毛忠順，龍?jiān)戮辏鞎?軍，陳中堅(jiān)，魏富剛，何霞紅，朱有勇

(1 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) a 植物保護(hù)學(xué)院，b 園林園藝學(xué)院，云南 昆明 650201；2 文山苗鄉(xiāng)三七實(shí)業(yè)有限公司， 云南 文山 663000； 3 文山學(xué)院 文山三七研究院，云南 文山 663000；4 文山州植保植檢站，云南 文山 663000)

三七Panaxnotoginseng(Burk.) F.H.Chen,又名田七[1]、金不換，為五加科人參屬多年生宿根草本植物。三七葉、莖、塊根中豐富的皂苷，在給人們提供豐富的藥用成分的同時(shí)，也給病原菌的發(fā)生、發(fā)展提供了可能。三七地上部分的主要病害有黑斑病[2]、炭疽病[3]、灰霉病[4]、圓斑病[5]、病毒病[6]，地下部分病害主要為三七根腐病。三七的地上部分病害對(duì)三七的影響非常大，但可以通過化學(xué)或物理防治措施來控制。三七銹腐病是目前三七根腐病中發(fā)病率最高、危害最為嚴(yán)重的一種地下部分病害。王勇等[7]報(bào)道，三七銹腐病的病原菌是柱孢屬真菌Cylindrocarponspp.，常年發(fā)病率在10%～30%，嚴(yán)重者可達(dá)90%以上，但是對(duì)三七銹腐病病原菌的鑒定并沒有到種?？娮髑宓萚8]報(bào)道，毀滅柱孢Cylindrocarpondestructans和雙孢柱孢Cylindrocarpondidymum是三七根腐病的病原菌，其致病力較弱，但病害癥狀在田間分布范圍廣，分離頻率最高達(dá)100%，且可導(dǎo)致典型的黃腐型癥狀，但是并沒有提出三七銹腐病的概念。李世東等[9]研究了不同溫度、pH值、多種培養(yǎng)基和碳氮源營(yíng)養(yǎng)等對(duì)三七根腐病主要致病菌C.desstructans(2-8) 和C.didynum(1-1) 菌落擴(kuò)展、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)等的影響。

云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物多樣性與植物病害控制課題組在云南文山州硯山縣、廣南縣等地調(diào)查發(fā)現(xiàn)，無論是在三七種苗期或是在二、三年七階段，三七銹腐病是所有根部病害中發(fā)病率最高的一種，而目前針對(duì)三七銹腐病的研究卻較少。在人工培養(yǎng)基上，真菌產(chǎn)孢與否，直接影響著其形態(tài)鑒定；而產(chǎn)孢量的多少，影響著致病性的測(cè)定。因此，開展三七銹腐病菌在不同培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量研究，優(yōu)化三七銹腐菌的產(chǎn)孢培養(yǎng)基，有利于三七銹腐病菌的致病性、致病機(jī)制以及防治方法的研究。本研究對(duì)采自云南省硯山縣盤龍鄉(xiāng)的三七銹腐病標(biāo)樣進(jìn)行了分離、純化，經(jīng)柯赫氏法則驗(yàn)證后，進(jìn)行了三七銹腐病菌的形態(tài)和分子生物學(xué)鑒定，同時(shí)對(duì)三七銹腐病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 病原菌 三七銹腐病病株采自云南省文山州硯山縣盤龍鄉(xiāng)文山三七科技示范園，采集后2 d內(nèi)分離病原菌。

1.1.2 培養(yǎng)基 4種供試基礎(chǔ)培養(yǎng)基為馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PSA)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、察氏培養(yǎng)基(Czapek’s)和胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基(CA)。

1.2 病原菌菌株的分離與純化

病原菌分離參照方中達(dá)[10]的組織分離法。將三七銹腐病病根洗凈后，無菌條件下于根部病健交界處切取大小為5 mm×5 mm的組織塊，用體積分?jǐn)?shù)75%酒精消毒30 s，體積分?jǐn)?shù)10%次氯酸鈉水溶液消毒1 min，無菌水換洗3次，用無菌濾紙吸干水分后移至PDA平板中，置于培養(yǎng)箱中25 ℃恒溫培養(yǎng)，每24 h觀察1次。當(dāng)病變組織長(zhǎng)出菌落后，挑取菌落邊緣的少許菌絲移入PDA平板上培養(yǎng)，并挑取單孢菌落純化。

1.3 分離菌株的柯赫氏法則驗(yàn)證

將1.2中得到的單孢純培養(yǎng)菌株培養(yǎng)14 d后，刮下菌絲體，用無菌水稀釋，以血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后制成孢子密度為106mL-1的懸浮液。用無菌毛刷蘸取孢子懸浮液涂抹于1年生三七塊根表面后移栽于滅菌基質(zhì)中，每處理10株，重復(fù)3次，以涂抹無菌清水的三七塊根為對(duì)照(CK)，按常規(guī)方法管理。30 d后取出，用清水沖洗根部，觀察三七塊根發(fā)病情況，記錄結(jié)果并照相。病害按以下標(biāo)準(zhǔn)分為6級(jí):0級(jí)，無??；1級(jí)，病斑占表面積5%以下；2級(jí)，病斑占表面積6%～10%；3級(jí)，病斑占表面積的11%～25%；4級(jí)，病斑占表面積的26%～50%；5級(jí)，病斑占表面積的51%～75%，塊根外觀受到嚴(yán)重影響；6級(jí)，病斑占表面積75%以上或完全腐爛。病情指數(shù)計(jì)算公式為：病情指數(shù)=∑(各級(jí)病害株數(shù)×各級(jí)代表數(shù)值)×100/(調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)代表值)[10]。對(duì)發(fā)病部位進(jìn)行病原物再分離并與原分離的病原物進(jìn)行比較。根據(jù)病情指數(shù)及分離頻率，選取致病性較強(qiáng)的菌株作為產(chǎn)孢試驗(yàn)的供試菌株。

1.4 分離菌株的鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定 將單孢菌株培養(yǎng)10 d后，觀察并記錄菌落形態(tài)，采用徠卡(Leica)DM 2000顯微鏡觀察不同類型孢子的顏色，LAS V4.0照相系統(tǒng)測(cè)量分生孢子、分生孢子梗和厚垣孢子的大小等。根據(jù)形態(tài)學(xué)及顯微觀察數(shù)據(jù)鑒定病原菌。

1.4.2 分子鑒定 1)DNA的提取。用真菌基因組DNA提取試劑盒(Andy Bio)提取病原菌的DNA。

2)PCR擴(kuò)增。利用根據(jù)ITS區(qū)段設(shè)計(jì)的引物對(duì)ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)及ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)(由上海生工生物工程有限公司合成)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系50 μL：1×PCR Buffer，200 μmol/L dNTPs,0.24 μmol/L 的ITS1F及ITS4，2 U的TaqDNA 聚合酶(Transgen 公司)，50～100 ng模板DNA，用無菌超純水補(bǔ)足到50 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在ABi Thermal Cycler 9902上進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火1.5 min,72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃最終延伸10 min,4 ℃保存[11]。

3)PCR產(chǎn)物。產(chǎn)物用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，UVP 凝膠成像系統(tǒng)記錄影像，PCR產(chǎn)物送交北京六合華大基因股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用Mega 4.1 軟件中的Neighbor-joining方法進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[12]。

1.5 產(chǎn)孢培養(yǎng)基的優(yōu)化

供試產(chǎn)孢培養(yǎng)基以PSA、PDA、Czapek’s和CA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。在以PDA和PSA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配方中，將馬鈴薯的量依次設(shè)為200，150，100，50和0 g/L，其他成分的量不變，以PSA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配方分別記為PSA1、PSA2、PSA3、PSA4和PSA5，以PDA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配方分別記為PDA1、PDA2、PDA3、PDA4和PDA5；在以Czapek’s為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配方中，將蔗糖的量依次設(shè)為30，20，10，5和0 g/L，分別記為Cz1、Cz2、Cz3、Cz4和Cz5，其他成分的量不變；在以CA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配方中，將胡蘿卜的量依次設(shè)為100，200，400，600，800 g/L，其他成分的量不變，分別記為C1、C2、C3、C4和C5。上述培養(yǎng)基經(jīng)121 ℃高溫濕熱滅菌30 min，分裝備用。選用1.3中致病性較強(qiáng)的菌株作為供試菌株，將病原菌的純培養(yǎng)物用直徑為6 mm的打孔器打孔后，分別接入上述滅菌培養(yǎng)基中，每處理10個(gè)重復(fù)。于25 ℃恒溫培養(yǎng)，14 d后刮下菌絲體，無菌水倍比稀釋后，以血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 三七銹腐病菌的分離

將患有銹腐病的三七根部病健交界處的組織塊(圖1-A)在PDA平板上培養(yǎng)8 d后，從組織塊上長(zhǎng)出了白色的菌絲，邊緣米黃色，背面銹色至淺褐色(圖1-B)。從菌落邊緣挑取肉眼可見的少許菌絲至PDA平板上，25 ℃恒溫培養(yǎng)10 d，挑取單孢菌落純化后，得到8個(gè)單孢菌株，編號(hào)分別為Cd-M-1、Cd-M-2、Cd-M-3、Cd-M-4(圖1-C)、Cd-M-5、Cd-M-6(圖1-D)、Cd-M-7和Cd-M-8。

2.2 分離菌株的柯赫氏法則驗(yàn)證

對(duì)分離到的單孢菌株進(jìn)行柯赫氏法則驗(yàn)證，結(jié)果如圖2所示。將分離到的單孢菌株在室外活體接種10 d后，觀察發(fā)現(xiàn)90%以上已接種病原菌的三七植株地上部分出現(xiàn)輕度倒伏，15 d后發(fā)病植株的地上部分葉片和莖發(fā)黃，嚴(yán)重者甚至干枯、腐爛；30 d后將植株全部取出，洗凈根部觀察，發(fā)現(xiàn)接種不同單孢菌株的三七根部發(fā)病程度不一，輕者根部有銹狀物，嚴(yán)重者根部出現(xiàn)黑色腐爛癥狀，而未接種病原菌的對(duì)照植株則未發(fā)病。對(duì)發(fā)病植株和對(duì)照植株的根部和莖基部進(jìn)行再分離，均能從發(fā)病植株的根部和莖基部分離到病原菌，且形態(tài)和結(jié)構(gòu)與原分離的病原菌菌株相同，符合柯赫氏法則，而無菌水對(duì)照植株的根部和莖基部均未分離到病原菌(圖2)。由此證明，分離到的單孢菌株即為三七銹腐病的病原菌。

圖 1 三七銹腐病發(fā)病部位及分離的病原物

圖 2 三七銹腐病菌分離菌株的接種及再分離試驗(yàn)結(jié)果

8株單孢菌株的接種試驗(yàn)結(jié)果(表1)表明，致病菌株有4株，分別為Cd-M-3、Cd-M-6、Cd-M-7和Cd-M-8，其中Cd-M-6的致病性最強(qiáng)，病情指數(shù)為68.33±5.11；其次為Cd-M-7，病情指數(shù)為34.31±3.12；Cd-M-3的病情指數(shù)為24.32±3.09；Cd-M-8的致病力最弱，病情指數(shù)為19.21±2.01。

表 1 接種分離菌株30 d后三七銹腐病的發(fā)病率及病情指數(shù)

2.3 三七銹腐病菌的鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 根據(jù)致病性測(cè)定結(jié)果，選取致病性最強(qiáng)的單孢菌株Cd-M-6作為鑒定目標(biāo)菌株。

圖 3 三七銹腐病菌的顯微觀察結(jié)果

在PSA培養(yǎng)基上，Cd-M-6菌絲絨狀，平展，同心狀展開，初生菌絲白色，老熟菌絲金黃色，培養(yǎng)基背面銹色至褐色。小型分生孢子梭狀，0～1隔。大型分生孢子直立，柱狀，基部稍窄，無色至淡金黃色，1～4隔，其中1～2隔的孢子多見，3隔分生孢子少見，偶見4隔分生孢子，在生長(zhǎng)后期，多為1～2隔分生孢子。小型分生孢子(5.4～10.9) μm×(2.7～3.2) μm；1隔分生孢子(11.1～29.4) μm×(3.5～5.1) μm；2～3隔分生孢子(18.1～40) μm×(3.6～10.0) μm。產(chǎn)孢梗單生，在分生孢子梗中部長(zhǎng)出較短小產(chǎn)孢梗，(18.5～88.0) μm×(1.70～3.32) μm。厚垣孢子銹色，串生或鏈生，孢子直徑大小5.2～12.6 μm。在PSA培養(yǎng)基上，未見有性階段。 根據(jù)其形態(tài)特點(diǎn)、培養(yǎng)性狀和產(chǎn)孢特點(diǎn)，將分離菌株鑒定為毀滅柱孢Cylindrocarpondestructans(Zins.) Scholten[14-16]，有性態(tài)為Ilvonectriaradicicola(Gerlach & L.Nilsoon) P.chaverri & C.Salgado[17]。

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定 前期研究表明，用試劑盒提取的DNA質(zhì)量濃度在20 ng/μL左右，其純度較高，可直接用于普通PCR。因此，獲得真菌全基因組DNA后，采用ITS1F/ITS4進(jìn)行PCR，結(jié)果見圖4。由圖4可見，8個(gè)泳道均出現(xiàn)了較亮的條帶，片段大小在500～750 bp。

圖 4 三七銹腐病菌基因組ITS-PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果

將PCR產(chǎn)物送北京六合華大基因股份有限公司純化后測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)，取形態(tài)接近且與人參屬植物銹腐病或其他植物根腐病密切相關(guān)的柱孢屬真菌C.destructans,C.decumbens,C.didymum,C.macrodidymum,C.obtusisporum,C.liriodendri和C.pauciseptatum菌株登錄在GenBank序列的ITS1-5.8S-ITS2作為參考，采用Mega 4.1軟件中的Neighbor-joining進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析(Bootstrap，1 000次重復(fù))，結(jié)果如圖5所示。

圖 5 三七銹腐病菌ITS1-5.8S-ITS2序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

由圖5可以看出，在92%水平上，8個(gè)三七銹腐病菌的單孢菌株與毀滅柱孢C.destructans的菌株AF220968、HM364290和JN541219聚為一類，相似度最為接近(大于70%)。因此，在分子生物學(xué)上，將8個(gè)三七銹腐病菌的單孢菌株鑒定為毀滅柱孢C.destructans。

2.4 不同培養(yǎng)基對(duì)三七銹腐病菌產(chǎn)孢量的影響

2.4.1 不同配方培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量 在各個(gè)不同的培養(yǎng)基中，由于每一皿中的產(chǎn)孢量較大，為便于計(jì)算，取產(chǎn)孢量數(shù)值的對(duì)數(shù)作為考量指標(biāo)，再用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

由表2可以看出， PSA或PDA培養(yǎng)基中若不添加馬鈴薯，則三七銹腐病菌不能產(chǎn)孢。在PSA培養(yǎng)基中，馬鈴薯用量為200 g/L時(shí)，產(chǎn)孢量最高，隨著馬鈴薯用量的減少，產(chǎn)孢量逐漸減少，且彼此間差異顯著，說明200 g/L的馬鈴薯用量最適合三七銹腐病菌產(chǎn)孢。在PDA培養(yǎng)基各配方中，也出現(xiàn)了與PSA同樣的趨勢(shì)，但馬鈴薯用量為150或200 g/L時(shí)，對(duì)三七銹腐病菌的產(chǎn)孢量沒有顯著影響。說明在PDA培養(yǎng)基中，馬鈴薯用量為150 g/L較為適合三七銹腐病菌產(chǎn)孢。

表 2 三七銹腐病菌在不同配方PSA和PDA培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量

由表3可以看出，在Czapek’s培養(yǎng)基各配方中，不添加蔗糖，三七銹腐病菌也能夠產(chǎn)孢；蔗糖用量為20和30 g/L時(shí)，對(duì)三七銹腐病菌的產(chǎn)孢量沒有顯著(P>0.05)影響；其余各配方中，隨著蔗糖用量的減少，產(chǎn)孢量逐漸減少，蔗糖用量為10～30 g/L 時(shí)，產(chǎn)孢量差異不顯著。說明在Czapek’s培養(yǎng)基中，蔗糖用量為20 g/L較合適。在CA培養(yǎng)基中，胡蘿卜用量分別為400和800 g/L時(shí)，三七銹腐病菌的產(chǎn)孢量較大，但二者差異不顯著；當(dāng)胡蘿卜用量為100 g/L時(shí)，三七銹腐病菌的產(chǎn)孢量最少。

表 3 三七銹腐病菌在不同配方Czapek’s和CA培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量

2.4.2 不同培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量 由表4可以看出，在PSA、PDA、Czapek’s和CA培養(yǎng)基中，以PSA的產(chǎn)孢量最大，達(dá)到109.5個(gè)/皿以上，與其他培養(yǎng)基相比差異顯著(P<0.05)，然后依次為PDA、CA、Czapek’s培養(yǎng)基。

表 4 三七銹腐病菌在不同培養(yǎng)基中的產(chǎn)孢量

3 結(jié)論與討論

3.1 三七銹腐病的病原菌

三七根腐病是三七生產(chǎn)中的一類重要病害，病原菌有藨草鐮孢霉(Fusariumscirpi)[18]、腐皮鐮刀菌(F.solani)[19]、腐皮鐮刀菌根腐?；?F.solanif.sp.Radicicola)[20]、尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)和串珠鐮孢中間變種(F.monilliformevar.intermedium)[21]、假單孢桿菌(Pseudomonassp.)[22-23]、雙孢柱孢(Cylindrocarpondidymum)、毀滅柱孢(C.destructans)、惡疫霉(Phytophothracactorum)、草莖點(diǎn)霉(Phomaherbarum)[8]。此外，小桿線蟲在三七根腐的進(jìn)程中起到加速作用[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，毀滅柱孢C.destructans是三七銹腐病的病原菌；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，毀滅柱孢能引起三七塊根和鱗莖上產(chǎn)生2種不同的癥狀，即銹裂和腐爛。這與毀滅柱孢引起的人參銹腐病的癥狀[25]相似。

3.2 三七銹腐病菌的產(chǎn)孢培養(yǎng)基

在病害研究中，對(duì)病原菌孢子萌發(fā)和產(chǎn)孢量的關(guān)注較多。PSA和PDA通常是真菌分離和純化的培養(yǎng)基，很少用作產(chǎn)孢培養(yǎng)基。CA被廣泛用作各種疫霉的產(chǎn)孢培養(yǎng)基[26-27]，察氏培養(yǎng)基是各種病原菌產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)研究的基礎(chǔ)培養(yǎng)基[28-29]。因此，本研究比較了不同培養(yǎng)基對(duì)三七銹腐病菌產(chǎn)孢的影響，結(jié)果表明，三七銹腐病菌在PSA上產(chǎn)孢量最大，其次為PDA，再次為CA培養(yǎng)基，最后是Czapek’s培養(yǎng)基。在PSA和PDA培養(yǎng)基上，隨著馬鈴薯用量的減少，產(chǎn)孢量減少。當(dāng)馬鈴薯用量為200 g/L時(shí)，三七銹腐病菌在PSA培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量最大。在PDA上，當(dāng)馬鈴薯用量為150 g/L時(shí)，較適合三七銹腐病菌產(chǎn)孢。在Czapek’s培養(yǎng)基上，隨著蔗糖用量的增加，三七銹腐病菌的產(chǎn)孢量逐漸增加，蔗糖用量為30 g/L最適宜三七銹腐病菌產(chǎn)孢。在CA培養(yǎng)基上，隨著胡蘿卜用量的增加，三七銹腐病菌產(chǎn)孢量逐漸增加，當(dāng)胡蘿卜用量為400 g/L時(shí)，三七銹腐病菌的產(chǎn)孢量最大。

按莖稈顏色來分，三七可分為紫莖三七、綠莖三七和紫綠相間三七。而三七銹腐病菌既能侵染綠莖三七，又能侵染紫莖三七。陳中堅(jiān)等[30]研究表明，三七的淀粉含量在39.09%～53.97%。這說明三七銹腐病菌具有淀粉酶和相應(yīng)降解多糖的酶[31-32]。這或許就是三七銹腐病菌在含有淀粉、多糖的PSA和PDA培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量高于CA和Czapek’s培養(yǎng)基的主要原因。

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