,活性炭和膨潤(rùn)土可作為良好的結(jié)合劑來(lái)吸附溶液中存在的毒素。有研究證明,使用3~5 g/L活性炭對(duì)含有展青霉素的蘋(píng)果汁處理5 min,即可有效降低展青霉素的污染水平[6];Huebner等[7]開(kāi)展了基于復(fù)合碳-固定床吸附器的蘋(píng)果汁中展青霉素的控制研究;Kadakal等[8]研究發(fā)現(xiàn),使用活性炭可以將蘋(píng)果酒中質(zhì)量濃度為30 μg/mL的展青霉素完全去除。但是上述研究也顯示,利用活性碳吸附展青霉素的同時(shí)會(huì)明顯影響果汁本身的品質(zhì)。在其余控制方法中,輻照處理法局限性較大[9],微波處理工業(yè)化應(yīng)用難度較大,添加食品添加劑的方法則不適合天然果汁的生產(chǎn)。因此,尋求建立一種高效安全的生物吸附法以實(shí)現(xiàn)展青霉素的有效控制是目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。
生物吸附是指以酵母、乳酸菌等生物體細(xì)胞及其衍生物為吸附劑,實(shí)現(xiàn)環(huán)境及樣品中污染物去除與控制的處理方法[10-11]。釀酒酵母是食品工業(yè)中廣泛使用的一種微生物,其失活菌體對(duì)果汁中的展青霉素具有良好的吸附效果,這一結(jié)論在之前的研究中已經(jīng)得到了充分的驗(yàn)證[12-13]。但是由于失活酵母細(xì)胞個(gè)體微小,在處理展青霉素之后對(duì)其進(jìn)行分離時(shí)存在一定困難,這就限制了失活酵母在果汁生產(chǎn)中的實(shí)際應(yīng)用。而基于材料學(xué)與生物學(xué)相結(jié)合的酵母固定化技術(shù)可使失活酵母快速分離與聚集,耐毒害能力增強(qiáng),特別是使其反應(yīng)更加穩(wěn)定,并且減少了微生物的流失,產(chǎn)物更易分離,為基于生物吸附法的展青霉素的有效控制提供了新思路[14-16]。但目前通過(guò)固定化技術(shù)改良微生物細(xì)胞進(jìn)行污染物去除的研究,主要集中在水體中重金屬去除控制方面[17-18]。為此,本試驗(yàn)以固定化失活酵母為吸附劑進(jìn)行蘋(píng)果汁中展青霉素的去除研究,通過(guò)對(duì)去除工藝條件的系統(tǒng)優(yōu)化,以期為蘋(píng)果汁中展青霉素的有效控制提供新的思路和方法。
釀酒酵母,來(lái)源于西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院發(fā)酵動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)室;濃縮蘋(píng)果汁,由陜西恒興果汁飲料有限公司提供;展青霉素標(biāo)準(zhǔn)品,純度≥99%,購(gòu)買(mǎi)于上海貝基生物科技有限公司。
主要試劑有乙腈(色譜純,純度99.5%以上)、乙酸乙酯(分析純,純度99.5%以上)、乙酸(分析純,純度約98%)、乙醇(分析純,純度99.7%以上)、碳酸鈉(分析純)、海藻酸鈉、無(wú)水氯化鈣等。
SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵,鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;HSQ-3型恒溫水浴鍋,上海?,攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;UV-2550型雙光束紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)、LC-2010A型高效液相色譜儀,日本島津公司。
稱(chēng)取5.0 mg展青霉素標(biāo)準(zhǔn)品,用乙酸乙酯充分溶解,定容至20.00 mL。將配好的展青霉素貯備液轉(zhuǎn)至棕色磨口試劑瓶中,冷藏備用。
1.4.1 酵母菌的活化 取保存的菌種于YPD平板培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為28 ℃,培養(yǎng)時(shí)間為24 h。
1.4.2 一級(jí)培養(yǎng) 將經(jīng)過(guò)24 h活化的酵母菌接種到80 mL蘋(píng)果汁培養(yǎng)基中,28 ℃、120 r/min條件下培養(yǎng)24 h。
1.4.3 二級(jí)培養(yǎng) 將一級(jí)培養(yǎng)獲得的種子液接種(接種量5%)到100 mL蘋(píng)果汁培養(yǎng)基中,于28 ℃、120 r/min條件下擴(kuò)大培養(yǎng)24 h。
1.5.1 失活酵母的制備 對(duì)擴(kuò)增獲得的酵母菌培養(yǎng)液離心、洗滌,得到酵母泥。然后在80 ℃條件下對(duì)酵母菌滅活處理45 min,得到失活的酵母菌體。
1.5.2 酵母細(xì)胞活性的鑒定 為了避免酵母對(duì)果汁產(chǎn)生發(fā)酵反應(yīng)并保證完全是失活酵母細(xì)胞在果汁中起作用,通過(guò)美蘭染色法鑒定滅活處理后酵母細(xì)胞的活性。具體操作步驟如下[15]:在載玻片中央加1滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的美蘭染色液,取少許酵母粉放在染液中,混合均勻,用鑷子取一塊蓋玻片,先將一邊與菌液接觸,然后慢慢將蓋玻片放下使其蓋在菌液上,將制品放置約3 min后鏡檢,分別用低倍鏡和高倍鏡觀察酵母的細(xì)胞形態(tài)、出芽及染色情況,染色0.5 h后再次觀察,如果細(xì)胞無(wú)色表示是活細(xì)胞,如果細(xì)胞不褪色表示其已完全失活[19]。
1.5.3 失活酵母的固定化 采用海藻酸鈉包埋法進(jìn)行失活酵母的固定化[20]。具體操作步驟如下:稱(chēng)取1.66 g無(wú)水CaCl2,加入300 mL蒸餾水溶解,制備獲得0.05 mol/L CaCl2溶液。同時(shí),將3 g海藻酸鈉加入100 mL蒸餾水中,用電磁爐緩慢加熱并攪拌,將其完全溶化。將溶化好的海藻酸鈉溶液冷卻至室溫,加入30 g酵母泥,充分?jǐn)嚢枋蛊浠旌暇鶆?,形成海藻酸鈉-酵母菌懸液,轉(zhuǎn)移至配有22-G1型號(hào)針頭的注射器中。以恒定的速度緩慢將注射器中的溶液滴加到配制好的CaCl2溶液中,形成凝膠珠,靜置1 h,使其完全固定化。無(wú)菌去離子水洗滌固定化的失活酵母細(xì)胞,并重新加入0.05 mol/L CaCl2溶液,4 ℃下平衡備用。本試驗(yàn)中獲得的凝膠顆粒直徑為1.5~2 mm,經(jīng)過(guò)5 000 r/min 離心試驗(yàn)測(cè)試,證明該酵母顆粒機(jī)械強(qiáng)度較高,具備穩(wěn)定的物理性能,可滿足試驗(yàn)的要求。
1.6.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) (1)固定化失活酵母劑量的影響。精確稱(chēng)取固定化失活酵母0,0.3,0.5,0.7,0.9 g,分別加入到30 mL加標(biāo)果汁樣品中,使固定化失活酵母的劑量分別為3.3,10.0,16.7,23.3和30.0 g/L,室溫條件下振蕩吸附,振動(dòng)頻率為120 r/min,吸附時(shí)間為24 h,評(píng)價(jià)固定化失活酵母劑量對(duì)展青霉素去除率的影響。(2)吸附時(shí)間的影響。分別將0.5 g固定化失活酵母加入到不同加標(biāo)果汁樣品中(30 mL),于室溫條件下振蕩(120 r/min)吸附,分別在吸附開(kāi)始的6,12,18,24 h取樣,測(cè)定吸附時(shí)間對(duì)展青霉素去除率的影響。(3)展青霉素初始質(zhì)量濃度的影響。分別取30 mL質(zhì)量濃度分別為50,100,300,500 μg/L的加標(biāo)蘋(píng)果汁,加入0.5 g固定化失活酵母于室溫條件下振蕩(120 r/min)吸附,吸附時(shí)間為24 h,評(píng)價(jià)展青霉素初始質(zhì)量濃度對(duì)蘋(píng)果汁中展青霉素去除率的影響。(4)蘋(píng)果汁pH的影響。以pH緩沖液調(diào)節(jié)蘋(píng)果汁的pH分別為3.0,4.0,5.0,加入0.5 g固定化失活酵母,于室溫條件下振蕩(120 r/min)吸附,吸附時(shí)間為24 h,評(píng)價(jià)蘋(píng)果汁pH對(duì)展青霉素去除率的影響。
每次吸附完成后將固定化失活酵母顆粒與果汁分離,采用HPLC法測(cè)定果汁中的展青霉素含量,每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。同時(shí),以未添加固定化失活酵母的蘋(píng)果汁為空白對(duì)照。
1.6.2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì) 通過(guò)單因素試驗(yàn),確定去除展青霉素的最佳固定化失活酵母劑量、吸附時(shí)間、展青霉素初始質(zhì)量濃度和蘋(píng)果汁pH值,分別以X1、X2、X3、X4表示,并以1、0、-1分別代表自變量的高、中、低3個(gè)不同的編碼水平。然后進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì),其因素和水平見(jiàn)表1。
表 1 固定化失活酵母去除蘋(píng)果汁中展青霉素工藝的Box-Behnken試驗(yàn)的因素及水平
1.6.3 去除率計(jì)算 各處理樣品中展青霉素去除率的計(jì)算公式為:q=(C0-Ci)/C0×100%。式中,q為固定化失活酵母對(duì)展青霉素的去除率,%;C0為吸附前樣品中展青霉素的質(zhì)量濃度,μg/L;Ci為吸附后樣品中展青霉素的質(zhì)量濃度,μg/L。
不同因素對(duì)蘋(píng)果汁中展青霉素去除率的影響見(jiàn)圖1~圖4。
2.1.1 固定化失活酵母劑量 由圖1可知,當(dāng)固定化失活酵母劑量依次為3.3,10.0,16.7,23.3和30.0 g/L時(shí),果汁中展青霉素的質(zhì)量濃度明顯下降,固定化失活酵母對(duì)果汁中展青霉素的去除率依次為43.2%,64.8%,68.8%,68.8%,68.8%。由此判斷,劑量為3.3~30.0 g/L的固定化失活酵母對(duì)果汁中的展青霉素均有吸附作用,吸附效果取決于酵母劑量大小,但當(dāng)固定化失活酵母劑量為16.7 g/L時(shí),其對(duì)果汁中展青霉素的吸附達(dá)到最大,繼續(xù)增加其用量不會(huì)使展青霉素的去除率進(jìn)一步升高。由此確定固定化失活酵母的最佳劑量為16.7 g/L。
2.1.2 固定化失活酵母吸附時(shí)間 由圖2可知,對(duì)展青霉素初始質(zhì)量濃度為96.97 μg/L的蘋(píng)果汁樣品,用固定化失活酵母吸附6 h時(shí),展青霉素質(zhì)量濃度下降至78.64 μg/L,去除率為18.9%;吸附12 h后,展青霉素的質(zhì)量濃度下降至39.08 μg/L,去除率為59.7%;當(dāng)吸附時(shí)間為18 h時(shí),展青霉素質(zhì)量濃度下降至25.80 μg/L,去除率為73.39%;當(dāng)吸附時(shí)間延長(zhǎng)至24 h時(shí),展青霉素的質(zhì)量濃度為24.08 μg/L,去除率為75.17%,此時(shí),展青霉素的吸附去除基本達(dá)到平衡,繼續(xù)延長(zhǎng)吸附時(shí)間對(duì)展青霉素去除率影響不大。因此綜合考慮,確定固定化失活酵母的最佳吸附時(shí)間為18 h。
圖 1 固定化失活酵母劑量對(duì)蘋(píng)果汁中展青霉素去除率的影響
2.1.3 蘋(píng)果汁中展青霉素初始質(zhì)量濃度 如圖3所示,按照30 mL樣品中加入0.5 g固定化失活酵母,對(duì)展青霉素初始質(zhì)量濃度為50 μg/L的蘋(píng)果汁加標(biāo)樣品進(jìn)行24 h吸附處理,展青霉素去除率達(dá)到79.12%;隨著加標(biāo)果汁樣品中展青霉素初始質(zhì)量濃度的增大,固定化失活酵母對(duì)展青霉素的去除率呈下降趨勢(shì),當(dāng)展青霉素初始質(zhì)量濃度為500 μg/L時(shí),其去除率為27.38%。
圖 3 蘋(píng)果汁中展青霉素初始質(zhì)量濃度對(duì)固定化失活酵母去除展青霉素的影響
由此得出,展青霉素初始質(zhì)量濃度為50~500 μg/L時(shí),固定化失活酵母對(duì)其均有去除作用,但是去除效果隨著展青霉素初始質(zhì)量濃度的不同而變化較大。隨著加標(biāo)樣品中展青霉素初始質(zhì)量濃度的升高,固定化失活酵母對(duì)展青霉素的吸附去除率呈現(xiàn)下降趨勢(shì),并最終達(dá)到吸附平衡。這是因?yàn)閷?duì)于一定量的固定化酵母,其可以吸附展青霉素的結(jié)合位點(diǎn)總量是一定的,當(dāng)展青霉素質(zhì)量濃度逐漸增大時(shí),固定化失活酵母吸附到的目標(biāo)物增多,當(dāng)展青霉素初始質(zhì)量濃度增大到一定程度時(shí),固定化失活酵母的吸附位點(diǎn)基本被完全結(jié)合,即使繼續(xù)增大加標(biāo)果汁中展青霉素的質(zhì)量濃度,固定化酵母細(xì)胞對(duì)其的吸附總量也不會(huì)有太大改變。因此,本試驗(yàn)確定的展青霉素的最佳初始質(zhì)量濃度為100 μg/L,在此條件下展青霉素去除率可以達(dá)到75.16%。
2.1.4 蘋(píng)果汁pH值 由圖4可知,在展青霉素初始質(zhì)量濃度為96.97 μg/L的加標(biāo)樣品中,當(dāng)蘋(píng)果汁pH值為3.0,4.0和5.0時(shí),去除率分別為46.1%,73.7%和80.8%??梢?jiàn),展青霉素的去除率隨著pH的增大而增加。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[16],展青霉素在酸性條件下比較穩(wěn)定,不易分解,所以蘋(píng)果汁本身的酸度對(duì)固定化失活酵母去除展青霉素起著至關(guān)重要的影響。固定化失活酵母可以用于不同酸度蘋(píng)果汁樣品中展青霉素的吸附去除,在蘋(píng)果汁pH值為5.0時(shí)具有最佳的效果。
2.2.1 Box-Behnken試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,進(jìn)行4因素3水平的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì),對(duì)蘋(píng)果汁中展青霉素去除工藝進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果見(jiàn)表2。
表 2 固定化失活酵母去除蘋(píng)果汁中展青霉素工藝的Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果
利用Desingn-Expert 7.0軟件對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,得到的二次多項(xiàng)回歸模型方程為:
表 3 蘋(píng)果汁中展青霉素去除率與其影響因素回歸模型的方差分析結(jié)果
2.2.2 各因素交互作用對(duì)展青霉素去除的影響 固定2個(gè)因素水平,分別考察其余2個(gè)因素對(duì)展青霉素去除率的影響,得到展青霉素初始質(zhì)量濃度(X1)和蘋(píng)果汁pH值(X2)、吸附時(shí)間(X4)和固定化失活酵母劑量(X3)對(duì)展青霉素去除率(Y)的影響如下式所示:
圖5和圖6分別為固定化失活酵母吸附去除蘋(píng)果汁中展青霉素的過(guò)程中,展青霉素初始質(zhì)量濃度與蘋(píng)果汁pH值、吸附時(shí)間與固定化失活酵母劑量之間交互作用對(duì)展青霉素去除率影響的響應(yīng)面曲線。由圖5可知,當(dāng)固定化失活酵母劑量為16.7 g/L、吸附時(shí)間為18 h時(shí),等高曲線沿X2(蘋(píng)果汁pH值)方向變化較快,呈拋物線形式變化,而沿X1(展青霉素初始質(zhì)量濃度)方向變化較慢,表明在本試驗(yàn)水平下,蘋(píng)果汁pH值對(duì)去除率的影響較展青霉素初始質(zhì)量濃度明顯。由圖6可知,當(dāng)蘋(píng)果汁pH值和展青霉素初始質(zhì)量濃度分別為4.0和100.0 μg/L時(shí),等高曲線沿X4(吸附時(shí)間)方向變化較快,呈拋物線形式變化,而沿X3(固定化失活酵母劑量)方向變化較慢,提示在試驗(yàn)水平下,吸附時(shí)間對(duì)去除率的影響較固定化失活酵母劑量明顯。
2.2.3 展青霉素的最佳去除工藝 利用SAS 9.1軟件分析得到固定化失活酵母去除蘋(píng)果汁中展青霉素的最佳工藝條件為:展青霉素初始質(zhì)量濃度 90.52 μg/L,蘋(píng)果汁pH=4.46,固定化失活酵母劑量15.13 g/L,吸附時(shí)間18.16 h,在此條件下,固定化失活酵母對(duì)蘋(píng)果汁中展青霉素的去除率為72.89%。對(duì)上述優(yōu)化條件進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證,可知展青霉素的去除率為71.36%。
圖 5 展青霉素初始質(zhì)量濃度、蘋(píng)果汁pH及其交互作用對(duì)固定化失活酵母去除蘋(píng)果汁中展青霉素的影響
1)以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ),利用響應(yīng)曲面法對(duì)影響固定化失活酵母去除蘋(píng)果汁中展青霉素的關(guān)鍵因子及其交互作用進(jìn)行分析,結(jié)果表明,各因素對(duì)展青霉素去除率的影響由小到大順序?yàn)檎骨嗝顾爻跏假|(zhì)量濃度<固定化失活酵母劑量<吸附時(shí)間<蘋(píng)果汁pH值。優(yōu)化獲得的固定化失活酵母去除蘋(píng)果汁中展青霉素的最佳工藝條件為:展青霉素初始質(zhì)量濃度90.52 μg/L,蘋(píng)果汁pH=4.46,固定化失活酵母劑量15.13 g/L,吸附時(shí)間18.16 h。在此條件下,展青霉素的去除率為71.36%。
2)與傳統(tǒng)展青霉素去除方法相比,采用固定化失活酵母去除蘋(píng)果汁中展青霉素時(shí),該方法具有高效快捷、成本低廉的特點(diǎn),且極大提高了蘋(píng)果汁的安全性,因此該方法具有很強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值,其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景極為廣闊。
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中國(guó)科技核心期刊、中國(guó)農(nóng)業(yè)核心期刊、全國(guó)中文核心期刊、全國(guó)優(yōu)秀農(nóng)業(yè)期刊
《植物遺傳資源學(xué)報(bào)》征訂啟事
《植物遺傳資源學(xué)報(bào)》是中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所和中國(guó)農(nóng)學(xué)會(huì)主辦的學(xué)術(shù)期刊,為中國(guó)科技論文統(tǒng)計(jì)源期刊、中國(guó)科學(xué)引文數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)源期刊(核心期刊)、中國(guó)核心期刊(遴選)數(shù)據(jù)庫(kù)收錄期刊、中國(guó)學(xué)術(shù)期刊綜合評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)庫(kù)統(tǒng)計(jì)源期刊,又被《中國(guó)生物學(xué)文摘》和中國(guó)生物學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)、中文科技期刊數(shù)據(jù)庫(kù)收錄。據(jù)中信所2014年期刊學(xué)術(shù)影響因子年報(bào)統(tǒng)計(jì),《植物遺傳資源學(xué)報(bào)》影響因子為1.146(綜合影響因子1.396),在全國(guó)農(nóng)藝和園藝類(lèi)期刊中排名第5,在全國(guó)1998種科技核心期刊中排名157位。
報(bào)道內(nèi)容為大田、園藝作物,觀賞、藥用植物,林用植物、草類(lèi)植物及其一切經(jīng)濟(jì)植物的有關(guān)植物遺傳資源基礎(chǔ)理論研究、應(yīng)用研究方面的研究成果、創(chuàng)新性學(xué)術(shù)論文和高水平綜述或評(píng)論。諸如,種質(zhì)資源的考察、收集、保存、評(píng)價(jià)、利用、創(chuàng)新,信息學(xué)、管理學(xué)等;起源、演化、分類(lèi)等系統(tǒng)學(xué);基因發(fā)掘、鑒定、克隆、基因文庫(kù)建立、遺傳多樣性研究。
雙月刊,大16開(kāi)本,196頁(yè)。定價(jià)20元,全年120元。各地郵局發(fā)行。
郵發(fā)代號(hào):82-643,國(guó)內(nèi)刊號(hào):CN11-4996/S,國(guó)際統(tǒng)一刊號(hào):ISSN1672-1810。
本刊編輯部常年辦理訂閱手續(xù),如需郵掛每期另加3元。
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