周 陽(yáng) ，祝長(zhǎng)青，郭桂萍，徐幸蓮，徐寶才，薛建麗，蔣 原，楊 軍，郭云昌，劉秀梅，付瑞燕

(1 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶與食品科技學(xué)院，安徽省食品安全分析與檢測(cè)省級(jí)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥230000；2 江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇 南京210001；3 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；4 江蘇雨潤(rùn)食品產(chǎn)業(yè)集團(tuán)有限公司，江蘇 南京210041；5 南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院,江蘇 南京 210028；6 國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心，北京100022)

單增李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes，LM)是一種重要的人畜共患病致病菌，主要污染肉類、乳制品和蔬菜等，從20世紀(jì)90年代起被世界衛(wèi)生組織列為最重要的食源性病原菌之一[1-3]。LM對(duì)環(huán)境的耐受性很強(qiáng)，具有耐鹽、耐低溫的特點(diǎn)，在冷藏溫度下仍然可以大量繁殖，引起動(dòng)物和人類流產(chǎn)、敗血癥、腦膜炎等疾病[4-7]。近年來(lái)，多次發(fā)生由LM引起的食源性疾病暴發(fā)并造成部分患者死亡，因此引起了世界各國(guó)的高度關(guān)注[8-9]。

目前，LM的檢驗(yàn)仍以傳統(tǒng)培養(yǎng)方法為主，這種方法操作繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，不能實(shí)現(xiàn)快速篩檢[10-11]。在此情況下，基于免疫學(xué)與分子生物學(xué)的快速檢測(cè)技術(shù)得以迅速發(fā)展，對(duì)食源性致病菌的檢測(cè)起到了重要作用。本試驗(yàn)選取RapidChek?李斯特菌蛋白條、CPA恒溫?cái)U(kuò)增法[12-13]和實(shí)時(shí)熒光PCR方法[14]檢測(cè)樣品中的LM，以篩選適用于不同條件且快速有效、實(shí)用性強(qiáng)的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗(yàn)材料 單增李斯特氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株CMCC 54004，由江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌菌種保藏管理中心。供檢新鮮樣品鹽水鴨、涼拌菜各200 g，購(gòu)自超市。

1.1.2 培養(yǎng)基 單增李斯特氏菌增菌肉湯LB1和LB2(北京陸橋)，胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA，美國(guó)OXOID)，胰蛋白胨大豆?fàn)I養(yǎng)肉湯(TSB，美國(guó)OXOID)，PALCAM瓊脂(美國(guó)OXOID)，李斯特顯色培養(yǎng)基(法國(guó)科瑪嘉)。

1.1.3 試 劑 蛋白酶K(20 mg/mL)，無(wú)水乙醇，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱)(Cat.#DP302，天根公司)，RapidChek?李斯特菌檢測(cè)試劑盒(產(chǎn)品編號(hào) 7000171)，李斯特菌核酸檢測(cè)試劑盒(恒溫?cái)U(kuò)增-試紙條法)(杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司)，單增李斯特氏菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒(上海輝睿生物科技有限公司，Cat.#BD-I-303)。

1.1.4 儀 器 恒溫振蕩金屬浴(博日MB-102)、高速離心機(jī)(Thermo Scientific Biofuge Stratos)、常規(guī)PCR儀(Eppendorf 5331/5332 Gene Genies)、實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增儀(Roche LightCycler 480Ⅱ)和電動(dòng)移液器等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 陰性樣品的確認(rèn) 按照國(guó)家食品安全標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.30-2010[15]對(duì)供檢的鹽水鴨、涼拌菜樣品進(jìn)行增菌，然后利用實(shí)時(shí)熒光PCR方法對(duì)增菌液進(jìn)行快速篩選，同時(shí)涂布PALCAM瓊脂和李斯特顯色培養(yǎng)基平板進(jìn)行菌落分離，選取檢測(cè)結(jié)果為陰性的樣品用于后期人工布菌試驗(yàn)。

1.2.2 陰性樣品增菌培養(yǎng)及LM標(biāo)準(zhǔn)菌株增菌液的制備 為了對(duì)3種快速檢測(cè)方法進(jìn)行比較，需要對(duì)1.2.1中得到的陰性樣品進(jìn)行增菌培養(yǎng)，然后與LM標(biāo)準(zhǔn)菌株純培養(yǎng)物的梯度稀釋液混合，制備檢測(cè)樣本。具體操作如下：將陰性樣品用LB1增菌肉湯進(jìn)行增菌，(30±1) ℃培養(yǎng)24 h；從LB1增菌后的菌液中吸取1 mL至盛有100 mL LB2增菌肉湯的錐形瓶中，(30±1) ℃培養(yǎng)24 h，得到樣品增菌液；同時(shí)，用胰蛋白胨大豆?fàn)I養(yǎng)肉湯對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株CMCC 54004進(jìn)行增菌，(37±1) ℃培養(yǎng)24 h，獲得LM標(biāo)準(zhǔn)菌株增菌液。

1.2.3 LM標(biāo)準(zhǔn)菌株梯度稀釋液的制備及樣品布菌 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株CMCC 54004的增菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋(增菌液在稀釋前用振蕩器將菌懸液充分振勻)，將100～107倍稀釋的菌液按照每管100 μL分裝至1.5 mL的離心管中，每個(gè)稀釋度準(zhǔn)備6份備用。為了解標(biāo)準(zhǔn)菌株純培養(yǎng)物的生長(zhǎng)情況，吸取100 μL 10-5～10-7梯度的稀釋菌液(涂布前必須將其各自充分混勻)均勻涂布于胰蛋白大豆瓊脂(TSA)上，每個(gè)梯度涂布3塊平板，(37±1) ℃培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)，取平均值。

取1.2.2中的樣品增菌液900 μL至1.5 mL離心管中，然后加入100 μL標(biāo)準(zhǔn)菌株純培養(yǎng)物的各梯度稀釋液(分裝前陰性樣品增菌液和標(biāo)準(zhǔn)菌株增菌液均需充分混勻)，得到混合菌液，振蕩混勻，12 000g離心10 min，棄上清，備用。

1.2.4 核酸提取 取3份1.2.3中制備的混合菌液，利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱)提取核酸備用，具體操作步驟按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.5 蛋白條檢測(cè) 取3份混合菌液，用400 μL生理鹽水懸浮沉淀，沸水浴10 min，冷卻至室溫，然后用蛋白檢測(cè)試紙條進(jìn)行快速檢測(cè)，以無(wú)菌水作陰性對(duì)照，以標(biāo)準(zhǔn)菌株純培養(yǎng)物作陽(yáng)性對(duì)照，具體操作見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。

1.2.6 CPA恒溫?cái)U(kuò)增法[12-13]檢測(cè) 取出裝有玻璃化試劑的反應(yīng)管，每管加入15 μL復(fù)溶緩沖液(包括dNTP、Mg2+、PCR反應(yīng)預(yù)混液等)，然后滴加20 μL的石蠟油，室溫靜置2～3 min以促進(jìn)玻璃化試劑的充分溶解。此后，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，并設(shè)置陰、陽(yáng)性對(duì)照(陰性對(duì)照加入4 μL無(wú)菌水，陽(yáng)性對(duì)照加4 μL標(biāo)準(zhǔn)菌株純培養(yǎng)物)。將反應(yīng)管置于常規(guī)PCR儀或恒溫儀上，63 ℃ 反應(yīng)45 min，將擴(kuò)增后的反應(yīng)管放入固定盒中，合上固定盒后將其裝入裝置外盒，在15～30 min觀察并記錄檢測(cè)結(jié)果，30 min后判讀結(jié)果無(wú)效。觀察3次平行試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果，拍照記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光PCR方法[14]檢測(cè) 選用LM實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒對(duì)提取的核酸進(jìn)行檢測(cè)評(píng)估?？偡磻?yīng)體系25 μL：包括12.5 μL LM PCR反應(yīng)液Ⅰ(主要包括PCR反應(yīng)預(yù)混液、dNTP、Mg2+等)，4 μL LM PCR反應(yīng)液Ⅱ(主要包括引物、探針)，3.5 μL滅菌蒸餾水，5.0 μL DNA模板(以無(wú)菌水作陰性對(duì)照，以標(biāo)準(zhǔn)菌株純培養(yǎng)物作陽(yáng)性對(duì)照)。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s，58 ℃復(fù)性45 s，收集熒光信號(hào)，50個(gè)循環(huán)；40 ℃冷卻40 s。將3次平行試驗(yàn)反應(yīng)結(jié)束后的Ct值取平均值，并進(jìn)行結(jié)果分析。

1.2.8 傳統(tǒng)平板分離方法檢測(cè) 利用LM顯色平板將標(biāo)準(zhǔn)菌株梯度稀釋液以及1.2.3中得到的混合菌液分別劃線培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)24 h，每個(gè)平板挑取5個(gè)可疑菌落，利用實(shí)時(shí)熒光PCR進(jìn)行快速檢測(cè)，同時(shí)在TSA培養(yǎng)基上劃線純化培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行生化鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 LM標(biāo)準(zhǔn)菌株的平板計(jì)數(shù)

平板計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，100 μL 經(jīng)107倍稀釋后的LM菌液平板計(jì)數(shù)的平均值為5，所對(duì)應(yīng)的細(xì)菌數(shù)量級(jí)為100；經(jīng)106倍稀釋后的菌液平板計(jì)數(shù)的平均值為44，所對(duì)應(yīng)的細(xì)菌數(shù)量級(jí)為101；經(jīng)105倍稀釋后的菌液平板計(jì)數(shù)的平均值為453，所對(duì)應(yīng)的細(xì)菌數(shù)量級(jí)為102。依此類推，經(jīng)104、103、102、101、100倍稀釋后對(duì)應(yīng)的細(xì)菌數(shù)量級(jí)分別為103、104、105、106、107。

2.2 LM的蛋白條檢測(cè)

不同樣品中LM的蛋白條檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖 1 不同樣品中單增李斯特氏菌的蛋白條檢測(cè)結(jié)果

由圖1可知，LM蛋白檢測(cè)試紙條的質(zhì)控線(即C線)正常，表明檢測(cè)結(jié)果可靠。在LM純菌增菌液、鹽水鴨和涼拌菜基質(zhì)中的最低檢測(cè)限為10-1，即菌體數(shù)量級(jí)在106時(shí)檢測(cè)線(即T線)明顯，可檢測(cè)出食品中的LM。該法操作簡(jiǎn)單，只需通過(guò)觀察質(zhì)控線和檢測(cè)線即可判定結(jié)果，但檢測(cè)靈敏度太低。

2.3 LM的CPA恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)

由圖2可知，CPA恒溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)試紙條的質(zhì)控線(即C線)正常，表明檢測(cè)結(jié)果可信。在純菌增菌液中該方法的檢測(cè)限為10-3，即當(dāng)菌體數(shù)量級(jí)為104時(shí)檢測(cè)線(即T線)明顯，此時(shí)可檢測(cè)出食品中的LM；在鹽水鴨和涼拌菜基質(zhì)中，檢測(cè)限為10-2，略低于純菌，說(shuō)明食品基質(zhì)中不同成分對(duì)LM的CPA恒溫?cái)U(kuò)增法存在一定干擾，但影響程度很小，在實(shí)際檢測(cè)工作中的實(shí)用性較強(qiáng)。

圖 2 不同樣品中單增李斯特氏菌的CPA恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)結(jié)果

2.4 LM的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)

由圖3可知，經(jīng)過(guò)天根離心柱法提取核酸后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，陰性、陽(yáng)性對(duì)照正常，擴(kuò)增曲線典型。由表1可見(jiàn)，純菌增菌液與2種食品基質(zhì)的檢測(cè)結(jié)果類似，檢測(cè)靈敏度相同，最低檢測(cè)限為10-6(即菌體數(shù)量級(jí)為101)時(shí)仍可檢出食品中的LM，檢測(cè)靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確，非常適合對(duì)含有少量LM樣品的檢測(cè)。

2.5 3種LM快速檢測(cè)方法的比較與驗(yàn)證

由以上結(jié)果可知，利用實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)LM的靈敏度最高，當(dāng)增菌液中僅含有幾十個(gè)目標(biāo)菌時(shí)便可通過(guò)該方法檢測(cè)出來(lái)，因此可以利用該方法對(duì)大量的檢測(cè)樣品進(jìn)行初步篩選，然后利用傳統(tǒng)方法進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證，從而進(jìn)一步提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性和檢測(cè)效率；其次是CPA恒溫?cái)U(kuò)增法，該方法的操作步驟相對(duì)簡(jiǎn)單，不需要熒光PCR儀等大型儀器，比較適合基層實(shí)驗(yàn)室；靈敏度最低的是蛋白條檢測(cè)法，該方法的操作步驟最為簡(jiǎn)單，無(wú)需進(jìn)行細(xì)菌核酸的提取，也不需要大型的儀器，只需要進(jìn)行煮沸即可進(jìn)行目標(biāo)菌的檢測(cè)，但是當(dāng)菌體含量較低時(shí)會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。通過(guò)傳統(tǒng)平板分離方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，試驗(yàn)中的樣品增菌液在菌體數(shù)量級(jí)達(dá)到104時(shí)可以通過(guò)顯色平板劃線培養(yǎng)分離到LM，從而進(jìn)一步證實(shí)了以上3種檢測(cè)方法的可行性。

3 結(jié)論與討論

目前，在LM的快速檢測(cè)方法中，免疫學(xué)檢測(cè)方法和分子生物學(xué)檢測(cè)方法應(yīng)用較為廣泛。由于ELISA法操作繁瑣，檢測(cè)過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)，因此本試驗(yàn)選取了LM蛋白條檢測(cè)法；分子生物學(xué)檢測(cè)方法選取了CPA恒溫?cái)U(kuò)增法和實(shí)時(shí)熒光PCR方法。

圖 3 不同樣品中單增李斯特氏菌的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果

本試驗(yàn)通過(guò)比較3種快速檢測(cè)方法發(fā)現(xiàn)，蛋白條檢測(cè)法雖然操作簡(jiǎn)單，但容易受到菌體數(shù)量以及檢測(cè)蛋白種類的影響，檢測(cè)靈敏度低，在實(shí)際樣品檢測(cè)中應(yīng)用性差；CPA恒溫?cái)U(kuò)增法僅需具備恒溫功能的相關(guān)儀器就可以進(jìn)行PCR反應(yīng)，操作簡(jiǎn)單，既克服了蛋白條檢測(cè)靈敏度低的缺點(diǎn)，又不需要先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)儀器，降低了實(shí)驗(yàn)成本，縮短了檢測(cè)周期，提高了檢測(cè)效率，其中玻璃化DNA聚合酶保存技術(shù)實(shí)現(xiàn)了試劑盒的常溫運(yùn)輸，密閉的一次性核酸檢測(cè)裝置有效地避免了擴(kuò)增產(chǎn)物氣溶膠擴(kuò)散造成的污染和假陽(yáng)性，可以通過(guò)檢測(cè)試紙條直接對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判讀，比較適合基層實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用；實(shí)時(shí)熒光PCR方法的特異性好，檢測(cè)靈敏度高，最低檢測(cè)限可達(dá)到幾十個(gè)菌，同時(shí)還避免了常規(guī)PCR必需的電泳過(guò)程，縮短了檢測(cè)周期，極大地降低了交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)，能較好地完成實(shí)際樣品的檢測(cè)，但操作比較繁瑣，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件、儀器及實(shí)驗(yàn)人員的操作水平要求較高，適用于實(shí)驗(yàn)條件比較優(yōu)越的實(shí)驗(yàn)室。

表 1 不同樣品中單增李斯特氏菌檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)的Ct值

本試驗(yàn)結(jié)果表明，CPA恒溫?cái)U(kuò)增法和實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)效果較好，周期短，檢測(cè)效率高。同時(shí)通過(guò)與傳統(tǒng)平板分離鑒定方法的對(duì)比，證實(shí)了2種快速檢測(cè)方法的可行性，為不同水平的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)提供了較好的選擇，在實(shí)際檢測(cè)中可以將快速檢測(cè)方法與傳統(tǒng)方法進(jìn)行有機(jī)結(jié)合，構(gòu)建比較完備的檢測(cè)體系，從而極大地提高檢測(cè)效率。

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