韓興帥，許 丹，馮俊濤,2，張 興,2

(1 西北農(nóng)林科技大學 無公害農(nóng)藥研究服務中心，陜西 楊凌 712100；2 陜西省生物農(nóng)藥工程技術研究中心，陜西 楊凌 712100)

從植物中尋找具有農(nóng)藥活性的物質，特別是具有新型分子結構的化合物是當前新型農(nóng)藥創(chuàng)制的一條重要途徑，亦是發(fā)掘新一代農(nóng)藥先導化合物的有效方法之一[1]。菊科植物以其種類多樣，化學成分復雜，成為植物源殺菌劑研發(fā)的主要目標植物類群之一[2-4]。

西北農(nóng)林科技大學無公害農(nóng)藥研究服務中心對西北地區(qū)多種菊科植物進行了殺菌活性的篩選[5-6]，發(fā)現(xiàn)菊科天名精屬植物大花金挖耳(CarpesiummacrocephalumFranch.Et Sav)具有較強的殺菌活性，從中分離到17種化合物，經(jīng)測試、分析認為半萜內(nèi)酯類化合物天名精內(nèi)酯酮(圖 1)為其主要活性成分之一,研究發(fā)現(xiàn)天名精內(nèi)酯酮具有較為廣譜和較強的殺菌活性[7]。在此基礎上，本文以小麥紋枯病菌、番茄灰霉病菌、番茄葉霉病菌、南瓜枯萎病菌、黃瓜炭疽病菌、小麥全蝕病菌、小麥赤霉病菌、蘋果炭疽病菌、蘋果干腐病菌、小麥條銹病菌和辣椒疫霉病菌為供試病原菌，采用生長速率法、孢子萌發(fā)法、盆栽藥效試驗及組織法，從離體和活體2個方面評價了天名精內(nèi)酯酮的殺菌活性，以期為這一植物源活性物質的開發(fā)利用提供基礎資料。

圖 1 天名精內(nèi)酯酮的結構

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試藥劑：天名精內(nèi)酯酮(純度≥96%)、10%天名精內(nèi)酯酮微乳劑，均由西北農(nóng)林科技大學無公害農(nóng)藥研究服務中心提供；15%粉銹寧可濕性粉劑(四川國光農(nóng)化有限公司)，70%甲基硫菌靈可濕性粉劑 (陜西上格之路生物科學有限公司)，50%甲霜靈可濕性粉劑(中國濰坊市瑞澤豐農(nóng)化有限公司)，50%速克靈可濕性粉劑(日本住友化學工業(yè)株式會社)。

供試病原菌：小麥紋枯病菌(Rhizoctoniacerealis)、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、番茄葉霉病菌(Fulviafulva(Cooke)Ciferri)、南瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum(Schl.) f.sp.cucumerirtumOwen)、黃瓜炭疽病菌(Colletrichumlagenarium(Pass.)Ell.et Halst)、小麥全蝕病菌(Gaeumannomycesgraminisvar.tritici)、小麥赤霉病菌(Gibberellasanbinetti)、蘋果炭疽病菌(Glomerellacingulate)、蘋果干腐病菌(Botryosphaeriaberengeriana(Moug.ex fr).Ces. etdeNot)、小麥條銹病菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici)和辣椒疫霉病菌(PhytophthoracapsiciLeonian)，均由西北農(nóng)林科技大學無公害農(nóng)藥研究服務中心提供。

供試作物：小麥(品種為輝縣紅)、黃瓜(品種為農(nóng)城3號)和辣椒(品種為世紀紅)，均為感病品種，購自楊凌種子市場。番茄果實采摘自陜西楊凌楊村溫室大棚。

1.2 試驗方法

前期初步測試表明，天名精內(nèi)酯酮對小麥紋枯病菌、番茄灰霉病菌、番茄葉霉病菌、辣椒疫霉病菌、南瓜枯萎病菌、黃瓜炭疽病菌、小麥全蝕病菌、小麥赤霉病菌、蘋果炭疽病菌和蘋果干腐病菌10種病原菌菌絲生長具有較強的抑制作用，對小麥赤霉病菌、黃瓜炭疽病菌、番茄灰霉病菌、番茄葉霉病菌和辣椒疫霉病菌5種病菌孢子的萌發(fā)具有較高的抑制效果，故離體毒力測定中分別選取上述病原菌進行測試。

1.2.1 離體測定方法 (1) 生長速率法。采用生長速率法測定天名精內(nèi)酯酮對供試病菌菌絲生長的抑制作用[8]。在無菌條件下，將PDA培養(yǎng)基融化，待用。在含9 mL 培養(yǎng)基的具刻度試管中加入1 mL用丙酮溶解的不同質量濃度的天名精內(nèi)酯酮溶液, 將其充分搖勻后傾倒于直徑為9 cm 的培養(yǎng)皿中, 制成平板培養(yǎng)基備用，天名精內(nèi)酯酮的終質量濃度分別為2，4，16，32，64 mg/L。將直徑為4 mm的供試病原菌菌餅分別接種于含有不同質量濃度天名精內(nèi)酯酮的帶毒培養(yǎng)基平板上，置于室內(nèi)(溫度(25±1) ℃，相對濕度70%～80%)培養(yǎng)。每皿為1個處理，每處理3次重復。以等量丙酮處理為對照，5 d后用十字交叉法測量菌落直徑，計算抑制率和有效抑制中濃(EC50)。

菌落直徑=菌落平均直徑-4×菌餅直徑；

抑制率=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100%。

(2)孢子萌發(fā)法。采用懸滴法[8]測定天名精內(nèi)酯酮對供試病菌孢子萌發(fā)的抑制毒力。用無菌水將培養(yǎng)好的供試病菌孢子從產(chǎn)孢培養(yǎng)基上洗下，用紗布過濾得到孢子懸浮液，以無菌水調(diào)至1×106mL-1。向孢子懸浮液中加入不同質量濃度的天名精內(nèi)酯酮溶液，制備5個藥劑質量濃度梯度的帶藥孢子混合液，每個質量濃度處理設置3個重復。吸取帶藥孢子混合液50 μL滴加在凹玻片上，25 ℃恒溫箱中保濕培養(yǎng)，在顯微鏡下觀察分生孢子萌發(fā)情況，以芽管長度大于孢子短半徑認定為萌發(fā)，當對照萌發(fā)率大于80%后，檢查所有處理的萌發(fā)率，計算孢子萌發(fā)抑制率和有效抑制中濃(EC50)。

萌發(fā)率=萌發(fā)孢子數(shù)/檢查孢子總數(shù)×100%；

抑制率=(對照萌發(fā)率-處理萌發(fā)率)/對照萌發(fā)率×100%。

1.2.2 活體測定方法 (1)防治小麥全蝕病盆栽試驗。采用Penrose[9]的菌餅接種法，并略有修改：將小麥播種于裝有滅菌土的直徑10 cm的塑料花盆中，每盆15株左右，待長至2～3葉時開始試驗。將菌餅與幼苗根部四周1～2 cm深的土壤輕微混拌接菌，每株幼苗根部接種2個菌餅。將天名精內(nèi)酯酮配制成質量濃度分別為1 000和500 mg/L的2個溶液，以10 mL注射器進行注射灌根施藥，施藥量為10 mL/盆。保護作用測定：施藥24 h 后進行接菌，保持相對濕度在80%以上培養(yǎng)。治療作用測定：先對小麥進行接菌，保持相對濕度80%以上，48 h 后施藥。以灌施10 mL粉銹寧150 mg/L的藥液處理為標準藥劑對照，每處理重復4次；同時設清水和溶劑對照。接種3周后，洗根調(diào)查發(fā)病情況。

(2)防治小麥條銹病盆栽試驗。將供試小麥種子消毒、浸種、催芽后盆栽，每盆種植15株左右；待小麥幼苗第1片葉完全展開時進行試驗。保護作用測定時，用噴霧法施藥，24 h后再用掃接法接菌保濕24 h，然后轉入常規(guī)管理；治療作用測定時，先接菌，保濕24 h后再施藥[10]。將天名精內(nèi)酯酮配制成質量濃度分別為1 000，500 mg/L；以清水為空白對照，以粉銹寧150 mg/L處理為標準藥劑對照。每處理重復4次，接種7 d后調(diào)查發(fā)病情況。

(3)防治黃瓜炭疽病盆栽試驗。參照《農(nóng)藥室內(nèi)生物測定試驗準則》進行[11]，具體為：待黃瓜幼苗長到2～4片真葉時備用。將孢子懸浮液(1×105mL-1)噴在植株葉面接菌，以葉面布滿霧點而不形成水滴流失為宜；保護性試驗在藥劑處理后24 h 接菌，治療性試驗在藥劑處理前24 h 接菌；接菌后保持相對濕度95%～100%、黑暗培養(yǎng)24 h，然后在 22～27 ℃、相對濕度80%～90%條件下光照培養(yǎng)。將天名精內(nèi)酯酮配制成質量濃度分別為1 000，500 mg/L；以清水為空白對照，以甲基硫菌靈700 mg/L處理為標準藥劑對照。每處理重復4次，每重復育苗3盆。14 d后進行病情調(diào)查。

(4)防治辣椒疫霉病盆栽試驗。參照邱思鑫等[12]的方法，具體為：待盆栽辣椒長出4～6片葉時開始試驗。采用灌根方式進行接種，每盆接種5 mL 藥液或辣椒疫霉病菌孢子懸浮液(1×105mL-1)，同時設清水對照。保護作用為先將藥液澆灌在根際周圍，24 h 后澆灌辣椒疫霉病菌孢子懸浮液；治療作用為先澆灌辣椒疫霉病菌孢子懸浮液，24 h 后澆灌藥液。每個處理育苗3 盆，4次重復。將天名精內(nèi)酯酮配制成質量濃度分別為1 000，500 mg/L；同時設清水和溶劑對照，以甲霜靈500 mg/L處理為標準藥劑對照。于接種后14 d調(diào)查發(fā)病情況。

上述各試驗發(fā)病情況均按《農(nóng)藥田間藥效試驗準則》中病害分級標準[13]進行調(diào)查，按照下式計算病情指數(shù)和藥效[14]：

病情指數(shù)=∑(各級病株數(shù)或葉數(shù)×對應發(fā)病級數(shù))/(調(diào)查總株數(shù)或葉數(shù)×最高發(fā)病級數(shù))×100；

藥效=(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)×100%。

(5)防治番茄灰霉病藥效試驗。番茄灰霉病藥效試驗采用番茄幼果法[15]。將從田間采集的未施用任何殺菌藥劑的番茄果實先用清水洗滌干凈、晾干，再用脫脂棉醮取體積分數(shù)75%的乙醇擦拭果實表面。用接種針在番茄果實表面刺出直徑約5 mm的侵染區(qū)域，以直徑4 mm的打孔器打制菌餅，將菌餅倒扣在番茄果實表面病菌侵染區(qū)。保護作用：先采用噴霧法，將質量濃度分別為500和 1 000 mg/L的天名精內(nèi)酯酮藥液直接灑在番茄果實表面，待藥液晾干后接菌。治療作用：先將菌餅接種在番茄果實表面后，再以質量濃度分別為500和 1 000 mg/L的天名精內(nèi)酯酮藥液噴灑果實表面。以丙酮溶液處理為溶劑對照，以500 mg/L速克靈處理為標準藥劑對照。接種后于25 ℃培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，3 d后檢查發(fā)病情況，計算藥效。

藥效=(對照病斑擴展直徑-處理病斑擴展直徑)/對照病斑擴展直徑×100%。

上述試驗數(shù)據(jù)均采用SPSS(19.0)軟件中鄧肯氏新復極差法(DMRT)進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 天名精內(nèi)酯酮對供試病菌的離體生物測試結果

2.1.1 對10種病原真菌菌絲生長的抑制作用 采用生長速率法測定了天名精內(nèi)酯酮對10種病原真菌菌絲生長的抑制作用，結果見表1。由表1可見，天明精內(nèi)酯酮對供試的10種病原真菌菌絲生長均具有較強的抑制作用， EC50在 4.894 7～43.856 9 mg/L。其中對小麥全蝕病菌的毒力最高，EC50為4.894 7 mg/L，對小麥紋枯病菌的毒力次之，EC50為12.640 9 mg/L，對辣椒疫霉病菌、小麥赤霉病菌、黃瓜炭疽病菌和蘋果干腐病菌均具有中等毒力，EC50在20～25 mg/L，對番茄灰霉病菌、番茄葉霉病菌、蘋果炭疽病菌和南瓜枯萎病菌的毒力較弱，EC50>30 mg/L。

表 1 天名精內(nèi)酯酮對10種病原真菌菌絲生長的抑制毒力(5 d)

2.1.2 對5種病原真菌孢子萌發(fā)的抑制作用 采用孢子萌發(fā)法測定了天名精內(nèi)酯酮對5種病原真菌孢子萌發(fā)的抑制毒力，結果見表2。由表2可知，天明精內(nèi)酯酮對供試的5種病原真菌孢子萌發(fā)均具有一定的抑制作用，但對不同病原菌孢子萌發(fā)的抑制作用存在明顯差異。其中對黃瓜炭疽病菌孢子萌發(fā)的抑制毒力最高，EC50為6.876 5 mg/L，對辣椒疫霉病菌、番茄灰霉病菌和番茄葉霉病菌也具有較強的抑制作用，EC50在22.733 0～37.817 3 mg/L，而對小麥赤霉病菌孢子的抑制作用相對較弱，EC50大于200 mg/L。

表 2 天名精內(nèi)酯酮對5種病原真菌孢子萌發(fā)的抑制毒力

2.2 天名精內(nèi)酯酮對5種病害的藥效試驗結果

2.2.1 對4種植物病害的盆栽藥效 由表3可知，天名精內(nèi)酯酮對小麥全蝕病的藥效相對較好。在 1 000 mg/L劑量下，天名精內(nèi)酯酮對小麥全蝕病的保護效果和治療效果分別為85.48%和64.98%，保護效果優(yōu)于粉銹寧150 mg/L處理(82.28%)；在500 mg/L劑量處理下的保護效果仍可達74.65%，而此質量濃度下治療效果為47.08%，明顯下降。天名精內(nèi)酯酮對小麥條銹病的藥效次之，1 000 mg/L 劑量下的保護和治療效果分別為60.40%和59.70%，均顯著低于對照藥劑粉銹寧150 mg/L的處理，而500 mg/L劑量下的保護和治療效果分別只有30.60%和15.27%。天名精內(nèi)酯酮對黃瓜炭疽病和辣椒疫霉病的藥效較低，1 000 mg/L劑量下的保護效果分別為50.01%和48.06%，治療效果分別為46.49%和39.75%，均顯著低于對照藥劑，500 mg/L劑量下的保護和治療效果則均不足30%。

表 3 天名精內(nèi)酯酮對4種植物病害的盆栽藥效

2.2.2 對番茄灰霉病的室內(nèi)藥效 由表4可見，天明精內(nèi)酯酮對番茄灰霉病防效較低，1 000 mg/L處理的保護效果和治療效果分別為45.5%和19.9%，500 mg/L劑量下僅表現(xiàn)出較低的保護效果 23.9%，無明顯治療效果。

表 4 天明精內(nèi)酯酮對番茄灰霉病的防治效果

3 小結與討論

本研究表明，天名精內(nèi)酯酮對供試病原真菌均表現(xiàn)出較好的抑制作用和一定的廣譜性，具有開發(fā)為植物源殺菌劑的潛質。天名精內(nèi)酯酮在大花金挖耳、天名精等菊科植物中含量較高，主要分布于植株花序中[16]。前期已對大花金挖耳的殺菌活性進行了系統(tǒng)研究，通過對比大花金挖耳全株及根、莖、葉和花提取物的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)活性成分主要集中在花中，且主要存在于乙酸乙酯和乙醇相中，莖、葉提取物活性較低，活性成分存在于石油醚和氯仿相中[17]。大花金挖耳丙酮提取物對蘋果炭疽病的抑制侵染率為 63.50%，對黃瓜霜霉菌的保護作用和治療作用均在50% 以上，對小麥白粉病的保護和治療效果均高于60%[5,17-18]，大花金挖耳精油對小麥全蝕病菌和小麥紋枯病菌菌絲生長的抑制作用大于97%[19]?；钚猿煞盅芯勘砻?，天名精內(nèi)酯酮是大花金挖耳的主要殺菌活性物質之一[7]。任雙喜等[20]研究發(fā)現(xiàn)，天名精內(nèi)酯酮對小麥白粉病菌菌落的擴展具有明顯抑制作用，對小麥白粉病具有保護和治療雙重效果，且灌根處理對小麥白粉病有較好的防效，說明天名精內(nèi)酯酮具有較優(yōu)的內(nèi)吸傳導性能。本研究中天名精內(nèi)酯酮對供試的11種所屬不同分類地位的病原真菌均表現(xiàn)出較好的離體或活體抑菌活性，這些病原真菌包括半知菌亞門5種，子囊菌亞門4種，擔子菌亞門和鞭毛菌亞門各1種。其中，天名精內(nèi)酯酮對小麥全蝕病菌菌絲生長的EC50為4.894 7 mg/L，對黃瓜炭疽病菌孢子萌發(fā)的EC50為6.876 5 mg/L， 1 000 mg/L劑量下對小麥全蝕病的保護效果和治療效果分別為85.48%和64.98%，說明天名精內(nèi)酯酮具有較強的殺菌活性，并具有一定的廣譜性，具備進一步研究的價值。尤其對小麥全蝕病菌在離體和活體測定中均表現(xiàn)出了較高的殺菌活性，在后續(xù)的研究中應當予以重視。

天名精內(nèi)酯酮的來源植物資源分布廣泛，具備從多種途徑開發(fā)應用的潛質。首先，可直接從植物中分離提取天名精內(nèi)酯酮。天名精內(nèi)酯酮是廣泛存在于菊科天名精屬植物中的倍半萜內(nèi)酯類化合物，在植株的花、莖葉及根中均有分布，目前已在煙管頭草[21]、大花金挖耳[22]、天名精[16]等天名精屬植物中分離得到。天明精屬(CarpesiumL.)植物屬于菊科(Compositae)旋復花亞族，為多年生草本植物。該屬共有21種，大部分分布于亞洲中部，特別是我國西南山區(qū)，少數(shù)種類廣布歐、亞大陸，我國有17種，3變種[23]。其次，在合理開發(fā)自然資源的前提下，對天名精內(nèi)酯酮的開發(fā)利用也可從人工合成和生物合成2個方面進行。通過利用現(xiàn)代化學技術和手段，研究、開發(fā)其化學合成工藝，實現(xiàn)天名精內(nèi)酯酮的人工全合成，并在此基礎上適當進行結構修飾，有望獲得更加優(yōu)異的殺菌活性化合物；通過利用植物組織培養(yǎng)、細胞培養(yǎng)及植物內(nèi)生菌發(fā)酵等技術實現(xiàn)天名精內(nèi)酯酮的生物合成，天明精內(nèi)酯酮屬倍半萜類物質，萜類化合物雖然形態(tài)各異，但均是由異戊二烯基二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)聚合而成[24-25]。目前對該生物合成的途徑和步驟逐漸清晰，許多關鍵酶的基因被克隆分離，尤其是萜類合成酶研究進展較快，已有多種萜類生物合成的關鍵酶晶體結構的報道[26-27]，這預示著天明精內(nèi)酯酮的生物合成將指日可待。

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