申 蕓，符華林，周 鳳，張 偉，舒 剛，唐 文，盧朝成

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)系，動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 雅安 625014)

土霉素(Oxytetracycline，OTC)是在土壤鏈霉菌(Streptomyces rimosus)的培養(yǎng)液中提取獲得的四環(huán)素類廣譜抗生素，對(duì)革蘭陽(yáng)性菌、革蘭陰性菌、支原體、衣原體、立克次氏體等引起的感染有效，動(dòng)物臨床上廣泛用于治療畜禽的痢疾、肺炎、尿路感染和腸道感染，也可用于原蟲引起的附紅細(xì)胞體病、弓形蟲病以及奶牛子宮內(nèi)膜炎和乳房炎的治療[1]。但由于土霉素分子中含有酚羥基、烯醇結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致其性質(zhì)不穩(wěn)定，內(nèi)服吸收差，難以達(dá)到治療濃度，且易形成“肝腸循環(huán)”，增加肝臟毒性。土霉素注射液多以有機(jī)溶劑配制，其注射給藥時(shí)往往存在局部刺激性，順應(yīng)性較差，這使得土霉素的臨床應(yīng)用受到限制。為了改善土霉素普通制劑存在的問題，人們研制了土霉素聚乳酸微球[2]、鹽酸土霉素泡騰片[3]等，但多因工藝復(fù)雜、材料不易得而難以推廣。

固體脂質(zhì)納米粒(Solid lipid nanoparticles,SLN)亦稱為固體脂質(zhì)體，其研究始于20世紀(jì)90年代，是以三酰甘油、單硬脂酸甘油酯等脂質(zhì)為載體材料，將藥物包裹或鑲嵌于類脂核中制成粒徑50～1 000 nm的固體脂質(zhì)微粒給藥體系[4]。SLN主要用于包裹難溶性藥物，其具有物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、生物相容性好、可生物降解、緩釋、靶向性強(qiáng)、成本低和可大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)[5-7]，但獸醫(yī)臨床尚未有固體脂質(zhì)納米粒的研究報(bào)道。

近年來(lái)，抗菌藥物的緩釋控釋制劑研究受到廣泛關(guān)注，特別對(duì)于時(shí)間依賴性抗生素，研究表明其體內(nèi)藥物濃度大于最低抑菌濃度(MIC)的持續(xù)時(shí)間須超過給藥間期的40%～50%，抗菌活性才能到最大化[8]，因此開發(fā)其緩釋控釋制劑具有十分重要的臨床意義。土霉素屬于時(shí)間依賴性抗生素，其抑菌效果主要取決于其與細(xì)菌的接觸時(shí)間，因此研發(fā)土霉素固體脂質(zhì)納米粒(Oxytetracycline solid lipid nanoparticles,OTC-SLN)不僅可以使土霉素緩慢釋放，延長(zhǎng)其作用時(shí)間，提高生物利用度，而且由于納米粒獨(dú)特的滲透效應(yīng)還有利于對(duì)細(xì)胞內(nèi)感染的治療。本課題組研制了土霉素固體脂質(zhì)納米粒，為了進(jìn)一步明確固體脂質(zhì)納米粒對(duì)土霉素在體內(nèi)作用過程的影響，本試驗(yàn)對(duì)其在家兔體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究，并采用非房室數(shù)學(xué)模型統(tǒng)計(jì)矩方法計(jì)算了主要的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，以期為臨床用藥及給藥方案的設(shè)計(jì)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 藥品與試劑 土霉素對(duì)照品，河北圣雪大成制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)，含量99.05%；色譜甲醇、乙腈，天津科密歐化工試劑廠生產(chǎn)；土霉素注射液和土霉素固體脂質(zhì)納米粒(OTC-SLN)為四川農(nóng)業(yè)大學(xué)藥物制劑工程技術(shù)實(shí)驗(yàn)室自制，其注射液符合中國(guó)獸藥典要求。其他試劑均為分析純級(jí)試劑。

1.1.2 主要儀器 島津SHIMADZU LC-2010C HT(CLASS-VP 6.13 multi)高效液相色譜系統(tǒng)(島津國(guó)際貿(mào)易上海有限公司)，XW-80A漩渦混合器(上海青浦滬西儀器廠)，高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)科峻儀器公司)。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 家兔10只，體質(zhì)量(2.5±0.2) kg/只，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，使用許可證號(hào)：scxk(川)-10-2006。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將10只家兔隨機(jī)分成2組，即土霉素注射液組和土霉素固體脂質(zhì)納米粒組。試驗(yàn)前用專用飼料飼養(yǎng)7 d，給藥前采血作為空白對(duì)照，之后2組均采取腹腔注射的方法給藥，給藥劑量均相當(dāng)于土霉素原藥20 mg/kg。給藥后，分別于0.083，0.25，0.5，1，2，4，6，8，12，24，36，48，60，72，84和96 h采取每只家兔耳緣靜脈血1 mL，加入肝素鈉抗凝， 4 000 r/min 離心15 min，取上層血漿，置于-20 ℃冰箱中保存。

1.3 血漿樣品中土霉素質(zhì)量濃度測(cè)定方法的建立

1.3.1 HPLC色譜條件 色譜柱：KromasilC18柱(4.6 mm×150 mm, 5 μm)；流動(dòng)相：0.01 mol/mL草酸-乙晴(V(草酸)∶V(乙腈)=89∶11)；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：276 nm；進(jìn)樣量：50 μL。

1.3.2 方法專屬性 取家兔空白對(duì)照血漿、加有土霉素的空白對(duì)照血漿樣品(土霉素含量100 μg/mL)、家兔腹腔注射土霉素注射液和土霉素固體脂質(zhì)納米粒后的血漿樣品各500 μL，加入2.0 mL的EP管中，再分別加入體積分?jǐn)?shù)20%高氯酸100 μL和甲醇400 μL，漩渦振蕩60 s混勻，13 000 r/min 離心5 min，吸取全部上清液于40 ℃水浴中氮?dú)獯蹈?，殘余物?00 μL流動(dòng)相溶解，13 000 r/min 離心3 min，取上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，進(jìn)樣50 μL進(jìn)行HPLC分析，記錄色譜圖，以考察血漿內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)土霉素質(zhì)量濃度的測(cè)定是否有干擾。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及最低檢測(cè)限的測(cè)定 精密稱取一定量土霉素對(duì)照品，加入0.01 mol/mL鹽酸溶解，配成質(zhì)量濃度為500 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4 ℃保存?zhèn)溆?。分別移取儲(chǔ)備液適量于10 mL容量瓶中，用0.01 mol/mL鹽酸定容配成2.5，5，10，20，40，80，160和320 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取空白對(duì)照血漿400 μL，分別加入不同質(zhì)量濃度的土霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL，使血漿土霉素標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度分別為0.5，1，2，4，8，16，32和64 μg/mL。各血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液按1.3.2節(jié)方法處理，取上清液50 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖和峰面積。以土霉素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程。用空白對(duì)照血漿制成低質(zhì)量濃度的藥物樣品，經(jīng)處理后測(cè)定，以引起3倍基線噪音(S/N=3)的藥物質(zhì)量濃度為最低檢測(cè)限。

1.3.4 精密度和回收率試驗(yàn) 將土霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液加入空白對(duì)照血漿中,制得土霉素質(zhì)量濃度分別為1，8和32 μg/mL的高、中、低3個(gè)血樣，按照 1.3.2 節(jié)方法處理后進(jìn)行HPLC測(cè)定，記錄色譜圖和峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算土霉素質(zhì)量濃度，進(jìn)行日內(nèi)和日間精密度(RSD)試驗(yàn)。同法制備土霉素高、中、低質(zhì)量濃度樣品，不同質(zhì)量濃度做5個(gè)重復(fù),以標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得量與土霉素加入量的比值計(jì)算回收率。另外取數(shù)份家兔空白對(duì)照血漿，每份400 μL，分別精密加入1，8和32 μg/mL 3種質(zhì)量濃度的土霉素標(biāo)準(zhǔn)液，按照 1.3.2 節(jié)方法處理后進(jìn)行HPLC分析，并與生理鹽水稀釋的高、中、低樣品的峰面積進(jìn)行比較，計(jì)算提取回收率。

1.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 同法配制低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的土霉素血漿樣品各1份，按照1.3.2節(jié)方法處理后，分別于0，3，6和9 h進(jìn)行HPLC分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算土霉素質(zhì)量濃度，考察土霉素的穩(wěn)定性。

1.4 血漿樣品中土霉素質(zhì)量濃度的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[9]處理血漿樣品。取出冷凍保存的血漿樣品，室溫下自然解凍，準(zhǔn)確吸取500 μL血漿樣品于2.0 mL的EP管中，然后按照1.3.2節(jié)方法處理后進(jìn)行HPLC分析，記錄色譜圖和峰面積進(jìn)行定量分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出血樣中土霉素的質(zhì)量濃度。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DAS3.1.0藥動(dòng)學(xué)軟件進(jìn)行處理，根據(jù)非房室模型的統(tǒng)計(jì)矩計(jì)算藥物腹腔注射后的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)[10]。根據(jù)測(cè)得的血藥濃度和計(jì)算的相關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，用SPSS 17.0單因素ANOVA法分析各藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 家兔血漿中土霉素HPLC測(cè)定方法的建立

在本試驗(yàn)條件下，家兔空白對(duì)照血漿、加有土霉素的空白對(duì)照血漿樣品、家兔腹腔注射土霉素注射液和土霉素固體脂質(zhì)納米粒后血漿樣品的HPLC結(jié)果見圖1和圖2。由圖2可知，土霉素保留時(shí)間為13 min左右，血漿峰與土霉素峰分離完全，血漿內(nèi)源性雜質(zhì)對(duì)土霉素含量的測(cè)定無(wú)干擾。以土霉素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行回歸分析，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=61 142.1x-3 051.4，R2=0.998 8，說明在土霉素質(zhì)量濃度為0.5～64 μg/mL時(shí)，土霉素質(zhì)量濃度與峰面積線性關(guān)系良好。血漿中土霉素的最低檢測(cè)限為0.15 μg/mL。

圖 1 家兔空白對(duì)照血漿的HPLC色譜圖

圖 2 家兔血漿中土霉素的HPLC色譜圖

精密度試驗(yàn)、回收率試驗(yàn)和樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見表1。由表1可知，日內(nèi)、日間精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，回收率均在80%～120%，表明該檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度、精密度較高，血漿樣品在9 h內(nèi)穩(wěn)定，重現(xiàn)性較好，可滿足生物樣品中土霉素測(cè)定的要求。

表 1 家兔血漿土霉素質(zhì)量濃度HPLC檢測(cè)方法的精密度、回收率和血漿樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

2.2 血藥質(zhì)量濃度測(cè)定結(jié)果及藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

家兔腹腔注射土霉素注射液和土霉素固體脂質(zhì)納米粒后，2組家兔的血藥質(zhì)量濃度見表2。根據(jù)2組試驗(yàn)所得家兔血藥質(zhì)量濃度數(shù)據(jù)，用DAS3.1.0進(jìn)行智能化分析，以非房室模型的統(tǒng)計(jì)矩計(jì)算腹腔注射土霉素的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表3。由表3可以看出，家兔腹腔注射土霉素注射液和土霉素固體脂質(zhì)納米粒后，表觀分布容積(V1/F)分別為(9.581±0.301)和(3.676±0.258) L，土霉素固體脂質(zhì)納米粒表觀分布容積更低，反映了血漿藥物質(zhì)量濃度更高，因而土霉素制成納米粒后促進(jìn)了藥物的吸收。測(cè)得血漿中土霉素吸收半衰期(T1/2Ka)分別為(18.570±0.851)和(27.871±1.767) h，說明土霉素固體脂質(zhì)納米粒具有明顯的緩釋效應(yīng)，吸收半衰期更長(zhǎng)；血藥質(zhì)量濃度達(dá)峰時(shí)間(Tmax)分別為1和4 h，達(dá)峰質(zhì)量濃度(Cmax)分別為(3.676±0.376)和(3.699±0.562) mg/L，平均滯留時(shí)間(MRT(0-t))分別為(17.245±0.289)和(35.750±1.376) h。二者達(dá)峰質(zhì)量濃度差異不大，但固體脂質(zhì)納米粒的半衰期(T1/2)更長(zhǎng)，清除率(CL/F)也更低，因而平均滯留時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P<0.05)，這對(duì)于時(shí)間依賴性的抗生素土霉素發(fā)揮其抗菌作用具有重要價(jià)值。藥時(shí)曲線下面積(AUC(0-t))分別為(60.766±2.974)和(153.563±8.390) mg/(L·h)；AUC(0-∞)分別為(83.955±3.720)和(170.15± 10.403) mg/(L·h)。由此說明，土霉素制成固體脂質(zhì)納米粒后，其生物利用度也得到了顯著提高(P<0.01)。

表 2 土霉素注射液和土霉素固體脂質(zhì)納米粒在家兔體內(nèi)血藥質(zhì)量濃度的比較(n=5)

3 討 論

固體脂質(zhì)納米粒近年來(lái)備受藥劑學(xué)研究者的關(guān)注，其緩釋、靶向、穩(wěn)定的藥劑學(xué)性質(zhì)使其應(yīng)用越來(lái)越廣泛，而且其使用的載體材料單硬脂酸甘油酯性質(zhì)穩(wěn)定，體內(nèi)降解途徑固定，生物相容性好，細(xì)胞毒性低，可克服乳劑和脂質(zhì)體的不穩(wěn)定問題。近年來(lái),多種藥物的固體脂質(zhì)納米粒相繼被報(bào)道，如氯諾昔康[11]、齊墩果酸[12]、胰島素[13]等，分別起到了緩釋、靶向、穩(wěn)定的作用。本研究利用單硬脂酸甘油脂制備了土霉素的固體脂質(zhì)納米粒，也起到了緩釋長(zhǎng)效的作用，達(dá)到了預(yù)期的研究目的，說明固體脂質(zhì)納米粒也是一種很有前景的獸醫(yī)藥物新劑型。

文獻(xiàn)[14]報(bào)道采用四氫呋喃-0.025 mol/mL草酸(V(四氫呋喃)∶V(草酸)=15∶500)、0.2 mol/mL 草酸(pH 6.88)-乙腈(V(草酸)∶V(乙腈)=20∶80)、0. 01 mol/ L 磷酸二氫鈉溶液-乙腈(V(磷酸二氫鈉溶液)∶V(乙腈)=75∶25) 等作為流動(dòng)相測(cè)定血漿中土霉素的質(zhì)量濃度，但經(jīng)預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，上述流動(dòng)相條件并不適應(yīng)本實(shí)驗(yàn)室的HPLC系統(tǒng)，主要表現(xiàn)為土霉素出峰時(shí)間延后，峰形不規(guī)則以及拖尾等。最后經(jīng)過多次預(yù)試驗(yàn)篩選得到的色譜條件，土霉素出峰時(shí)間較合理，峰形良好，明顯與蛋白峰分離，也不受其他雜質(zhì)干擾，靈敏度高。在處理血漿樣品時(shí)，曾對(duì)比甲醇和體積分?jǐn)?shù)20%高氯酸不同比例混合后沉淀血漿蛋白的效果，結(jié)果表明，甲醇和體積分?jǐn)?shù)20%高氯酸以體積比4∶1混合后沉淀蛋白的效果比較理想。本研究所建立的HPLC方法專屬性強(qiáng)，精密度、方法回收率及提取回收率均符合生物供試品分析的要求。

本試驗(yàn)應(yīng)用統(tǒng)計(jì)矩分析方法對(duì)2種土霉素制劑的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行了求算，這是根據(jù)藥物體內(nèi)過程的隨機(jī)變量總體效應(yīng)考慮的。當(dāng)一定量的藥物進(jìn)入體內(nèi)后，具有相同化學(xué)結(jié)構(gòu)的各個(gè)藥物分子在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)是一個(gè)隨機(jī)過程，存在一定概率。因此不需要對(duì)藥物設(shè)定專門的隔室，也不需要考慮藥物的房室模型特征，是一種對(duì)藥物在體內(nèi)吸收、分布、代謝及排泄過程的研究方法。在給藥方式上，本研究最初擬以肌肉注射或者靜脈注射來(lái)考察土霉素納米粒的藥代動(dòng)力學(xué)特征，但按照本研究制備的固體脂質(zhì)納米粒的載藥量來(lái)?yè)Q算劑量，給藥體積太大，因而選擇了給藥方便而且吸收也較快的腹腔注射來(lái)進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果證明，土霉素制成納米粒后進(jìn)行家兔腹腔注射，盡管開始吸收速率較慢，但其AUC、MRT均明顯提高。研究表明，固體粒子攝取的主要途徑是細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)及淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)，其中以淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)的速度最快，轉(zhuǎn)運(yùn)的前提是藥物直接接觸或粘附在黏膜表面。本課題組以單硬脂酸甘油酯為載體制備的納米粒平均粒徑在100～350 nm，比表面積大，從而增加了納米粒與腹腔系膜的接觸面積，提高了腹腔系膜對(duì)粒子的攝取量。同時(shí)，本課題組制備的納米粒中用到了輔助乳化劑卵磷脂，其可促進(jìn)脂質(zhì)載體的淋巴吸收[15]，這在一定程度上增加了納米粒對(duì)腹腔黏膜的滲透性及生物粘附作用，使藥物的滯留時(shí)間延長(zhǎng)，從而提高了粒子的攝取量，增加了藥物的生物利用度，增強(qiáng)了療效。

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